一種馬面鲀魚皮抗氧化膠原肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種馬面鲀魚皮抗氧化膠原肽及用途，其特征在于：該抗氧化膠原肽氨基酸序列為Phe-Ile-Gly-Pro-Trp，ESI-MS檢測給出分子量為618.75Da（[M+H]+619.63Da）。制備方法包括馬面鲀魚皮預處理、酶解、超濾和層析等步驟。制備得到的高活性抗氧化膠原肽Phe-Ile-Gly-Pro-Trp對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Phe-Ile-Gly-Pro-Trp亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用。Phe-Ile-Gly-Pro-Trp具有顯著地抗氧化活性，可用作藥品、保健食品或食品添加劑。<u/>
【專利說明】一種馬面鈍魚皮抗氧化膠原肽及其制備方法和用途

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物活性肽及其制備方法和用途，尤其涉及一種馬面飩魚皮抗氧 化膠原肽及其制備方法和用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 馬面飩是我國的一種常見魚類。馬面飩皮較厚且硬，故捕撈后，若時間允許，即就 地扒皮，其肉入庫冷藏，待食用，其皮就地扔掉，造成資源的浪費和環(huán)境污染。目前，已有研 究利用馬面魚皮用于制革工業(yè)、制備膠原蛋白，以及分離純化精氨酸和脯氨酸。而以馬面飩 魚皮為原料，利用酶解技術(shù)進行膠原肽的開發(fā)，也將為馬面飩魚皮的高值化利用奠定基礎。
[0003] 但是， 申請人:發(fā)現(xiàn)，以馬面飩魚皮為原料，利用酶解技術(shù)制備馬面飩魚皮抗氧化膠 原肽的工藝研究處于空白階段，而以酶解產(chǎn)物為材料制備高活性魚肉抗氧化肽及其應用更 是未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀提供一種馬面飩魚皮 抗氧化膠原肽，該多肽抗氧化活性強，可有效清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用。
[0005] 本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種馬面飩魚皮抗氧化膠原肽的制備 方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種馬面飩魚皮抗氧化膠原肽的應用。
[0007] 本發(fā)明為解決上述第一個技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為：一種馬面飩魚皮抗氧 化膠原肽，其特征在于該抗氧化膠原肽的氨基酸序列為Phe-Ile-Gly-Pro-Trp (SEQ No 10:1)451-]\^檢測給出分子量為618.75〇3([]\1+!1]+619.63 0&)。
[0008] 本發(fā)明為解決上述第二個技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為：一種馬面飩魚皮抗氧化 膠原肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 魚皮預處理：將馬面飩魚皮絞碎，按照料液比1 g:3飛mL加異丙醇，于4°C下浸泡 4~8 h，每2 h換異丙醇一次，得脫脂魚皮；脫脂魚皮于35~40°C充分干燥后，按照料液比 1 g: 5?10 mL加入0.5 mol/L EDTA-2Na溶液（pH 7.4)，于4°C下浸泡3?5天，每天更換 1次EDTA-2Na溶液，得脫脂、脫鈣魚皮；脫脂、脫鈣魚皮35~40°C充分干燥后按照料液比1 g:15?20 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4°C下浸泡4?6 h，每2 h換NaOH溶液一次，得脫脂、 脫鈣和脫非膠原蛋白魚皮，于35~40°C充分干燥； 2) 酶解：將充分干燥的脫脂、脫鈣和脫非膠原蛋白馬面飩魚皮按照料液比1 g:8~12 mL 加入到緩沖液中，調(diào)pH值至9. (ΓΙΟ. 0,于45?55°C保溫1(T15 min，按照魚皮質(zhì)量的2?3% 加入蛋白酶，于45?55°C酶解4?6 h; 3) 抗氧化膠原肽的制備：將酶解液于沸水浴中滅活l(Tl5 min，1000(Tl2000 r/min離 心15~20 min，取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。
[0009] 作為優(yōu)選，所述步驟1)中的馬面飩為綠鰭馬面飩(yVarat/o/?
