本發(fā)明涉及的是基因工程和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種與2型糖尿病相關(guān)的血清或血漿miRNA標志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病是以持續(xù)高血糖為其基本生化特征的一種慢性全身性代謝性疾病，主要是由于體內(nèi)胰島素分泌絕對或相對不足，從而導(dǎo)致以糖代謝紊亂為主的糖、蛋白質(zhì)、脂肪代謝紊亂的一種綜合病癥。糖尿病主要分為1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他特殊類型的糖尿病。其中1型糖尿病主要由遺傳因素決定，占5％-10％；2型糖尿病是由于人體無法有效合成及分泌胰島素造成的，主要因體重過重和缺乏身體活動所致，占90％左右；我國糖尿病所占比例與國際相仿。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球糖尿病患者在1998年為1.2億，2025年預(yù)計將達3億；而根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計，2000年全球糖尿病患者為1.51億，而目前約2.85億，按現(xiàn)有增長速度，預(yù)計到2030年全球糖尿病患者將超過5億。值得注意的是，糖尿病已不僅僅是發(fā)達國家的“富貴病”，包括中國在內(nèi)的發(fā)展中國家也已成為糖尿病的重災(zāi)區(qū)。

中國糖尿病患病率逐年增加，1986年糖尿病患病率約為0.9％，1994年上升到2.5％，1996年糖尿病發(fā)生率為3.21％，2002年調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國糖尿病患者已超過2000多萬，而且還有同等數(shù)量的空腹血糖受損病人。2010年報告顯示中國成人糖尿病患病率為9.7％，其中男性10.5％，女性8.8％，男性略高于女性。20歲以上人群，隨年齡增長，患病率呈線性增長趨勢。年齡段調(diào)整后糖尿病前期患病率達15.5％，男性與女性的差異小于前者，城市與農(nóng)村地區(qū)的糖尿病患病率男性均高于女性。按照2006年城市和農(nóng)村20歲以上年齡人口占全部人口的比例，計算出城市的糖尿病人口，農(nóng)村的糖尿病人口，總體上糖尿病患病總數(shù)已經(jīng)達到9240萬。糖尿病前期的患病總數(shù)已經(jīng)達到了1.48億。2007到2008年城市人口糖尿病患病率，無論經(jīng)濟狀況如何，均在10.4％到12％區(qū)間浮動，而農(nóng)村地區(qū)則彼此存在明顯差異。而對于糖尿病前期，該差別已經(jīng)消失，無論經(jīng)濟水平如何，2007到2008年農(nóng)村地區(qū)糖尿病前期患病率均超過10％。隨著農(nóng)村地區(qū)居民生活水平提高和溫飽的解決，體力活動大幅度下降，其高血糖狀態(tài)已經(jīng)明顯在趕超城市居民的糖尿病前期水平。因此，我國糖尿病防治工作還存在巨大挑戰(zhàn)。

目前，我國糖尿病的診斷主要是通過糖耐量實驗。糖尿病診斷標準為，空腹血糖大于、等于7.0毫摩爾/升(mmol/l)，和/或飯后2小時大于等于11.1毫摩爾/升。有糖尿病癥狀者隨機血糖到達這個數(shù)據(jù)就可以確診。糖尿病最典型的臨床表現(xiàn)“三多一少”，“三多”指的是多飲、多食、多尿，“一少”指的是體重減，但是如果出現(xiàn)三多一少，糖尿病的程度已經(jīng)不輕了。大多數(shù)患者在早期沒有癥狀，但是血糖數(shù)值已經(jīng)達到糖尿病的診斷標準了。WHO也指出2型糖尿病癥狀可能與1型糖尿病相似，但往往癥狀不明顯。因此，可能在發(fā)病多年之后才診斷出患有糖尿病，而此時則已出現(xiàn)并發(fā)癥，對身體的各種組織特別是眼睛、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)引起長期損害。因此，發(fā)現(xiàn)一種明確而有效的生物標志，對預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)生具有重要意義，有助于2型糖尿病的早期診斷，早期干預(yù)，預(yù)防和控制糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。

