本發(fā)明涉及單核苷多態(tài)性rs1800796位點在檢測ATDH易感性中的應用。

背景技術(shù)：

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是當今全球關(guān)注的三大傳染病之一，為全球公共衛(wèi)生日益嚴峻的挑戰(zhàn)和負擔。我國結(jié)核病患者數(shù)量居世界第二位，兒童是結(jié)核病易感人群。

由異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RMP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)等一線抗結(jié)核藥物引起的藥物性肝毒性反應(antituberculosis drug-induced hepatotoxicity，ATDH)是部分結(jié)核病患兒抗結(jié)核治療中斷以及失敗的重要原因。因此，進行ATDH遺傳易感性研究，對于調(diào)整用藥方案，消除結(jié)核病、降低死亡率、保障人民健康以及推動首都經(jīng)濟、衛(wèi)生事業(yè)健康持續(xù)發(fā)展有重要科學價值和社會效益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供單核苷多態(tài)性rs1800796位點在檢測ATDH易感性中的應用。

本發(fā)明首先保護用于檢測rs1800796SNP位點的核苷酸的物質(zhì)在制備產(chǎn)品中的應用；所述產(chǎn)品的功能為評價或輔助評價待測者患藥物性肝毒性反應的風險性。

所述待測者為結(jié)核患者。所述結(jié)核患者具體可為肺結(jié)核患者、結(jié)核性腦膜炎患者、血行播散型結(jié)核患者、腹腔結(jié)核患者、淋巴結(jié)結(jié)核患者或其他結(jié)核患者。

所述待測者具體可為兒童。所述兒童具體可為小于17歲的兒童。所述兒童具體可為漢族兒童。

所述用于檢測rs1800796SNP位點的核苷酸的物質(zhì)具體可為由引物F1和引物R1組成的特異引物對。

G等位基因為風險基因。攜帶G等位基因的待測者患藥物性肝毒性反應的風險性高于不攜帶G等位基因的待測者。GG基因型的待測者或CG基因型的待測者患藥物性肝毒性反應的風險性高于CC基因型的待測者。

本發(fā)明還保護一種產(chǎn)品，含有用于檢測rs1800796SNP位點的核苷酸的物質(zhì)；所述產(chǎn)品的功能為評價或輔助評價待測者患藥物性肝毒性反應的風險性。

所述待測者為結(jié)核患者。所述結(jié)核患者具體可為肺結(jié)核患者、結(jié)核性腦膜炎患者、血行播散型結(jié)核患者、腹腔結(jié)核患者、淋巴結(jié)結(jié)核患者或其他結(jié)核患者。

所述待測者具體可為兒童。所述兒童具體可為小于17歲的兒童。所述兒童具體可為漢族兒童。

所述用于檢測rs1800796SNP位點的核苷酸的物質(zhì)具體可為由引物F1和引物R1組成的特異引物對。

所述產(chǎn)品還可包括記載有如下判斷標準(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)的載體：

(Ⅰ)G等位基因為風險基因；

(Ⅱ)攜帶G等位基因的待測者患藥物性肝毒性反應的風險性高于不攜帶G等位基因的待測者；

(Ⅲ)GG基因型的待測者或CG基因型的待測者患藥物性肝毒性反應的風險性高于CC基因型的待測者。

本發(fā)明還保護由引物F1和引物R1組成的特異引物對。

本發(fā)明還保護所述特異引物對在制備用于評價或輔助評價待測者患藥物性肝毒性反應的風險性的產(chǎn)品中的應用。

所述待測者為結(jié)核患者。所述結(jié)核患者具體可為肺結(jié)核患者、結(jié)核性腦膜炎患者、血行播散型結(jié)核患者、腹腔結(jié)核患者、淋巴結(jié)結(jié)核患者或其他結(jié)核患者。

所述待測者具體可為兒童。所述兒童具體可為小于17歲的兒童。所述兒童具體可為漢族兒童。

G等位基因為風險基因。攜帶G等位基因的待測者患藥物性肝毒性反應的風險性高于不攜帶G等位基因的待測者。GG基因型的待測者或CG基因型的待測者患藥物性肝毒性反應的風險性高于CC基因型的待測者。

本發(fā)明還保護一種用于評價或輔助評價待測者患藥物性肝毒性反應的風險性的產(chǎn)品，含有所述特異引物對。

所述待測者為結(jié)核患者。所述結(jié)核患者具體可為肺結(jié)核患者、結(jié)核性腦膜炎患者、血行播散型結(jié)核患者、腹腔結(jié)核患者、淋巴結(jié)結(jié)核患者或其他結(jié)核患者。

所述待測者具體可為兒童。所述兒童具體可為小于17歲的兒童。所述兒童具體可為漢族兒童。

所述用于檢測rs1800796SNP位點的核苷酸的物質(zhì)具體可為由引物F1和引物R1組成的特異引物對。

所述產(chǎn)品還可包括記載有如下判斷標準(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)的載體：

