本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及確定一種疾病的基因突變位點的方法，更具體的涉及確定兒童肺間質(zhì)性肺炎的基因突變位點的方法。
背景技術(shù)：
：肺間質(zhì)疾病/彌漫性肺疾病(ILD/DPLD)是一組病因不同，但臨床、影像學(xué)和組織病理學(xué)類似的異質(zhì)性疾病,目前認(rèn)為包括200余種疾病。兒童，特別是嬰幼兒ILD/DPLD(chILD/chDPLD)與成年人既有相似性，又有特異性，例如chILD的病因及預(yù)后與成年人存在明顯的差別，通常成年人普遍診斷的原發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)在兒童幾乎不存在，并且chILD的預(yù)后通常較成年人好。兒童肺間質(zhì)疾病的發(fā)病率為0.3/100000，死亡率較高。嬰幼兒具有影像學(xué)表現(xiàn)為彌漫性、霧蒙樣、毛玻璃浸潤，而又沒有明顯原因時，在臨床上應(yīng)該懷疑肺間質(zhì)疾病。然而，現(xiàn)階段對確定兒童肺間質(zhì)性肺炎的基因突變位點的方法還有待進一步的研究。在嬰幼兒期，遺傳因素所致的chILD占有重要的地位，近年來國外在這一方面的進展非常快，國內(nèi)此領(lǐng)域仍然處于空白狀態(tài)。這種基因的檢測方法與肺間質(zhì)疾病有關(guān)，但是這種檢測的直接目的并非是診斷肺間質(zhì)疾病，而只是檢測肺間質(zhì)疾病的中間參數(shù)技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一，為此，本發(fā)明的一個目的在于提供了一種確定兒童肺間質(zhì)性肺炎的基因突變位點的方法，本方法可對肺間質(zhì)疾病相關(guān)人8個基因的編碼區(qū)全長及附近轉(zhuǎn)錄剪接位點進行突變分析。涵蓋了該范圍內(nèi)的點突變、比較小的插入和缺失型突變。本發(fā)明所使用方法為二代測序，相對傳統(tǒng)一代測序，通量大、時間短、精確度高、信息量豐富，可以在短時間內(nèi)對肺間質(zhì)相關(guān)的8個基因進行精確定位和分析，而且大量節(jié)省的分析成本。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種確定兒童間質(zhì)性肺炎的基因位點突變的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：(1)獲取外周血，所述外周血來自于臨床診斷為兒童間質(zhì)性肺炎的個體；(2)從所述外周血中提取基因組DNA；(3)使用特異性擴增引物對通過PCR擴增所述基因組DNA，從而獲得PCR擴增產(chǎn)物；(4)對所述PCR擴增產(chǎn)物進行第一測序，以便獲得第一測序結(jié)果；(5)將所述第一測序結(jié)果進行過濾，以便獲得經(jīng)過過濾的第一測序結(jié)果；(6)將所述經(jīng)過過濾的第一測序結(jié)果與參考序列進行比對，以及基于比對結(jié)果確定與兒童間質(zhì)性肺炎相關(guān)的基因突變位點；(7)將所述含有突變位點的基因進行第二測序，以便進行驗證。進一步地，所述特異性擴增引物對的核苷酸序列是SEQIDNO:1和76、SEQIDNO:2和77、SEQIDNO:2和77、SEQIDNO:3和78、SEQIDNO:4和79、SEQIDNO:5和80、SEQIDNO:6和81、SEQIDNO:7和82、SEQIDNO:8和83、SEQIDNO:9和84、SEQIDNO:10和85、SEQIDNO:11和86、SEQIDNO:12和87、SEQIDNO:13和88、SEQIDNO:14和89、SEQIDNO:15和90、SEQIDNO:16和91、SEQIDNO:17和92、SEQIDNO:18和93、SEQIDNO:19和94、SEQIDNO:20和95、SEQIDNO:21和96、SEQIDNO:22和97、SEQIDNO:23和98、SEQIDNO:24和99、SEQIDNO:25和100、SEQIDNO:26和101、SEQIDNO:27和102、SEQIDNO:28和103、SEQIDNO:29和104、SEQIDNO:30和105、SEQIDNO:31和106、SEQIDNO:32和107、SEQIDNO:33和108、SEQIDNO:34和109、SEQIDNO:35和110、SEQIDNO:36和111、SEQIDNO:37和112、SEQIDNO:38和113、SEQIDNO:39和114、SEQIDNO:40和115、SEQIDNO:41和116、SEQIDNO:42和117、SEQIDNO:43和118、SEQIDNO:44和119、SEQIDNO:45和120、SEQIDNO:46和121、SEQIDNO:47和122、SEQIDNO:48和123、SEQIDNO:49和124、SEQIDNO:50和125、SEQIDNO:51和126、SEQIDNO:52和127、SEQIDNO:53和128、SEQIDNO:54和129、SEQIDNO:55和130、SEQIDNO:56和131、SEQIDNO:57和132、SEQIDNO:58和133、SEQIDNO:59和134、SEQIDNO:60和135、SEQIDNO:61和136、SEQIDNO:62和137、SEQIDNO:63和138、SEQIDNO:64和139、SEQIDNO:65和140、SEQIDNO:66和141、SEQIDNO:67和142、SEQIDNO:68和143、SEQIDNO:69和144、SEQIDNO:70和145、SEQIDNO:71和146、SEQIDNO:72和147、SEQIDNO:73和148、SEQIDNO:74和149、SEQIDNO:75和150。