microRNA(miRNAs)是一類重要的基因表達調(diào)控因子，長度大小在18-22個堿基的非編碼單鏈小分子RNA，它由一段具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體經(jīng)Drosha酶和Dicer酶剪切產(chǎn)生。通過與靶mRNA3’端非編碼區(qū)互補配對，使靶mRNA分子的翻譯受到抑制或引起特異性切割，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行負調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制，且成熟的miRNA在不同物種間進化上高度保守。miRNA不僅存在于各種組織和細胞中，還可以穩(wěn)定存在于循環(huán)血液中。作為21世紀生命科學(xué)研究重大發(fā)現(xiàn)之一，近年來已經(jīng)鑒定出了大量的miRNA，研究表明miRNA在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，并與多種人類疾病存在重要的關(guān)聯(lián)。

2型糖尿病是一種發(fā)病隱匿的慢性代謝疾病，主要以胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損為主要特點。研究發(fā)現(xiàn)miRNAs對胰島細胞的生長發(fā)育、分泌功能等均具有調(diào)控作用，而且miRNA的表達水平會隨著糖尿病病程的進展而發(fā)生變化。有研究發(fā)現(xiàn)，在血糖水平紊亂但未確診為糖尿病的時候，患者胰島β細胞中miR-148a-3p、miR-26a-5p、miR-7-5p、miR-127-3p和miR-375已出現(xiàn)高表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-375在胰腺組織中豐度極高，能夠調(diào)控HuD/Elavl4基因的表達，而HuD/Elavl4與胰島β細胞的生長和增殖有關(guān)，此外HuD/Elavl4同時可以調(diào)前胰島素原(Ins2)的翻譯和胰島素的產(chǎn)生。敲除小鼠胰腺胰島β細胞中miRNA-375的表達，HuD表達水平升高，從而導(dǎo)致β細胞中胰島素分泌減少。此外，miR-124a、miR-9、miR-96a和miR-33也能調(diào)節(jié)胰島素的釋放。

一直認為高糖毒性是導(dǎo)致糖尿病患者胰島β細胞受損的主要原因，用高糖處理MIN6胰島β細胞系可以上調(diào)miR-30d、miR-124a和miR-107的表達，同時miR-690、miR-296和miR-484表達下調(diào)。miR-30d過表達可以上調(diào)胰島素相關(guān)基因的表達，RNAi干擾抑制miR-30d表達后，由葡萄糖刺激誘導(dǎo)的胰島素基因停止轉(zhuǎn)錄[41]。另一個miRNA分子miR-124a跟胰島β細胞分化過程及胰島的發(fā)生密切相關(guān)，并有研究表明miR-124a過表達可以通過調(diào)控其靶基因FoxA2的表達減少葡萄糖刺激誘導(dǎo)的胰島素分泌，檢測發(fā)現(xiàn)Pdx-1、Kir62和Sur-1等多個與胰島素合成及分泌相關(guān)的特異性轉(zhuǎn)錄因子表達水平下調(diào)。miRNA的表達水平同時受軟脂酸鹽等因素的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)miR-34a和miR-146a在MIN6胰島β細胞系中的表達受軟脂酸鹽處理時間和濃度的影響，可以促進胰島細胞的凋亡[43]。miR-34a不僅能夠激活P53蛋白促進細胞凋亡，穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達miR-34a還可抑制囊泡蛋白2的表達，抑制胰島素的釋放；miR-34a和miR-146a表達抑制可減少高脂毒性誘導(dǎo)的β細胞凋亡。以上研究均表明，miRNA表達水平不僅受高糖、高脂等環(huán)境因素影響，而且可以從胰島素的從胰島素的轉(zhuǎn)錄、翻譯、分泌等多個方面影響胰島β細胞功能。

胰島素抵抗是2型糖尿病的另一基本特征，胰島素抵抗就是指各種原因使胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，機體代償性的分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定。胰島素的主要效應(yīng)器官是肝、骨骼肌和脂肪組織，當(dāng)這些器官對胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低時，即出現(xiàn)胰島素抵抗。目前已有多種miRNA被證實與胰島素抵抗相關(guān)。研究表明miRNA在胰島素的靶組織骨骼肌、肝臟和脂肪細胞中存在異常表達的情況，提示miRNA的表達與2型糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)。miRNA-802在2型糖尿病患者以及糖尿病小鼠肝細胞中表達上調(diào)，過表達miRNA-802可使血糖耐受不良、破壞胰島素受體通路和肝細胞糖原合成。