(Ⅰ)G等位基因為風險基因；

(Ⅱ)攜帶G等位基因的待測者患藥物性肝毒性反應的風險性高于不攜帶G等位基因的待測者；

(Ⅲ)GG基因型的待測者或CG基因型的待測者患藥物性肝毒性反應的風險性高于CC基因型的待測者。

本發(fā)明還保護rs1800796SNP位點作為標志物在開發(fā)或設計或制備評價或輔助評價待測者患藥物性肝毒性反應風險性的產(chǎn)品中的應用。

以上任一所述rs1800796SNP位點為如下(a1)或(a2)：

(a1)人基因組DNA中序列3所示核苷酸的第134位；

(a2)以待測人的基因組DNA為模板，采用特異引物對擴增得到的擴增產(chǎn)物的自5’末端第134位核苷酸；所述特異引物對由引物F1和引物R1組成。

所述引物F1為如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物R1為如下(b3)或(b4)：

(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(b4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的DNA分子。

本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了rs1800796SNP位點并將該位點與多種疾病進行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)rs1800796SNP位點的G等位基因為結(jié)核病患兒抗結(jié)核藥物治療過程中ATDH發(fā)生的風險因素，rs1800796SNP的多態(tài)性與ATDH具有很高的相關(guān)性。因此，通過檢測該位點的核苷酸種類，判斷該位點的基因型可用于檢測抗結(jié)核治療后ATDH易感性或患有ATDH的風險，基因型為GG的個體與CC個體相比，更容易發(fā)生ATDH或發(fā)生ATDH風險高。本發(fā)明所提供的應用和產(chǎn)品在診斷并治療結(jié)核病，從而在合理預防結(jié)核病方面具有重要意義和價值。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。ULN代表正常值上限(upper limits of normal)。

研究對象：2005-2014年在首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院住院治療的結(jié)核病患兒230例(均是在患兒和家長知情同意的前提下)。230例患兒中，肺結(jié)核患兒123例，結(jié)核性腦膜炎患兒40例，血行播散型結(jié)核患兒47例，腹腔結(jié)核患兒14例，淋巴結(jié)結(jié)核患兒4例，其他結(jié)核患兒2例。230例研究對象的年齡范圍是0.17-16.42歲，中位數(shù)是5.38歲，四分位數(shù)是1.60歲，四分之三位數(shù)是10.00歲。230例研究對象均為中國漢族兒童。

結(jié)核病患兒的納入標準：①臨床診斷為結(jié)核??；②以標準化療劑量及方案接受抗結(jié)核化療時間超過2周；③中國，漢族，年齡在0-16歲間；④基礎(chǔ)肝腎功能正常。滿足①至④四項者即可納入結(jié)核病患兒。

結(jié)核病診斷標準：根據(jù)美國胸科協(xié)會制定的《成人和兒童結(jié)核病診斷和分級標準》和中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組制定的《兒童肺結(jié)核的臨床診斷標準和治療方案(試行)》進行結(jié)核病診斷。結(jié)核病臨床診斷標準具體如下：①活動性結(jié)核病接觸史；②PPD試驗陽性；③抗結(jié)核治療有效；④排除其他疾??；滿足①至④中的任意2項，并具有典型臨床癥狀和影像學證據(jù)，臨床診斷為結(jié)核病。

ATDH判斷標準：滿足以下4項中任意1項即可診斷為ATDH：

①血清ALT含量>(2×ULN)；ALT代表丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；血清ALT相應的ULN＝40IU/L；

②血清DBil含量>(2×ULN)；DBil代表直接膽紅素；血清DBil相應的ULN＝6.8μmol/L；

③血清AST含量、血清ALP含量和血清Tbil含量均>(1×ULN)，且其中n1項>(2×ULN)，n1≥1；AST代表天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，ALP代表堿性磷酸酶，Tbil代表總膽紅素；血清AST相應的ULN＝40IU/L，血清ALP相應的ULN＝220IU/L，血清Tbil相應的ULN＝19.0μmol/L；

④滿足標準a和標準b；

標準a：血清ALT含量、血清DBil含量、血清AST含量、血清ALP含量和血清Tbil含量，上述5項中的n2項>(1×ULN)，n2≥1；血清ALT相應的ULN＝40IU/L，血清DBil相應的ULN＝6.8μmol/L，血清AST相應的ULN＝40IU/L，血清ALP相應的ULN＝220IU/L，血清Tbil相應的ULN＝19.0μmol/L；

標準b：具有如下任意一種或多種肝毒性疑似癥狀：皮膚鞏膜黃染、肝區(qū)不適、惡心、嘔吐、厭食、發(fā)熱、皮疹、瘙癢等肝毒性疑似癥狀。

ATDH入組標準：①ATDH發(fā)生在抗結(jié)核化療開始后；②排除外病毒感染、新生兒黃疸、肝腎基礎(chǔ)疾病及其他疾病引起的ATDH；③抗結(jié)核化療藥物減量或停用后，ATDH癥狀減輕；④排除其他藥物致ATDH的可能性。滿足①至④四項者即可診斷為ATDH。

