重組紅鰭東方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種重組紅鰭東方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，是對(duì)其成熟肽編碼區(qū)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，采用重疊PCR單向延伸方法獲得經(jīng)優(yōu)化的Defb-1蛋白成熟肽編碼序列，連入pET-32a(+)載體，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TransB（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中；通過(guò)IPTG誘導(dǎo)獲得重組蛋白的可溶性表達(dá)；利用重組蛋白含有的His標(biāo)簽，對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定和純化，可以快速高效獲得重組紅鰭東方鲀抗菌肽。不僅操作簡(jiǎn)單，降低制作成本，更主要的是蛋白結(jié)構(gòu)不受破壞，重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)，表達(dá)產(chǎn)物可用于制作飼料添加劑、產(chǎn)品保鮮劑和醫(yī)藥產(chǎn)品等。
【專利說(shuō)明】重組紅鰭東方鈍抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、重組蛋白純度好、得率高、適應(yīng)于工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)的重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紅鰭東方飩(/?濟(jì)/在我國(guó)主要分布于黃海、渤海和東海，是近海底層肉食性魚類，其肉味鮮美，具有很高的食用價(jià)值，在紅鰭東方飩的生殖腺和肝臟等內(nèi)臟中產(chǎn)生河豚毒素，其高活性和高特異性的生物特征具有潛在的醫(yī)藥開發(fā)價(jià)值，在臨床上具有廣闊的前景?？咕氖且活惥哂袣⒕志δ艿男》肿佣嚯?，紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌都有較好的抑菌殺菌功效，同時(shí)還會(huì)增強(qiáng)魚體的免疫反應(yīng)；而其本身又是一種魚源多肽，不會(huì)殘留，不會(huì)引發(fā)生態(tài)問(wèn)題。然而，從紅鰭東方飩中直接提取該蛋白的操作復(fù)雜、成本高、產(chǎn)量少，不能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、重組蛋白純度好、得率高、適應(yīng)于工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)的重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，其特征按如下步驟進(jìn)行:
a.以pET32a+載體為模板，用引物pETF19/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物pETF19/pETR19序列如下:`
PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，；
b.以a步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物76F20/pETR19進(jìn)行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ；
c.以b步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物50F21/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ；
d.以c步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模版，用引物25F21/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ；
e.以d步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物NcoIF/XhoIR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下:
上游引物 NcoIF:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；下游引物 XhoIR:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ；
f.電泳回收e步驟PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，再涂布于含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB固體平板上培養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，選擇120bp大小的條帶進(jìn)行回收；
g.用限制性內(nèi)切酶AfcoI和通ol分別雙酶切f步驟所回收產(chǎn)物的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α進(jìn)行培養(yǎng)并篩選提取重組表達(dá)質(zhì)粒；
h.將所提取的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株TransB(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，挑取單克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體；
1.將收集的菌體用pH8.0、0.5M Tris-HCl緩沖溶液重懸，進(jìn)行超聲波破碎，離心取上清，過(guò)N1-TNA柱純化，收集洗脫液；
j.將洗脫液透析，獲得重組表達(dá)蛋白。
[0005]所述a步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述b步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述c步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，59°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述d步驟的PCR反應(yīng)條件為`:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述e步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存。
[0006]本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白編碼序列的引物，對(duì)其成熟肽編碼區(qū)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，采用重疊PCR單向延伸方法獲得經(jīng)優(yōu)化的Defb-1蛋白成熟肽編碼序列，連入pET-32a(+)載體,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TransB (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中；通過(guò)IPTG誘導(dǎo)獲得重組蛋白的可溶性表達(dá)；利用重組蛋白含有的His標(biāo)簽，對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定和純化，可以快速高效獲得重組紅鰭東方飩抗菌肽。不僅操作簡(jiǎn)單，降低制作成本，更主要的是蛋白結(jié)構(gòu)不受破壞，重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)，表達(dá)產(chǎn)物可用于制作飼料添加劑、產(chǎn)品保鮮劑和醫(yī)藥產(chǎn)品等。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0007]圖1為本發(fā)明實(shí)施例的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0008]圖2為本發(fā)明實(shí)施例的重組表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE凝膠電泳圖及Western bloting鑒定結(jié)果。
[0009]圖3為本發(fā)明實(shí)施例純化后重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖。
[0010]圖4為本發(fā)明實(shí)施例重組蛋白的Elisa鑒定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0011]按如下步驟進(jìn)行:a.以pET32a+載體為模板，用引物pETF19/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物pETF19/pETR19序列如下:
PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，；
PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
b.以a步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物76F20/pETR19進(jìn)行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ；
PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
c.以b步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物50F21/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ；
PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，59°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
d.以c步驟反應(yīng)產(chǎn)物 的20倍稀釋液為模版，用引物25F21/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ；
PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
e.以d步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物AfcoI/ZAoI進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物AfcoI/lSoI序列如下:
上游引物Afco1:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；