有研究發(fā)現(xiàn)，肥胖可以使2型糖尿病患者以及糖尿病小鼠肝細胞miRNA-802水平上調(diào)，致其靶基因肝細胞核因子1b基因沉默，因而導(dǎo)致了血糖耐受不良，破壞胰島素受體通路以及肝細胞合成糖原減少。正常情況下，miR-146a抑制PTPN1維持胰島素信號傳導(dǎo)通路的順暢，但減低miR-46a表達水平降低的情況下，PTPN1活性增強抑制胰島素信號通路，在2型糖尿病中發(fā)現(xiàn)了miR-146a的顯著下調(diào)。胰島素靶細胞細胞通路的最后一步就是將GLUT4運送到細胞膜上，而miR-320可通過阻斷PI3-K/Akt信號通路與miR-150共同使靶細胞GLUT4下調(diào)，試驗發(fā)現(xiàn)糖尿病患者miR-320發(fā)生了上調(diào)。IRS1可促進腫瘤細胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)由于IRS1是主要的胰島素受體底物酶，miR-144、miR-145可以靶向結(jié)合到IRS1的3'-UTR端，從而導(dǎo)致胰島素信號通路受阻，因而miR-145可以有效減少人肝癌細胞HepG2細胞血糖。在HepG2細胞內(nèi)胰島素的抵抗能夠促進p65的功能，而p65對于miRNA-145的促進因子具有抑制轉(zhuǎn)錄的作用。

生物標記物是隨著分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展而提出的一類細胞生物特異性標記。例如：來自凱斯西儲大學(xué)的研究人員鑒別出了miRNA-181a生物標記物，證實其有望用于預(yù)測一種常見的卵巢癌形式的治療反應(yīng)，改善患者的預(yù)后；另有研究人員鑒別出了與基底細胞樣乳腺癌密切相關(guān)的生物標記物START3，為開發(fā)出新的療法治療這種致命的癌癥提供了靶點，這些生物標記物的鑒定展現(xiàn)了潛在的臨床應(yīng)用價值。雖然腫瘤組織中的miRNA可以作為一種新的腫瘤標記物，但是腫瘤組織的miRNA就必需要進行手術(shù)或穿刺等才能獲得，所以組織miRNA不能滿足早期診斷需要，不能適用于廣泛的篩查和預(yù)防?；诖?，研究人員將目光投向了常規(guī)體檢就可以收集到的血液。2008年研究人員從血漿/血清中發(fā)現(xiàn)了大量穩(wěn)定的來源于組織/器官的miRNA，之后多項研究從血漿/血清中鑒別出了包括惡性腫瘤、心血管疾病、風(fēng)濕、阿茲海默癥等疾病的miRNA生物標記物，對疾病的預(yù)測、預(yù)后以及診斷都具有一定的臨床應(yīng)用價值。而且血清/血漿的檢測是無創(chuàng)的，非侵入的，因此其中的miRNA適用于普查和預(yù)防，為早期診斷服務(wù)。因此從血清/血漿中篩選到可以用于胰島素抵抗和2型糖尿病的早期標記物可以準確、敏感的評價早期、低水平的損害，提供早期預(yù)警，在很大程度上為臨床醫(yī)生制定早期預(yù)防、干預(yù)方案及判斷預(yù)后提供依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種與2型糖尿病相關(guān)的血清或血漿miRNA標志物。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述miRNA標志物的引物及探針。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了上述miRNA標志物及其引物或探針在制備2型糖尿病診斷試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供了一種2型糖尿病診斷試劑盒。

技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種與2型糖尿病相關(guān)的血清或血漿miRNA標志物，所述標志物為miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b、miRNA-148a中的一種或多種的組合。

