本發(fā)明涉及一種紅鰭東方鲀苗種篩選引物及方法，尤其是一種可節(jié)省人力物力、降低選種成本、確保子代性狀良好的篩選紅鰭東方鲀苗種的SNP引物及篩選方法。

背景技術：

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）是我國北方沿海重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類。

傳統(tǒng)的魚類苗種選育方法是表型選擇法，即選擇體重、體長及體全長等生長性狀良好的紅鰭東方鲀?yōu)橛H本，需要定期檢測，逐級篩選，不僅耗費大量的人力物力，周期長、效率低，而且還會存在所選親本遺傳基因并不優(yōu)良的問題。

分子標記輔助育種是快速獲得理想家系、品系或品種的現(xiàn)代生物育種的最理想的方法之一。單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指基因組DNA上由單個核苷酸突變所引起的DNA序列多態(tài)性，通過確定SNP及基因型分型進行選種是成熟的分子生物技術。該技術已在畜禽育種及生產(chǎn)中得到了廣泛的應用，但在水產(chǎn)動物育種和養(yǎng)殖中才剛剛涉及。與傳統(tǒng)育種方法相比，分子標記輔助育種提高了選育效率。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術所存在的上述技術問題，提供一種可節(jié)省人力物力、降低選種成本、確保子代性狀良好的篩選紅鰭東方鲀苗種的SNP引物及篩選方法。

本發(fā)明的技術解決方案是：一種篩選紅鰭東方鲀苗種的SNP引物，其特征在于所述SNP引物DNA序列如下：

上游引物F：5′-aactcaagtcgaggcaatgc-3′；

下游引物R：5′-tccgaatagatgaccgatgc-3′。

一種以上述SNP引物篩選紅鰭東方鲀苗種的方法，其特征在于按照如下步驟進行：

a. 提取待測紅鰭東方鲀的基因組DNA；

b. 用所得到的基因組DNA為模板，以所述上游引物和下游引物進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物；

c. 對所得到的PCR產(chǎn)物進行測序、基因分型，篩選出具有如下DNA序列且自5′端起第145位點基因型為純合TT的紅鰭東方鲀：

aactcaagtcgaggcaatgcgggtggcagaaattacagaatgtaggcgaggagcgaatggacaaatgcccagcgacttgagaggagagaagggagtggccttacctggtacccctgtggaatggttcactgtaaaacaaaaggcnaacaatgccccgaaaagctcttcacaatgattgaaacaggagagctacctattgtttaagcgtttgatgagggatcttgttattattttatacactgcaccattccatactgggaggaattctttgttaatgcaatgtaaaagactagcttagctgctgagacacaaacaagagcttaatgtcacctccatatgggggggctgcagcagggggctccaggtgggacaaatccatctgggttgtagccaatcagagagctgcaagctggctttgcaaactaatggtccaccttgttccttgaggtttgtggaggtatcagccctttgaccccgagtggagtcattatgctccttcgctaggacaggatgttctgtcagaagtcgcgcataacagtaaaaattaactcgtttttatgctttatatccccttcattgactgagtgcagcatcggtcatctattcgga。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了紅鰭東方鲀與體重、體長及體全長相關的SNP遺傳標記并設計出相關引物，能夠快速、高效、準確的檢測紅鰭東方鲀的生長性狀，確定紅鰭東方鲀中屬于生長速度快的個體，進而能夠有效用于紅鰭東方鲀的分子標記輔助育種。與現(xiàn)有技術相比，不但可節(jié)省人力物力、降低選種成本，而且可高準確性地選育紅鰭東方鲀優(yōu)良家系、品系或品種。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例SNP標記位點處TT、TA 和AA三種基因型的測序峰圖。

具體實施方式

1．與紅鰭東方鲀生長性狀相關的SNP標記的獲得

1.1 紅鰭東方鲀?nèi)后w的獲得

所采用的群體為大連某紅鰭東方鲀養(yǎng)殖場孵化的其中一個家系的紅鰭東方鲀，從該家系隨機選出300個個體，先對這300個個體進行體重、體長和體全長等生長性狀表型值進行測定和記錄，然后剪取100個魚體尾鰭鰭條于80%乙醇中，在-20℃冰箱中保存，用于基因組DNA的提取。

1.2 紅鰭東方鲀基因組DNA提取

采用常規(guī)酚仿法抽提紅鰭東方鲀鰭條中的基因組DNA，具體步驟如下：

（1）取紅鰭東方鲀尾鰭組織100~120mg于1.5毫升的離心管中，并用眼科剪盡量將其剪碎（粉末狀）；

（2）向已剪碎尾鰭的離心管中加入700μL DNA提取液；

（3）加蛋白酶K（20mg/ml） 5μL，輕輕混勻，放入55℃水浴中消化2~4小時；

（4）將溶液冷卻至室溫，加等體積苯酚，抽提10分鐘，12000rpm離心10分鐘；

（5）取上清加入一新的1.5ml離心管中，加等體積酚：仿抽提10分鐘，12000rpm離心10分鐘；

（6） 取上清加入一新的1.5ml離心管中，加等體積氯仿抽提10分鐘，12000rpm離心10分鐘；

（7）取上清加入一新的離心管中，加1/5體積3mol NaAc（PH5.2）和2倍體積無水乙醇，12000rpm離心5分鐘；

（8）棄掉乙醇溶液，用70%乙醇洗沉淀2次，5000rpm離心5分鐘；

（9）棄掉乙醇，室溫放置10-20分鐘，用100μL TE溶解沉淀DNA。

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA， DNA溶液于-4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 以類胰島素生長因子-1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1，GenBank：AB465576）基因為紅鰭東方鲀生長性狀的主效候選基因，采用對多個個體基因測序獲得紅鰭東方鲀生長性狀相關的SNP標記：

