本發(fā)明屬于食用菌DNA標(biāo)記輔助育種領(lǐng)域，更具體涉及一個用于鑒別雙孢蘑菇菌株類型的ISSR標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雙孢蘑菇是我國的大宗食用菌之一，2015年全國雙孢蘑菇總產(chǎn)量達(dá)230多萬噸，占世界年產(chǎn)量50%以上。據(jù)測算，每生產(chǎn)1噸鮮蘑菇，即可轉(zhuǎn)化1噸養(yǎng)殖業(yè)廢料和2噸種植業(yè)廢料，解決1個農(nóng)村勞動力就業(yè)，因此經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益顯著。

根據(jù)雙孢蘑菇的栽培農(nóng)藝特性，結(jié)合酯酶同工酶表型分析，可把這些菌株區(qū)分為G型、H型、HG型等不同類型，其中G型菌株的優(yōu)質(zhì)特征明顯，其菌蓋圓整光滑、菇質(zhì)結(jié)實(shí)、組織致密、菌褶細(xì)小色淡、不易褐變、制罐收縮率低。目前我國雙孢蘑菇農(nóng)業(yè)生產(chǎn)仍占到總量的80%以上，產(chǎn)品除鮮銷外，部分還加工成罐頭出口，因此所用的品種也要求以優(yōu)質(zhì)為主、兼顧產(chǎn)量的品種，如本單位選育的As2796、W192等品種。因此，具有優(yōu)質(zhì)性狀的G型雙孢蘑菇種質(zhì)資源及新品種對我國的雙孢蘑菇產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要。

目前本單位致力于通過DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)進(jìn)行雙孢蘑菇新品種的選育，開發(fā)的DNA標(biāo)記已應(yīng)用到親緣關(guān)系分析、雜交親本選擇、同核體鑒定等方面。ISSR (簡單序列重復(fù)區(qū)間)是一種新發(fā)展起來的基于微衛(wèi)星序列的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。它利用人工設(shè)計合成的核苷酸重復(fù)序列引物對SSR(簡單序列重復(fù))之間的DNA序列進(jìn)行半隨機(jī)PCR擴(kuò)增，可獲得豐富的多態(tài)性。本發(fā)明人通過大量的ISSR引物篩選和大規(guī)模的菌株驗(yàn)證，找到了一個能用于鑒別雙孢蘑菇G型菌株的ISSR標(biāo)記。利用該分子標(biāo)記能在雙孢蘑菇雜交育種中快速地鑒別G型菌株，而不必經(jīng)過費(fèi)時費(fèi)力的出菇試驗(yàn)，這對雜交育種中親本選擇與跟蹤鑒定、提高育種效率有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明基于分子標(biāo)記技術(shù)，建立一個用于鑒別雙孢蘑菇菌株類型的ISSR標(biāo)記及應(yīng)用。

本發(fā)明為一個用于鑒別雙孢蘑菇菌株類型的ISSR標(biāo)記及應(yīng)用，是利用ISSR分子標(biāo)記對雙孢蘑菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

利用ISSR引物對雙孢蘑菇菌株基因組DNA進(jìn)行ISSR-PCR，G型菌株能擴(kuò)增出300bp的特異性條帶，所述ISSR引物的核苷酸序列為：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3’。

所述引物在鑒別雙孢蘑菇G型菌株上的應(yīng)用。

本發(fā)明的方法用于特異性地鑒別雙孢蘑菇G型菌株，該方法耗時短，操作簡便，特異性強(qiáng)，無需出菇，省時省力。根據(jù)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物300bp條帶的有無來鑒定不同類型菌株，具有該條帶的菌株為G型菌株，沒有該條帶的菌株為其它類型菌株。

附圖說明

圖1 雙孢蘑菇24個G型菌株的ISSR圖譜，M: LambdaDNA/EcoRI+HindIII Markers；1-24：162-1，Δ32α，LMi，SA6，Ag5，832，78832，上20-1，F(xiàn)922，Somycel22，Psu310，310，M22，M91，虹橋22-2，日本Ag，0042，0045，滬103，福罐4，M-2，102N，Ag22，308-1。右邊箭頭指示特異條帶位置，顯示24個G型菌株均擴(kuò)增出約300bp的特異條帶。

圖2 雙孢蘑菇24個非G型菌株的ISSR圖譜，M: LambdaDNA/EcoRI+HindIII Markers；25-48：102-2，蘇錫一號，T-03，111-455，111，浣沙176，浣沙176-3，245-6，F(xiàn)4，F(xiàn)20，Ag6，813^2D，02，7001，7601，701，Ag18，臺-1，0072，S46，50-1，125，浣沙176-2，日本118。右邊箭頭指示特異條帶位置，顯示24個非G型的其它菌株均未擴(kuò)增出約300bp的特異條帶。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、MgCl₂ 、dNTPs購自廈門泰京生物有限公司，ISSR引物委托上海生工生物科技有限公司合成。所述ISSR引物的核苷酸序列為：5’-AGAGAGAGAGAGAGAGG-3’。

2.雙孢蘑菇DNA提取與電泳

雙孢蘑菇DNA提取與檢測按照文獻(xiàn)[陳美元,廖劍華,王波,李洪榮,盧政輝,郭仲杰,蔡丹鳳,王澤生. 中國野生蘑菇屬90個菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J]. 食用菌學(xué)報,2009,(01):11-16.]。

3.ISSR-PCR反應(yīng)體系與條件

ISSR-PCR反應(yīng)體系與條件參照文獻(xiàn)[陳美元,廖劍華,李洪榮,郭仲杰,盧政輝,蔡丹鳳,王澤生. 雙孢蘑菇栽培菌株遺傳多樣性的DNA指紋分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報,2009,(04):149-156.]。反應(yīng)體系為：模板DNA 30 ng，引物30 ng， dNTPs 0.1 mmol/L， MgCl₂ 2.5 mmol/L， Taq DNA聚合酶1 U，1×PCR緩沖液，用ddH₂O補(bǔ)總體積至20μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸90s，擴(kuò)增40個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

4.結(jié)果分析

ISSR-PCR檢測結(jié)果如圖1和圖2，1-24號為雙孢蘑菇G型菌株，24個菌株均擴(kuò)增出約300bp的特異條帶，檢出陽性率為100%。25-48號為雙孢蘑菇非G型其它菌株，24個菌株均未擴(kuò)增出300bp特異性條帶，檢出陽性率為0%。因此，該標(biāo)記與雙孢蘑菇G型菌株性狀緊密連鎖，應(yīng)用該標(biāo)記可以非常方便地在菌絲階段對雙孢蘑菇不同類型菌株進(jìn)行區(qū)分和鑒定。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所

<120> 一個用于鑒別雙孢蘑菇菌株類型的ISSR標(biāo)記及應(yīng)用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagagagag agagagg 17