[0010] 作為優(yōu)選，所述步驟2)中的緩沖液為甘氨酸-NaOH緩沖液（0. 05 mol/L，pH 9. 6)。
[0011] 作為優(yōu)選，所述步驟2)中的蛋白酶為堿性蛋白酶，酶活力> 1.9X105 U/g。
[0012] 作為改進，所述步驟3)的超濾和層析的具體過程為： 超濾：將上清液調(diào)至pH 6. 5~7. 5,用截留分子量為5 kDa和1 kDa的超濾膜進行超濾 處理，收集分子量小于1 kDa組分，得超濾酶解物； 層析：將上述超濾酶解物用雙蒸水配成3(T50 mg/mL的溶液，經(jīng)過DEAE-52纖維素陰 離子交換樹脂分離，用雙蒸水、〇· 45?0· 55 mol/L和0· 9(Γ?· 10 mol/L NaCl溶液進行洗脫， 根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，自由基清除活性最高組分為離子交換層 析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成2(T30 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝 膠G-15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中， 自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成9(Γ100 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色譜（RP-HPLC)進行純化，根據(jù)抗氧化活性得1個高活性 抗氧化膠原肽 Phe-Ile-Gly-Pro-Trp。
[0013] 優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為：進樣量15?25 μ L ;色譜柱為Zorbax SB C-18 column (4.6 X 250 mm);柱溫為25?30 °C;流動相：A水(含0.1%三氟乙酸）和B乙腈；梯度洗脫： (Γ30 min乙腈濃度從0勻速升至50% ;洗脫速度1. 0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
[0014] 本發(fā)明為解決上述第三個技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為：一種馬面飩魚皮抗氧化 膠原肽的用途，其特征在于Phe-Ile-Gly-Pro-Trp對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離 子自由基具有良好的清除作用；同時，Phe-Ile-Gly-Pro-Trp亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化 抑制作用；Phe-Ile-Gly-Pro-Trp具有顯著的抗氧化活性，可用作藥品、保健食品或食品添 加劑。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明選用堿性蛋白酶作為酶解用酶，通過 生物酶解法同時融合超濾分級和色譜精制，制得的膠原肽具有顯著的抗氧化活性，且具有 易于消化吸收和安全無毒副作用等優(yōu)點，可用作藥品、保健食品或食品添加劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是本發(fā)明的馬面飩魚皮超濾分段組分（BSH-III)的陰離子交換樹脂DEAE-52 纖維素層析圖； 圖2是本發(fā)明的陰離子交換層析分離組分（BSH-III-4)的葡聚糖凝膠G-15層析圖； 圖3是本發(fā)明的葡聚糖凝膠G-15制備酶解物（Fr. 3)的RP-HPLC圖； 圖4是本發(fā)明的Phe-Ile-Gly-Pro-Trp的質(zhì)譜（ESI-MS)圖和結(jié)構(gòu)式； 圖5是本發(fā)明的Phe-Ile-Gly-Pro-Trp的脂質(zhì)過氧化抑制作用。

【具體實施方式】
[0017] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0018] 一種馬面飩魚皮抗氧化膠原肽的制備方法，制備工藝流程如下：馬面飩魚皮〃脫 鈣、脫脂、脫非膠原蛋白"酶解"超濾"離子交換層析"凝膠過濾層析"高效液相色譜制備 〃抗氧化膠原肽。