上述的miRNA為：miRNA-486：UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG(SEQ ID NO.1)；miRNA-146b：UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU(SEQ ID NO.2)；miRNA-15b：UAGCAGCACA UCAUGGUUUACA(SEQ ID NO.3)；miRNA-148a：UCAGUGCACUACAGAACUUUGU(SEQ ID NO.4)。

所述標志物為miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a。

上述的與2型糖尿病相關(guān)的血清或血漿miRNA標志物的引物或探針。這些單獨的引物或探針可以通過商業(yè)渠道購買獲得，也可以在了解這些miRNA序列之后由技術(shù)人員自行設(shè)計合成，根據(jù)已知miRNA序列設(shè)計合成引物或探針的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。

上述miRNA-486的探針為：Assay ID：001278；miRNA-146b的探針為：Assay ID：001097；miRNA-15b的探針為Assay ID：000390；miRNA-148a的探針為Assay ID：000470。(上述探針Assay均購自美國ABI公司)。

上述的血清或血漿miRNA標志物在制備2型糖尿病診斷試劑盒中的應(yīng)用。

上述的血清或血漿miRNA標志物的引物或探針在制備2型糖尿病診斷試劑盒中的應(yīng)用。

上述的血清或血漿miRNA標志物的探針在制備2型糖尿病診斷試劑盒中的應(yīng)用。

一種2型糖尿病診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測血清或血漿中的miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a。

該試劑盒含有所述的血清或血漿miRNA標志物的探針。該試劑盒含有血清或血漿中miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a的引物或探針。該miRNA-486的探針為Assay ID：001278；miRNA-146b的探針為Assay ID：001097；miRNA-15b的探針為Assay ID：000390；miRNA-148a的探針為Assay ID：000470。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點：miRNA區(qū)別于傳統(tǒng)生物標志物，可以在血清/血漿中穩(wěn)定存在，易于分離提取，不容易受反復(fù)凍融或pH變化的影響；并且血清/血漿的獲得是微創(chuàng)的，將在很大程度上減輕患者的痛苦；最重要的是定量準確，將大大提高疾病診斷的靈敏度與特異度，因此該類小分子RNA生物標志物的成功開發(fā)有助于預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗和2型糖尿病的輔助診斷。在本發(fā)明通過深度測序及RT-qPCR的方法發(fā)現(xiàn)肥胖兒童血清/血漿中異常高表達的miRNAs在成人肥胖合并2型糖尿病患者血清/血漿中均顯著高表達，且與2型糖尿病患者空腹血糖具有顯著相關(guān)性，揭示其在肥胖兒童預(yù)警遠期胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生的診斷中具有寶貴價值。2型糖尿病癥狀可能與1型糖尿病相似，但往往癥狀不明顯，目前的檢測方法可能在發(fā)病多年之后才診斷出患有糖尿病，而此時則已出現(xiàn)并發(fā)癥，對身體的各種組織特別是眼睛、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)引起長期損害，因此需要此類血清/血漿miRNAs預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗及2型糖尿病的發(fā)生，以實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早防療。本發(fā)明獲得了肥胖兒童及成人肥胖合并2型糖尿病中特異高表達的血清/血漿中miRNA標志物，為臨床診斷肥胖兒童預(yù)警遠期胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生等提供了巨大的便利。本發(fā)明的標志物從微觀角度診斷肥胖兒童預(yù)警遠期胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生的風(fēng)險，并且操作簡單，結(jié)果精確客觀可靠，能夠很好地將2型糖尿病組和代謝正常組區(qū)分開，可以準確、敏感的評估及預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生的風(fēng)險，僅需提供血樣即可進行，無需其他組織樣本，大大提高了臨床應(yīng)用的可能性與可行性，為臨床醫(yī)生制定早期預(yù)防、干預(yù)方案及判斷預(yù)后提供指導(dǎo)依據(jù)。