對上述的100個個體的基因組DNA進行測序，經(jīng)DNAMAN軟件分析發(fā)現(xiàn)存在一個SNP位點，該SNP位點位于SEQ ID NO.3所示序列的145位點處，在SEQ ID NO.3序列中用n表示該處位點，且此處位點的堿基為T或A，SNP標記位點處TT、TA 和AA三種基因型的測序峰圖如圖1所示。經(jīng)生物統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)這一SNP位點與紅鰭東方鲀的生長性狀緊密相關，該位點處基因型為純合TT的紅鰭東方鲀的體重、體長及體全長等生長性狀顯著高于此處基因型為純合AA或雜合TA的紅鰭東方鲀。

在SNP位點的兩側設計一對引物，對紅鰭東方鲀基因組DNA進行PCR擴增，其引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示。

2．以所得SNP引物篩選紅鰭東方鲀苗種

2.1 提取待測紅鰭東方鲀鰭條中的基因組DNA

待測紅鰭東方鲀來自上述紅鰭東方鲀?nèi)后w，隨機選取51尾魚，按照上述的DNA提取方法抽提基因組DNA；

2.2 以所得基因組DNA為模板進行PCR擴增

以提取獲得的各待測紅鰭東方鲀的基因組DNA為模板，利用所設計的上游引物（SEQ ID NO.1）和下游引物（SEQ ID NO.2）進行PCR擴增，得PCR產(chǎn)物（609bp）；

PCR反應體系為25μl，反應程序為：10pmol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2 所示的上下游引物各1μl，30-200ng/μl 的模板DNA 1μl， 10mmol/L 的dNTP mix 2.0μl，10×PCR 反應緩沖液2.5μl，5U/μl 的Taq DNA 聚合酶0.5μl，余量為雙蒸水；該PCR 擴增的反應條件為：94℃ 4 分鐘；94℃ 25 秒，58℃ 25 秒， 72℃ 30 秒，32個循環(huán)；72℃ 7分鐘。

c. 按照現(xiàn)有技術的方法（如ABI3730 測序儀）對所得到的PCR產(chǎn)物進行測序、基因分型，均具有SEQ ID NO.3所示DNA序列且自5′端起第145位點處的堿基為T或A，選出SNP位點處基因型為純合TT的紅鰭東方鲀?yōu)槊绶N。

51個待測紅鰭東方鲀個體該SNP位點的基因型及其生長性狀如表1所示。

表1

從表1可以看出SNP位點處基因型為純合TT的紅鰭東方鲀的體重、體長及體全長生長性狀高于此處基因型為純合AA或雜合TA的紅鰭東方鲀。

2.3 SNP位點基因型與紅鰭東方鲀體重、體長和體全長等生長性狀的關聯(lián)分析

基于表1的結果，利用SPSS18.0 軟件，對該SNP位點的基因型與生長性狀（體重、體長和體全長）分別進行最小二乘的統(tǒng)計分析，計算該SNP位點的基因型與生長性狀的關聯(lián)性。

采用的模型如下：

Y_ij = μ + G_i + e_ij

其中 Yij 表示i基因型的第j個個體的生長性狀測定值； μ 是測定值的均值； Gi 是基因型i的遺傳效應；eij 表示隨機誤差效應。

結果見表2。

表2

注：同列中字母相同為差異不顯著，相隔字母為差異極顯著（P＜0.01）

由表2可知，基因型為TT純合型個體的體重、體長和體全長等生長性狀高于TA雜合型個體的對應值，顯著高于AA純合型個體的生長性狀的表型值（P<0.01）。進而證明SEQ ID NO.3 所示核苷酸序列自5′端起第145位堿基T或A，與紅鰭東方鲀生長性狀顯著相關，為紅鰭東方鲀生長性狀相關的SNP標記，該SNP標記的TT基因型個體的生長性狀顯著高于AA和TA 基因型個體。

序列表

<110> 大連海洋大學

<120> 篩選紅鰭東方鲀苗種的SNP引物及篩選方法

<160> 3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物

<400> 1

aactcaagtcgaggcaatgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物

<400> 2

tccgaatagatgaccgatgc 20

<210> 3

<211> 609

<212> DNA

<213> 紅鰭東方鲀

<220>

<221> 與紅鰭東方鲀體重、體長和體全長相關的SNP分子標記

<222> （145）

<223> n=t或a

<400> 3

aactcaagtc gaggcaatgc gggtggcaga aattacagaa tgtaggcgag gagcgaatgg 60

acaaatgccc agcgacttga gaggagagaa gggagtggcc ttacctggta cccctgtgga 120

atggttcact gtaaaacaaa aggcnaacaa tgccccgaaa agctcttcac aatgattgaa 180

acaggagagc tacctattgt ttaagcgttt gatgagggat cttgttatta ttttatacac 240

tgcaccattc catactggga ggaattcttt gttaatgcaa tgtaaaagac tagcttagct 300

gctgagacac aaacaagagc ttaatgtcac ctccatatgg gggggctgca gcagggggct 360

ccaggtggga caaatccatc tgggttgtag ccaatcagag agctgcaagc tggctttgca 420

aactaatggt ccaccttgtt ccttgaggtt tgtggaggta tcagcccttt gaccccgagt 480

ggagtcatta tgctccttcg ctaggacagg atgttctgtc agaagtcgcg cataacagta 540

aaaattaact cgtttttatg ctttatatcc ccttcattga ctgagtgcag catcggtcat 600

ctattcgga 609