[0019] 實施例1 : 1)魚皮預處理：將綠鰭馬面飩魚皮絞碎，按照料液比1 g:5 mL加異丙醇，于4°C下浸泡 6 h，每2 h換異丙醇一次，得脫脂魚皮；脫脂魚皮40°C充分干燥后，按照料液比1 g:8 mL加 入0. 5 mol/L EDTA-2Na溶液（pH 7. 4)，于4°C下浸泡4天，每天更換1次EDTA-2Na溶液，得 脫脂、脫鈣魚皮；脫脂、脫鈣魚皮40°C充分干燥后按照料液比1 g:15 mL加0. 1 mol/L NaOH 溶液于4°C下浸泡6 h，每2 h換NaOH溶液一次，得脫脂、脫鈣和脫非膠原蛋白魚皮，40°C充 分干燥。
[0020] 2)酶解：將脫脂、脫鈣和脫非膠原蛋白馬面飩魚皮按照料液比1 g: 10 mL加入到 甘氨酸_似0!1緩沖液（0.05 111〇1/1、？!19.6)中，調(diào)？!1值至9.5，于501：保溫10 1^11，按照魚 皮質(zhì)量的2%加入堿性蛋白酶(酶活力彡1.9X105 U/g)，于50°C酶解5 h。
[0021] 3)抗氧化膠原肽的制備：將酶解液于沸水浴中滅活10 min，12000 r/min離心15 min，取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。
[0022] ①超濾：將酶解上清液調(diào)至pH 7. 0,采用截留分子量為5 kDa和1 kDa的超濾膜進 行超濾處理，根據(jù)自由基清除活性，收集分子量小于1 kDa部分，得超濾酶解物（BSH-III) (表 1); ② DEAE-52纖維素陰離子交換層析：將上述超濾酶解物（BSH-III)用雙蒸水配成50 mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分離，用雙蒸水、0.50 mol/L和1. 0 mol/L NaCl溶液 進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，自由基清除活性最高組分為離 子交換層析酶解物（BSH-III-4)(表1和圖1); ③ 凝膠層析：將上述離子交換層析酶解物（BSH-III-4)用雙蒸水配成25 mg/mL的溶 液，經(jīng)過葡聚糖凝膠G15柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集 洗脫組分，其中，自由基清除活性最高組分為凝膠層析酶解物（Fr. 3)(表1和圖2); ④ 高效液相色譜精制：將上述凝膠制備酶解物（Fr. 3)用雙蒸水配成100 μ g/mL的溶 液，利用反相高效液相色譜（RP-HPLC)進行純化(條件：進樣量20 μ L ;色譜柱為Zorbax SB C-18 (250 mm X 4.6 mm，5 μπι);柱溫為25°C;流動相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙 腈；梯度洗脫：0-30 min乙腈濃度從0勻速升至50% ;紫外檢測波長280 nm，根據(jù)自由基清 除活性得1個高活性抗氧化膠原肽(表1和圖3)。
[0023] ⑤結(jié)構(gòu)檢測：收集自由基清除活性最高的1個抗氧化肽，利用蛋白/多肽序列分析 儀測定氨基酸序列為Phe-Ile-Gly-Pr〇-Trp，ESI-MS檢測給出分子量為618. 75 Da ([M+H] + 619. 63 Da)(圖 4)。
[0024] 將上述制得的馬面飩魚皮抗氧化膠原肽Phe-Ile-Gly-Pro-Trp進行DPPH自由 基清除實驗、輕基自由基清除實驗、超氧陰尚子自由基清除實驗和脂質(zhì)過氧化抑制實驗。 實驗結(jié)果表明：Phe-Ile_Gly-Pr〇-Trp對DPPH自由基（EC 5Q 0.078 mg/mL)、輕基自由基 (EC5Q 0.064 mg/mL)和超氧陰離子自由基（EC5Q 0.228 mg/mL)具有良好的清除作用；同時， Phe-Ile-Gly-Pro-Trp亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用（圖5)。
[0025] 表1.馬面飩魚皮酶解物及其分段部位自由基清除活性（EC5(I為自由基清除率為 50%時樣品的濃度）

【權(quán)利要求】
1. 一種馬面飩魚皮抗氧化膠原肽，其特征在于該抗氧化膠原肽的氨基酸序列為 Phe-Ile-Gly-Pro-Trp，ESI-MS 檢測給出分子量為 618. 75 Da。