進一步地，所述兒童間質(zhì)性肺炎相關(guān)的基因位點為ABCA3、SFTPB、SFTPC、CSF2RA、CSF2RB、NKX2.1、FOXF1和SLC7A7基因編碼區(qū)及內(nèi)含子剪切接位點。進一步地，上述步驟(2)中基因組DNA的濃度為20μg/μL-100μg/μL。進一步地，在對所述PCR擴增產(chǎn)物進行第一測序的過程中，構(gòu)建插入片段為175～275bp的測序文庫。進一步地，按照10μL反應(yīng)體系計算，上述步驟(3)中PCR擴增的反應(yīng)體系為：試劑體積LA酶(5U/uL)0.2μLddH2O6.2μL引物工作液1μL樣品DNA1μLdNTP0.4μLbuffer1μLDMSO0.2μL任選地，所述引物工作液為擴增引物按其質(zhì)量加超純水配成濃度為100μmol的母液，再按照擴增引物對的配對原則，配成終濃度為5μmol的工作液。任選地，所述PCR擴增的反應(yīng)程序為：進一步地，所述第一測序利用Illuminamiseq平臺進行雙末端測序。進一步地，上述步驟(4)中的參考序列為ABCA3:NG_011790.1；SFTPB:NG_016967.1；SFTPC:NG_029659；CSF2RA:NG_012280.1；CSF2RB:NG_008040.1；NKX2.1:NG_013365.1；FOXF1:NG_016273.1；SLC7A7:NG_012851.2，任選地，所述參考序列來源于NCBI。進一步地，所述第二測序是利用Sanger法進行的。進一步地，所述測序文庫是使用IlluminaNexteraXT建庫試劑盒制備的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提供的方法的優(yōu)點是可以同時檢測與肺間質(zhì)相關(guān)的8個基因并對其分析，成本低，通量高，時間短、精確度高。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。附圖說明圖1為根據(jù)本發(fā)明一個實施例擴增得到的75個外顯子的PCR擴增片段的2％凝膠電泳圖圖2為Sanger測序驗證SFTPC基因上存在c.218T>C(p.Ile73Thr)突變的示意圖具體實施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例1(1)樣本DNA的準(zhǔn)備樣本信息：中國男患者，1歲11月，臨床診斷為間質(zhì)性肺炎。收集患者的外周血標(biāo)本，使用上海飛捷生物全血DNA提取試劑盒提取DNA，使用NanoDrop2000分光光度計對提取好的DNA進行濃度測定。測定濃度為56.2ng/ul，達到檢測標(biāo)準(zhǔn)。(2)引物的設(shè)計和擴增使用Primer5軟件針對8個基因的編碼區(qū)及附件內(nèi)含子區(qū)域進行引物的設(shè)計，共設(shè)計了75對引物。按如下擴增體系進行PCR擴增，LA酶0.2μLddH2O6.2μL引物工作液1μL樣品DNA1μLdNTP0.4μLbuffer1μLDMSO0.2μLTotal10μLPCR擴增程序如下：擴增得到75個DNA片段，進行凝膠電泳見圖1，可以確定將要進行測序的目的片段都已得到有效擴增。(2)文庫的構(gòu)建和測序文庫的制備：使用IlluminaNexteraXT建庫試劑盒構(gòu)建插入片段175-275bp的樣本文庫，具體操作見文庫制備試劑盒說明書。然后使用Illuminamiseq平臺進行雙末端測序。(3)數(shù)據(jù)分析對低質(zhì)量原始數(shù)據(jù)進行過濾，患者血液樣本獲得3950乘數(shù)的單倍體覆蓋度。測序結(jié)果通過MiSeqReport與對應(yīng)參考序列(ABCA3:NG_011790.1；SFTPB:NG_016967.1；SFTPC:NG_029659；CSF2RA:NG_012280.1；CSF2RB:NG_008040.1；NKX2.1:NG_013365.1；FOXF1:NG_016273.1；SLC7A7:NG_012851.2，來源于NCBI)對比，基于vcf.out文件進行分析，得到此患者的基因變異數(shù)據(jù)如下：結(jié)合臨床信息及NCBI上的相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫、文獻，對上列變異信息進行分析篩選，去除多態(tài)性位點以及非病理性位點?；颊邫z測到SFTPC基因上存在c.218T>C(p.Ile73Thr)，此突變被認(rèn)為與肺間質(zhì)疾病有關(guān)，并有相關(guān)文獻支持。(4)陽性位點驗證對患者SFTPC基因的陽性位點進行Sanger法測序驗證。使用上游引物：GTAAAACGACGGCCAGTGGAGGGAAGCGCATTTGAGTA下游引物：GGAAACAGCTATGACCATGAGCCAATGAGGAACAGTGCT對患者標(biāo)本進行擴增，擴增程序以及體系同之前。對擴增產(chǎn)物進行一代測序，測序引物為：正向測序引物：GTAAAACGACGGCCAGTG反向測序引物：GGAAACAGCTATGACCATG一代測序使用ABI3500，測序操作見儀器說明書。測序結(jié)果分析：使用軟件FinchTV對一代測序下機數(shù)據(jù)進行分析，從NCBI上下載SFTPC基因參考序列，進行對比，發(fā)現(xiàn)雜合突變c.218T>C(p.Ile73Thr)，證明二代測序結(jié)果準(zhǔn)確，詳見圖2。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當(dāng)前第1頁1 2 3