附圖說明

圖1、肥胖組兒童血清/血漿與對照組兒童血清/血漿中miRNA-486表達qPCR驗證圖；

圖2、肥胖組兒童血清/血漿與對照組兒童血清/血漿中miRNA-146b表達qPCR驗證圖；

圖3、肥胖組兒童血清/血漿與對照組兒童血清/血漿中miRNA-15b表達qPCR驗證圖；

圖4、肥胖組兒童血清/血漿與對照組兒童血清/血漿中miRNA-148a表達qPCR驗證圖；

圖5、miRNA-486在成人2型糖尿病患者血清中的表達水平與代謝正常組血清中表達水平的比較圖；

圖6、miRNA-146b在成人2型糖尿病患者血清中的表達水平與代謝正常組血清中表達水平的比較圖；

圖7、miRNA-15b在成人2型糖尿病患者血清中的表達水平與代謝正常組血清中表達水平的比較圖；

圖8、miRNA-148a在成人2型糖尿病患者血清中的表達水平與代謝正常組血清中表達水平的比較圖；

圖9、成人血清/血漿miRNA-486血清/血漿的表達水平與成人患者空腹血糖相關(guān)性比較圖；

圖10、成人血清/血漿miRNA-146b血清/血漿的表達水平與成人患者空腹血糖相關(guān)性比較圖；

圖11、成人血清/血漿miRNA-15b血清/血漿的表達水平與成人患者空腹血糖相關(guān)性比較圖；

圖12、成人血清/血漿miRNA-148a血清/血漿的表達水平與成人患者空腹血糖相關(guān)性比較圖；

圖13、用于預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生診斷效率的miRNA-486的ROC曲線圖；

圖14、用于預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生診斷效率的miRNA-146b的ROC曲線圖；

圖15、用于預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生診斷效率的miRNA-15b的ROC曲線圖；

圖16、用于預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生診斷效率的miRNA-148a的ROC曲線圖；

圖17、用于預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生診斷效率的miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b和miRNA-148a組合的ROC曲線圖。

具體實施方式

實施例1：

1、試驗材料：Trizol reagent，TaqMan逆轉(zhuǎn)率試劑盒，Universal Master Mix II均購自Life technologies公司；氯仿，無水乙醇均購自國藥集團藥業(yè)股份有限公司；DEPC水購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2、樣本收集和樣本資料的整理：

本發(fā)明共計使用兒童血液樣本352例，其中肥胖組樣本136例，正常組樣本216例；兩組樣本之間年齡無顯著差異(P>0.05)，BMI差異顯著(P<0.001)，此外兩組間血脂、總膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白均差異顯著(P<0.05)。

本發(fā)明共計使用成人2型糖尿病樣本101例，對照組樣本82例；兩組樣本間年齡無顯著差異，BMI、空腹血糖、血脂、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白均存在顯著差異。

本發(fā)明分別選取肥胖兒童和正常兒童血清樣本各15例，抽提總RNA后，每5個樣本混合為一個樣本進行深度測序分析(Deep sequencing)。

3、血清總RNA的抽提

1)取300μl血清樣本，于去酶EP管中，冰上放置；加入3倍體積的Trizol，充分震蕩后加入終濃度為10^-4pmol/μl的人工合成的線蟲cel-mir-39作為外參，用于標準化提取、反轉(zhuǎn)錄及控制后續(xù)的定量檢測全過程操作的樣本間差異(1.2ml體積中加入10μl 0.2μM的cel-39)，分成2個EP管繼續(xù)后續(xù)實驗。

2)靜置15分鐘后加入等體積的氯仿，充分震蕩，靜置15分鐘后，12000g，4℃，離心15分鐘(上清可再次加入等體積氯仿萃取)；

3)將上清轉(zhuǎn)移至新的去酶EP管中，加入1.5倍體積無水乙醇，輕輕混勻轉(zhuǎn)移700μl至QIAGEN miRNA抽提試劑盒吸附柱上，≥8000g，4℃，離心30s，棄液(重復(fù)此步驟)；

4)取700μl Buffer RWT于吸附柱上，≥8000g，4℃，離心30s，棄液；取500μl Buffer RPE于吸附柱上，≥8000g，4℃，離心30s，棄液；取500μl Buffer RPE于吸附柱上，≥8000g，4℃，離心30s，棄液；將吸附柱置于新的EP管中，≥8000g，4℃，離心2min。