下游引物IAo1:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ；
PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
a^e步驟PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示:圖1中1、2、3、4分別為a、b、
c、d步驟延伸PCR產(chǎn)物，5為e步驟擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，M為DL2000bp ；
f.電泳回收e步驟PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD19T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，再涂布于含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB固體平板上培養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，選擇120bp大小的條帶進(jìn)行回收；
按照現(xiàn)有技術(shù)方法，對(duì)所回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，其序列如下:ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTGC
與天然紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白成熟肽區(qū)域序列對(duì)比，可以看出:經(jīng)密碼子優(yōu)化的DNA序列中，第3號(hào)氨基酸Pro (CCC)替換為Pio (CCA)，第7號(hào)氨基酸Gly (GGA)替換為Gly (GGC)，第10號(hào)氨基酸Arg (AGA)替換為Arg (AGG)，第15號(hào)氨基酸Pro (CCC)替換為Pro (CCA)，第19號(hào)氨基酸Phe (TTC)替換為Phe (TTT)，第21和26號(hào)氨基酸Gly (GGA)替換為 Gly (GGG)，第 28 號(hào)氨基酸 Gly (GGA)替換為 Gly (GGC)；
g.用限制性內(nèi)切酶AfcoI和通ol分別雙酶切f步驟所回收產(chǎn)物的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷按摩爾比10:1比例混勻，用T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci進(jìn)行培養(yǎng)并挑選單克隆菌落，篩選用T7promoter/ T7 terminator primer通用引物菌檢結(jié)果為765bp的陽(yáng)性克隆,提取重組表達(dá)質(zhì)粒;
h.將所提取的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株TransB(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，接種于100ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm培養(yǎng)至菌液OD6tltl為
0.6時(shí)，向菌液中加入IPTG至總濃度為0.5mM，于4°C培養(yǎng)6h，4°C 6000rpm離心，富集菌體，棄上清，得菌體；
1.將收集的菌體用pH8.0、0.5M Tris-HCl緩沖溶液重懸，將重懸菌體于超聲波破碎(750W 9s/9s 4°C) 25min，將破碎產(chǎn)物于12000rpm 4°C離心20min，取上清。對(duì)上清夜進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和Western blotting鑒定(電泳步驟參見蛋白質(zhì)技術(shù)冊(cè)),結(jié)果如圖2所示=M為蛋白Maker，O為pET32a+載體轉(zhuǎn)化TransB (DE3)宿主菌誘導(dǎo)后結(jié)果，A為重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化TransB (DE3)宿主菌誘導(dǎo)后結(jié)果，NC膜為Western blotting鑒定結(jié)果；結(jié)果表明:重組表達(dá)載體表達(dá)框正確，表達(dá)產(chǎn)物為目的表達(dá)產(chǎn)物。
[0012]將上清液加入事先平衡好的N1-NTA柱子中過(guò)柱吸附，3倍柱體積Washing Buffer過(guò)柱洗漆，IOmL Elution Buffer過(guò)柱洗脫,收集洗脫液(具體步驟參見蛋白手冊(cè))；對(duì)洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示:M為蛋白Maker，I為純化后的重組蛋白；結(jié)果表明:純化結(jié)果為目的融合蛋白，且純度好，得率高； k.將收集的洗脫液充入透析袋中于緩沖液中，4°C透析過(guò)夜，收集透析產(chǎn)物。
[0013]對(duì)透析產(chǎn)物進(jìn)行Elasa檢測(cè)(具體步驟參見蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè))，以Ant1-Defensinbeta2抗體為一抗，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗的直接Elisa反應(yīng)；檢測(cè)結(jié)果如圖4所示:A、B、C、D、E 和 F 分別為 20/200，40/200，60/200，80/200，100/200 和 200/200 稀釋度重組蛋白樣品；G為1%小牛血清蛋白對(duì)照；注20/200為20 μ L重組蛋白樣品稀釋至200 μ L。結(jié)果表明=Elisa反應(yīng)OD492結(jié)果與重組蛋白樣品濃度呈正相關(guān)，結(jié)果表明:重組蛋白樣品構(gòu)象正確。
[0014]按現(xiàn)有技術(shù)對(duì)透析產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果為與天然重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白相同。
【權(quán)利要求】
1.一種重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，其特征按如下步驟進(jìn)行: a.以pET32a+載體為模板，用引物pETF19/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物pETF19/pETR19序列如下: PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，； b.以a步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物76F20/pETR19進(jìn)行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ； c.以b步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物50F21/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ； d.以c步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模版，用引物25F21/pETR19進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ； e.以d步驟反應(yīng)產(chǎn)物的20倍稀釋液為模板，用引物NcoIF/XhoIR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下:
上游引物 NcoIF:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；
下游引物 XhoIR:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ； f.電泳回收e步驟PCR產(chǎn)物與克隆載體PMD19T連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，再涂布于含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB固體平板上培養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，選擇120bp大小的條帶進(jìn)行回收； g.用限制性內(nèi)切酶AfcoI和通ol分別雙酶切f步驟所回收產(chǎn)物的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α進(jìn)行培養(yǎng)并篩選提取重組表達(dá)質(zhì)粒； h.將所提取的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株TransB(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，挑取單克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌體； 1.將收集的菌體用pH8.0、0.5M Tris-HCl緩沖溶液重懸，進(jìn)行超聲波破碎，離心取上清，過(guò)N1-TNA柱純化，收集洗脫液； j.將洗脫液透析，獲得重組表達(dá)蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，其特征在于: 所述a步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述b步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，58°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述c步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，59°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述d步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s、60°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72°C延伸7min，4°C保存；` 所述e步驟的PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C復(fù)性30s、72°C延伸20s，循環(huán)30次，72℃延伸7min，4℃保存。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103773772SQ201310689151
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】仇雪梅, 徐進(jìn), 王秀利, 姜志強(qiáng), 高長(zhǎng)富 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué)