本發(fā)明涉及動物分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域，具體來說，涉及一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SV標(biāo)記及其應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
：豬是重要的經(jīng)濟動物，豬繁殖性能的高低直接影響到養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益，同時繁殖性狀是一個低遺傳力的數(shù)量性狀，主要包括產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、初生重、初生窩重、20日齡窩重、斷奶頭數(shù)、斷奶重和斷奶窩重等指標(biāo)，如何提高母豬繁殖性能是養(yǎng)豬業(yè)健康高效、可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵，也是當(dāng)前遺傳育種研究的重點和熱點。伴隨著基因組學(xué)和功能基因?qū)W的快速發(fā)展，分子標(biāo)記及其檢測技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了第三代，主要以單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)、表達序列標(biāo)簽(ExpressedsequenceTag，EST)、結(jié)構(gòu)變異(structurevariation，SV)為主。結(jié)構(gòu)變異SV通常是指獲得與缺失變異(PAVs，presence/absencevariants)和拷貝數(shù)變異(CNVs，copynumbervariants)，包括大尺度序列的缺失(deletion)、插入(insertion)、復(fù)制(duplications)、倒置(inversion)和易位(translocation)等(XiR,2010)。在基因組中結(jié)構(gòu)變異的數(shù)目遠遠小于序列多態(tài)，一般SNP的數(shù)量在百萬數(shù)量級，而結(jié)構(gòu)變異的數(shù)量為十萬數(shù)量級，二者相差十倍，但結(jié)構(gòu)變異所占的長度總和、影響的基因組序列變化的卻遠遠大于SNP(Conrad,D.F.,2010)，因而，結(jié)構(gòu)變異對基因組和動物性狀的影響的權(quán)重可能更大。我們前期應(yīng)用二代測序技術(shù)，選取兩個個體作為香豬高產(chǎn)和低產(chǎn)群的代表，進行全基因組SVs檢測，發(fā)現(xiàn)一個區(qū)段的結(jié)構(gòu)變異SV5在香豬群體中有明顯的差異，和香豬產(chǎn)仔數(shù)存在顯著關(guān)聯(lián)。因此建立本發(fā)明所描述的一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的結(jié)構(gòu)變異SV5的檢測方法，以期為實施香豬分子輔助育種提供技術(shù)支持。檢測基因中的結(jié)構(gòu)變異，現(xiàn)有二種技術(shù)：PCR技術(shù)和分子雜交技術(shù)?；赑CR技術(shù)的方法有：Pairwise-PCR技術(shù)，熒光定量PCR技術(shù)，短片段多重定量技術(shù)(QuantitativeMultiplexPCRofShortFluorescentFragments，QMPSF)、依賴連接的多重擴增探針雜交技術(shù)(MultiplexLigation-DependentProbeAmplification，MLPA)等。熒光定量PCR技術(shù)對結(jié)構(gòu)變異不能進行精確的定位；后兩種技術(shù)QMPSF和MLPA，在通量上有所提高，但將多位點的檢測置于同一個體系中，增加了引物設(shè)計的難度。基于雜交技術(shù)的方法有：Southern雜交、熒光原位雜交(Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)、Southernblotting雜交、多重擴增探針雜交技術(shù)(MultiplexAmplifiableProbeHybridization,MAPH)等。雜交技術(shù)影響因素較多、時間較長。目前，Pairwise-PCR技術(shù)在實際操作中應(yīng)用更多。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SV標(biāo)記及其應(yīng)用技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SV5標(biāo)記，是指豬基因組中，候選區(qū)域chr3：58983698-58983852的結(jié)構(gòu)變異，該區(qū)域的結(jié)構(gòu)變異是基因組中缺失或不缺失155bp片段。用于檢測與香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SV5標(biāo)記的引物對，所述引物對為：正向引物SV5F：GTGGAGCGTCTGGGGAACAT，反向引物SV5R：TGGGAGATGGAAGGTGGAGG。本發(fā)明提供用于PCR檢測前述與豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SV5標(biāo)記的試劑盒，所述試劑盒包含上述引物SV5F和SV5R。所述試劑盒還包括10×PCRMix、去離子水。本發(fā)明提供所述SV5標(biāo)記在鑒定香豬產(chǎn)仔數(shù)中的檢測方法。所述檢測方法包括以下步驟：(1)提取香豬的基因組DNA；(2)以上述香豬基因組DNA為模板，利用所述引物SV5F和SV5R，進行PCR擴增，檢測豬基因組SV5的基因型；(3)根據(jù)上述檢測結(jié)果，如果目的片斷純合缺失，則待測豬有產(chǎn)仔數(shù)較高的可能性；如果此片斷不缺失，則待測個體有低產(chǎn)仔數(shù)傾向。步驟(2)中進行PCR所用的擴增體系以20μL為例：2×PCRMix10.00μLF-primer(0.10μg/μL)0.20μLR-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反應(yīng)條件為：所述SV5標(biāo)記在香豬產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的應(yīng)用。