5)取適量Depc水(30μl)于吸附柱上，靜置2分鐘，≥8000g，4℃，離心1min，測量RNA濃度，冰上放置待用或-80℃保存。

4、深度測序：本實驗樣本測序在華大基因進行。小分子RNA是生物體內(nèi)一類重要的特殊分子，誘導(dǎo)基因沉默，參與細胞生長、發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等諸多生命活動的調(diào)控過程?；贖iSeq高通量測序技術(shù)的小RNA數(shù)字化分析，采用邊合成邊測序(SBS-sequencing by synthesis)，可減少因二級結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡單易操作的自動化平臺和功能強大等特點，一次性獲得數(shù)百萬條小分子RNA序列，能夠快速全面地鑒定該物種在該狀態(tài)下的小分子RNA并發(fā)現(xiàn)新的小分子RNA，構(gòu)建樣品之間的小分子RNA差異表達譜，為小分子RNA功能研究提供有力工具。

5、根據(jù)Deep sequencing測序結(jié)果，依據(jù)miRNA差異性和表達豐度高低，我們選擇miR-222、miR-375、miR-27a、miR-30a、miR-130b、miRNA-206、miRNA-26b、miRNA-320a、miRNA-197、miRNA-19a、miRNA-30d、miRNA-146a、miRNA-99b、miRNA-146b、let-7d、miRNA-15b、miRNA-21和miRNA-20a等18個miRNA設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR的探針(探針I(yè)D分別為Taqman MicroRNA assay-has-mir-197(Assay ID:000497)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-146a(Assay ID:000468)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-130b(Assay ID:000456)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-222(Assay ID:002276),Taqman MicroRNA assay-has-mir-486(Assay ID:001278)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-148a(Assay ID:000470),Taqman MicroRNA assay-has-mir-21(Assay ID:000397),Taqman MicroRNA assay-has-mir-375(Assay ID:000564)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-146b(Assay ID:001097)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-99b(Assay ID:000436),Taqman MicroRNA assay-has-mir-30a(Assay ID:000416)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-27a(Assay ID:000408)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-30d(Assay ID:000420),Taqman MicroRNA assay-has-mir-let-7d(Assay ID:002283)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-26b(Assay ID:000395)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-15b(Assay ID:000390),Taqman MicroRNA assay-has-mir-19a(Assay ID:000395)，Taqman MicroRNA assay-has-mir-20a(Assay ID:000580)，均購自美國ABI公司)。對“肥胖兒童”組和“正常兒童”組血清單個個體進行miRNA的實時熒光定量PCR檢測。用探針法進行qRT-PCR檢測，每個樣本連續(xù)檢測3次，對整個實驗過程嚴格質(zhì)控，并采用盲法，以避免偏倚出現(xiàn)。

6、探針法：使用ABI公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Taqman MicroRNAreverse transcription kit+Taqman gene expression master mix+Taqman assay-has-mir-26b/Taqman MicroRNA assay-has-mir-222/Taqman MicroRNA assay-has-mir-146a/Taqman MicroRNA assay-has-mir-146b/+Taqman MicroRNA assay-cel-mir-39)。

1)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。探針法的逆轉(zhuǎn)錄體系為：100mM dNTPs 0.15μl，50U/μl Reverse Transcriptase 1.00μl，10*Reverse Transcription Buffer 1.50μl，20U/μl RNase Inhibitor 0.19μl，Nuclease-free water 4.16μl以及3μl逆轉(zhuǎn)錄引物和5μl上述提取的RNA樣品。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)熱循環(huán)為：16℃孵育30分鐘，42℃孵育30分鐘，85℃孵育5分鐘，4℃維持至取出，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)q-PCR：探針法的q-PCR的反應(yīng)體系為：cDNA 1μl，miRNAs的探針1μl，Taqman gene expression master mix 10μl及DEPC水8μl。反應(yīng)步驟為95℃，5min預(yù)變性進行一個循環(huán)，95℃、15s變性，60℃、1min退火延伸進行45個循環(huán)，使用QuantStudio^TM 6Flex熒光定量PCR儀操作。