2. -種馬面飩魚皮抗氧化膠原肽制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 魚皮預處理：將馬面飩魚皮絞碎，按照料液比1 g: 3飛mL加異丙醇，于4°C下浸泡 4~8 h，每2 h換異丙醇一次，得脫脂魚皮；脫脂魚皮于35~40°C充分干燥后，按照料液比 1 g: 5?10 mL加入0.5 mol/L EDTA-2Na溶液（pH 7.4)，于4°C下浸泡3?5天，每天更換 1次EDTA-2Na溶液，得脫脂、脫鈣魚皮；脫脂、脫鈣魚皮35~40°C充分干燥后按照料液比1 g:15?20 mL加0.1 mol/L NaOH溶液于4°C下浸泡4?6 h，每2 h換NaOH溶液一次，得脫脂、 脫鈣和脫非膠原蛋白魚皮，于35~40°C充分干燥； 2) 酶解：將充分干燥的脫脂、脫鈣和脫非膠原蛋白馬面飩魚皮按照料液比1 g:8~12 mL 加入到緩沖液中，調(diào)pH值至9. (ΓΙΟ. 0,于45?55°C保溫1(T15 min，按照魚皮質(zhì)量的2?3% 加入蛋白酶，于45?55°C酶解4?6 h; 3) 抗氧化膠原肽的制備：將酶解液于沸水浴中滅活l(Tl5 min，1000(Tl2000 r/min離 心15~20 min，取上清液；上清液依次經(jīng)超濾和層析，得到抗氧化膠原肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的馬面飩為綠鰭馬面飩 iNavodon septentrionalis、。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的緩沖液為甘氨 酸-NaOH 緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中的蛋白酶為堿性蛋白 酶，酶活力彡1.9X105 U/g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的超濾和層析的具體過程 為： 超濾：將上清液調(diào)至pH 6. 5~7. 5,采用截留分子量為5 kDa和1 kDa的超濾膜進行超 濾處理，收集分子量小于1 kDa組分，得超濾酶解物； 層析：將上述超濾酶解物用雙蒸水配成3(T50 mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分 離，用雙蒸水、〇. 45?0. 55 mol/L和0. 9(Tl. 10 mol/L NaCl溶液進行洗脫，根據(jù)280 nm下 的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，自由基清除活性最高組分為離子交換層析酶解物；將 上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成2(T30 mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用雙 蒸水進行洗脫，根據(jù)280 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，自由基清除活性最高組 分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成9(Γ100 μ g/mL的溶液，利用 反相高效液相色譜（RP-HPLC)進行純化，根據(jù)自由基清除活性得1個高活性抗氧化膠原肽 Phe_Ile_Gly-Pr〇-Trp 〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述陰離子交換樹脂為DEAE-52纖 維素，所述凝膠為葡聚糖凝膠G-15 ;所述RP-HPLC條件為：進樣量15~20 μ L ;色譜柱為 Zorbax SB C-18 ;柱溫為25?30°C ;流動相：Α水(含0. 1%三氟乙酸）和Β乙腈；梯度洗脫： 0?30 min乙腈濃度從0勻速升至50% ;洗脫速度1. 0 mL/min ;紫外檢測波長280 nm。
8. -種馬面飩魚皮抗氧化膠原肽的用途，其特征在于：Phe-Ile-Gly-Pr 〇-Trp對DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用用于藥品、保健食品或食品 添加劑的用途；或者，Phe-Ile-Gly-Pro-Trp用于脂質(zhì)過氧化抑制劑的用途。
【文檔編號】C07K1/18GK104250286SQ201410368829
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月30日
【發(fā)明者】王斌, 王曉玲, 遲長鳳, 王玉梅 申請人:浙江海洋學院