所述的應(yīng)用包括以下步驟：(1)采用PCR技術(shù)檢測候選位點在群體中的結(jié)構(gòu)變異的情況，篩選到與豬產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的SV5標(biāo)記；(2)根據(jù)結(jié)構(gòu)變異SV5進行有高產(chǎn)仔數(shù)優(yōu)勢母豬的選育。在本發(fā)明的實施例中，以結(jié)構(gòu)變異SV5位點(chr3：58983698-58983852)為候選位點，通過PCR技術(shù)檢測該位點在群體中的結(jié)構(gòu)變異分布情況；如果待測個體SV5區(qū)段有缺失，則待測豬屬于有高產(chǎn)仔數(shù)優(yōu)勢的個體。該結(jié)構(gòu)變異位點的檢出，為揭示豬產(chǎn)仔數(shù)分子機理和標(biāo)記輔助選擇的實施提供理論基礎(chǔ)。本發(fā)明的有益效果：(一)本發(fā)明提供的分子遺傳標(biāo)記不受豬的年齡、性別和營養(yǎng)和環(huán)境等因素的限制，可用于種豬的早期選擇，甚至在剛出生時就可準(zhǔn)確地進行后備種豬的篩選，從而提高養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益。(二)檢測結(jié)構(gòu)變異的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡便，檢測所需的條件普通實驗室可以滿足。(三)本發(fā)明可做為分子標(biāo)記用于產(chǎn)仔數(shù)性狀的輔助選擇，為豬產(chǎn)仔數(shù)的分子標(biāo)記輔助選擇提供技術(shù)支持。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例1中瓊脂糖凝膠電泳檢測SV5基因型結(jié)果，M：DL2000DNAMarker；1：DD型；2：DA型；3：AA型；圖2為本發(fā)明實施例1中Sanger測序比對分析結(jié)果。具體實施方式以下實例對本發(fā)明做進一步的解釋，但不限定本發(fā)明的范圍，若無特別指明，實施例中所用的技術(shù)方法和條件均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)方法和常規(guī)實驗條件，或按照相關(guān)試劑廠商說明書建議的方法和條件。實施例1為本發(fā)明的檢測方法，步驟如下：1.豬耳組織基因組DNA提取本方法采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒，從豬耳組織中提取基因組DNA，具體方法如下：1)取小于50mg的耳組織置于2μL的離心管中，用手術(shù)剪刀充分剪碎；2)加入200μL緩沖液GA及20μL蛋白酶K，漩渦混勻，56℃消化2-4小時(每隔0.5小時混勻一次)至組織塊消化完全；3)加入200μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃消化10min；4)加入200μL無水乙醇，漩渦混勻；5)將消化液倒入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；6)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CB3放回收集管中；8)重復(fù)操作步驟7)；9)將吸附柱CB3放回收集管中12000rpm空離2min，棄廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液；10)將吸附柱轉(zhuǎn)移到干凈的2mL離心管中，向吸附柱中間部懸空加入50-200μL洗脫液TE，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min；基因組DNA存在于離心管中TE溶液中，4℃保存?zhèn)溆没?20℃長期保存。11)為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的TE溶液再加入吸附柱CB3中，放置2min，12000rpm離心2min；2.目標(biāo)序列及參考序列的擴增根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫登錄的該區(qū)域的序列設(shè)計引物，所述引物對為：正向引物SV5F：GTGGAGCGTCTGGGGAACAT，反向引物SV5R:TGGGAGATGGAAGGTGGAGG。以20μL計：10×PCRMix10.00μLUp-primer(0.10μg/μL)0.20μLDown-primer(0.10μg/μL)0.20μLgDNA1.00μLddH2O8.60μLTotalVolume20.00μLPCR反應(yīng)條件為：本試劑盒所包含的引物符合PCR擴增要求，擴增效果穩(wěn)定、特異性強，PCR擴增結(jié)果可準(zhǔn)確反應(yīng)基因組中目標(biāo)序列的結(jié)構(gòu)變異情況。3.瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳檢測選用1％的瓊脂糖凝膠。點樣時，用微量加樣器將PCR產(chǎn)物5μL，加入點樣孔中，同時加入D2000DNAMarker0.3μL對參照，設(shè)置電壓為120V，時間為30min。電泳完成后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，并做好圖像的保存。4.Sanger測序為了獲得精確的SV5的斷點信息，我們通過Sanger測序技術(shù)對擴增片段進行序列測定，將序列信息與豬參考基因組序列(ref.Sscrofa10.2)進行同源比對分析，確定SV5區(qū)域的精確斷點位置和基因組定位。實施例2不同豬結(jié)構(gòu)變異的檢測及應(yīng)用按照實施例1的方法，以豬基因組區(qū)域結(jié)構(gòu)變異位點(chr3：58983698-58983852)為候選位點，通過PCR技術(shù)檢測SV5在群體(香豬480頭，其中產(chǎn)仔數(shù)高的個體240頭，產(chǎn)仔數(shù)低的個體240頭)中的結(jié)構(gòu)變異情況，480頭香豬的血樣采自從江縣。以SV5候選區(qū)域，應(yīng)用本發(fā)明建立檢測技術(shù)分析群體中的結(jié)構(gòu)變異SV5的分布頻率，結(jié)果顯示香豬群體中存在SV5變異。表1香豬群體中候選SV5位點的基因型頻率和等位基因頻率檢測結(jié)果表2香豬SV5位點DD和AA基因型對應(yīng)的產(chǎn)仔數(shù)比較應(yīng)用本發(fā)明建立的檢測技術(shù)可檢測待測個體基因組中結(jié)構(gòu)變異SV5的基因型，不受香豬的年齡、性別、營養(yǎng)和環(huán)境等因素的限制，且操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3