7、數(shù)據(jù)處理與分析

7.1)采用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行錄入及數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，采用t檢驗分析兩組樣本間差異，采用Pearson相關(guān)分析分析數(shù)據(jù)相關(guān)性。

7.2)深度測序分析(Deep sequencing)：肥胖組兒童目的miRNA的相對表達量(H2)與正常兒童目的miRNA的相對表達量(H1)比值的對數(shù)值(以2為底數(shù))大于1者(表示上調(diào))；或者小于0者(表示下調(diào))進行探針法qRT-PCR驗證實驗。共選出18個miRNAs。(見表1)

表1深度測序結(jié)果

7.3)探針法qRT-PCR驗證實驗數(shù)據(jù)分析：

1)用方程-△△Ct表示兩組樣本血清miRNA的相對表達量，其中△△Ct＝△(C_T肥胖-△C_Tcel-mir-39)-(△C_T正常-△C_Tcel-mir-39)，在每個樣本提取RNA時加入人工合成的cell-mir-39的成熟RNA作為參照，計算血清/血漿中miRNA的相對表達量。以上數(shù)據(jù)，即Ct值均可用熒光定量檢測儀配帶的檢測軟件讀出。最后數(shù)據(jù)用IBM SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析。

2)將上面篩選出來的18條miRNAs，進行定量PCR驗證，以化學(xué)合成的cel-miR-39做為外參。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在136例肥胖兒童與216例正常兒童對照組中，有4條miRNAs在肥胖組兒童血清/血漿中表達高于對照組，且結(jié)果具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。這4條miRNAs分別是miRNA-486、miRNA-146b、miRNA-15b、miRNA-148a(見圖1-4)。

3)肥胖是導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生的主要因素，肥胖患者標志miRNA是否可以在糖尿病預(yù)防中發(fā)揮預(yù)警作用并不為人所知。因此，我們進一步檢測了上述差異miRNA在成人2型糖尿病患者中的表達，證實其作為肥胖預(yù)警2型糖尿病的分子標記物的可能性。結(jié)果在101例2型糖尿病樣本和82例糖代謝正常對照樣本中，發(fā)現(xiàn)這4條在肥胖兒童血清中差異表達的miRNAs在肥胖合并2型糖尿病患者血清中均顯著高表達(見圖5-8)。

4)我們進一步借助統(tǒng)計相關(guān)性分析中Pearson相關(guān)性分析，分析這4種差異miRNAs的表達水平與成人患者空腹血糖相關(guān)性，評估其作為肥胖誘發(fā)的2型糖尿病的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種miRNA與空腹血糖水平相關(guān)性顯著(miR-486，R＝0.674；miR-146b，R＝0.594；miR-15b，R＝0.688；miR-148a，R＝0.554)(見圖9-12)，可以作為預(yù)警肥胖兒童遠期2型糖尿病發(fā)生的標志物。

5)對這4個miRNAs用于預(yù)警肥胖兒童遠期胰島素抵抗和2型糖尿病的發(fā)生診斷效率，繪制ROC曲線(Receiver Operating Curve)計算AUC(Area Under the ROC Curve)(見圖13-17)。

miR-486以92.58％的AUC將2型糖尿病組和糖代謝正常組分開，最佳臨界點的靈敏度為：93.33％，特異度為：81.13％。

miR-146b以88.18％將2型糖尿病組和糖代謝正常組分開，最佳臨界點的靈敏度為：90.00％，特異度為：79.25％。

miR-15b以96.86％將2型糖尿病組和糖代謝正常組分開，最佳臨界點的靈敏度為：100.00％，特異度為：83.02％。

miR-148a以87.23％將2型糖尿病組和糖代謝正常組分開，最佳臨界點的靈敏度為：90.00％，特異度為：77.36％。

miR-486、miR-146b、miR-15b和miR-148a組合以98.18％的AUC將2型糖尿病組和糖代謝正常組分開，最佳臨界點的靈敏度為：96.67％，特異度為：90.57％。

以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施方式做出詳細說明，但本發(fā)明不局限于所描述的實施方式。對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，在本發(fā)明的原理和技術(shù)思想的范圍內(nèi)，對這些實施方式進行多種變化、修改、替換和變形仍落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。