對照組入組標準：抗結(jié)核化療后，肝功能仍正常者。

基于上述標準，將230例結(jié)核病患兒分成ATDH組和對照組，ATDH組41例，對照組189例。

實施例1、rs1800796的單核苷酸多態(tài)性與兒童ATDH相關(guān)(病例-對照分析)

一、鑒定各個研究對象基于各個SNP位點的基因型

各個研究對象分別進行如下操作：

1、抽取外周靜脈血，提取基因組DNA。

2、檢測研究對象基于rs1800796SNP位點的基因型，具體步驟如下：

(1)以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用F1和R1組成的引物對進行PCR擴增。

F1(上游引物；序列1)：5’-CTAAGTGGGCTGAAGCAGGTGAA-3’；

R1(下游引物；序列2)：5’-CAAGCCTGGGATTATGAAGAAGG-3’。

PCR擴增的反應體系的組成如下(50μl)：基因組DNA 0.50ng、上游引物30pmol、下游引物30pmol、2×TaqPlantinum PCR MasterMix25μl和去離子水。2×TaqPlantinum PCR MasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司，貨號KT204。

PCR擴增的反應條件：94℃變性3min；94℃30s、57℃30s、72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

(2)將步驟(1)PCR擴增產(chǎn)物進行測序。

rs1800796SNP位點為人基因組DNA中序列3所示核苷酸的第134位，為C/G多態(tài)。各個研究對象的PCR擴增產(chǎn)物均如序列表的序列3所示。基于rs1800796SNP位點，研究對象的基因型為CC基因型、GG基因型或CG基因型。

3、檢測研究對象基于rs10242595SNP位點的基因型，具體步驟如下：

(1)以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用F2和R2組成的引物對進行PCR擴增。

F2(上游引物；序列4)：5’-GAGTGGTGCGTGGTGTAGGGTCT-3’；

R2(下游引物；序列5)：5’-CCTCTGGCAATGTATGCTTATCT-3’。

PCR擴增的反應體系和PCR擴增的反應條件同步驟2的(1)。

(2)將步驟(1)PCR擴增產(chǎn)物進行測序。

rs10242595SNP位點為人基因組DNA中序列6所示核苷酸的第137位，為A/G多態(tài)。各個研究對象的PCR擴增產(chǎn)物均如序列表的序列6所示?；趓s10242595SNP位點，研究對象的基因型為AA基因型、GG基因型或AG基因型。

4、檢測研究對象基于rs12531874SNP位點的基因型，具體步驟如下：

(1)以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用F3和R3組成的引物對進行PCR擴增。

F3(上游引物；序列7)：5’-ATTTCCTCTGTACCTTAGGCTTTT-3’；

R3(下游引物；序列8)：5’-TGTGGGCTCCTGTAACATTTCTT-3’。

PCR擴增的反應體系和PCR擴增的反應條件同步驟2的(1)。

(2)將步驟(1)PCR擴增產(chǎn)物進行測序。

rs12531874SNP位點為人基因組DNA中序列9所示核苷酸的第193位，為G/A多態(tài)。各個研究對象的PCR擴增產(chǎn)物均如序列表的序列9所示?；趓s12531874SNP位點，研究對象的基因型為GG基因型、AA基因型或GA基因型。

二、與ATDH的相關(guān)性分析

使用在線Shesis軟件(http://analysis.bio-x.cn/SHEsisMain.htm)對各個SNP位點進行等位基因頻率和基因型頻率的統(tǒng)計、哈溫平衡(HWE)遺傳學分析、針對等位基因和基因型分別進行ATDH組和對照組的卡方檢測和odds ratio(優(yōu)勢比)的計算，上述3個SNP位點中，rs1800796SNP位點為與ATDH顯著相關(guān)的SNP位點,rs10242595SNP位點和rs12531874SNP位點為與ATDH不相關(guān)的SNP。ATDH組患兒rs1800796SNP位點的G等位基因所占比例相對對照組患兒顯著增加(46.3％vs.26.5％,P＝1.86×10^-3)，即rs1800796SNP位點的G等位基因為兒童ATDH易感的風險因素。

ATDH組和對照組中，基于上述3個SNP位點的等位基因頻率結(jié)果和相關(guān)性分析結(jié)果見表1。人為二倍體，因此等位基因數(shù)量為患兒數(shù)量的2倍。

表1

OR(95％CI)表示odds ratio(95％的置信區(qū)間)；

^aP值由哈溫平衡(HWE)分析獲得，當P值﹤0.05時，提示納入研究人群存在偏倚。

^bP值由表示統(tǒng)計學意義，經(jīng)過Bonferroni矯正，當P﹤0.05表示比較的樣本有顯著差異。

ATDH組和對照組中，基于上述3個SNP位點的基因型患者的個數(shù)和頻率見表2。

表2