本發(fā)明屬于藏羊基因組學領域，具體涉及一種青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA及其檢測方法與應用。

背景技術(shù)：

藏羊遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是青藏高原畜牧業(yè)生產(chǎn)的基礎。通過研究藏羊的遺傳多樣性可以進一步了解青藏高原藏羊遺傳多樣性的豐富程度和品種遺傳的獨特性程度，為青藏高原藏羊多樣性的保護和遺傳資源合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

綿羊的線粒體基因組DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)呈典型的閉合環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，長度為15.6kb，能夠自主復制和轉(zhuǎn)錄。線粒體DNA(mtDNA)是核外遺傳物質(zhì)，具有分子量較小、進化速度快、無組織特異性及嚴格的母系遺傳等特性，在近緣種間和種內(nèi)群體間具有豐富的多態(tài)性，是研究物種起源進化、分類的有力工具。根據(jù)堿性氯化銫密度梯度離心中雙鏈密度不同可將mtDNA的兩條鏈分為重鏈(H)和輕鏈(L)，兩條鏈都參與復制和轉(zhuǎn)錄過程。對綿羊線粒體基因組的結(jié)構(gòu)分析表明，mtDNA可分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)內(nèi)含37個基因，包括13個蛋白質(zhì)基因，2個rRNA基因，22個tRNA基因。其中13個蛋白質(zhì)編碼基因分別是細胞色素b基因(Cytb)、細胞色素C氧化酶三個亞基I、II和III基因(Co I、CoII和CoIII)，ATP合成酶亞基基因(ATPase 6和ATPase 8)和7個NADH酶亞基ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、ND6和ND4L；2個rRNA基因分別是12s rRNA基因和16s rRNA基因，緊緊相鄰；線粒體的12S rRNA和16S rRNA基因位于H鏈的tRNA Phe和tRNA Leu基因之間，以tRNA Val基因為間隔，12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守。22個tRNA基因位于rRNA和13個蛋白質(zhì)基因之間。除了ND6和8個tRNA基因在L鏈編碼外，其余大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因和2個rRNA基因都是由H鏈編碼。

青藏高原藏羊主要分為高原型(草地型)、山谷型和歐拉型三大類，各地根據(jù)其自然生態(tài)特點又細分為不同的類型，屬粗毛型綿羊地方品種。藏羊原產(chǎn)于青藏高原，主要分布于西藏自治區(qū)及青海、甘肅、四川、云南、貴州等地，由于各生態(tài)條件差異懸殊，形成了不同的類型。草地型(高原型)藏羊是主體，數(shù)量最多，主要分布于西藏境內(nèi)的岡底斯山、念青唐古拉山以北的藏北高原和雅魯藏布江地帶；青海的藏羊主要分布在海北藏族自治州、海南藏族自治州、海西蒙古族哈薩克自治州、黃南藏族自治州、玉樹藏族自治州、果洛藏族自治州六州的廣闊高寒牧區(qū)；甘肅的藏羊主要分布在甘南藏族自治州的各縣市；四川境內(nèi)的藏羊主要分布在甘孜藏族自治州、阿壩藏族羌族自治州北部牧區(qū)。山谷型藏羊主要分布在青海省南部的班瑪、囊謙兩縣的部分地區(qū)，四川省阿壩藏族羌族自治州南部牧區(qū)，云南的昭通市、曲靖市、麗江市及保山市騰沖縣。歐拉型藏羊是藏系綿羊的一個特殊生態(tài)類型，中心產(chǎn)區(qū)位于甘肅省甘南藏族自治州的瑪曲縣歐拉鄉(xiāng)及比鄰地區(qū)及青海省河南蒙古族自治縣和久治縣等地。

然而，由于青藏高原藏羊起源和進化差異及其遺傳多樣性，導致對地方藏羊品種遺傳資源背景、地方藏羊群體間的親緣關(guān)系以及準確厘定地方藏羊品種的分類工作造成了客觀的困難，從而使地方藏羊品種的育種工作產(chǎn)生巨大障礙。目前尚未見到對藏羊線粒體全基因組DNA的研究，特別是缺少一種快速、簡單、準確性高的藏羊線粒體全基因組DNA檢測方法，使得難以從基因水平揭示其系統(tǒng)進化關(guān)系和種群遺傳多樣性水平。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA及其檢測方法，該方法具有速度快、成本低、易掌握等優(yōu)點，所獲得的線粒體全基因組DNA可應用于青藏高原藏羊遺傳變異分析、種質(zhì)資源鑒定、母系起源和系統(tǒng)發(fā)育等領域。

本發(fā)明首先提供了一種用于擴增青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA的引物對，包括以下引物：

第1對引物：SEQ ID NO 3與SEQ ID NO 4；

第2對引物：SEQ ID NO 5與SEQ ID NO 6；

第3對引物：SEQ ID NO 7與SEQ ID NO 8。

擴增線粒體基因組，可通過設計較少的引物對進行完成，如優(yōu)選地使用8對或者更少的引物對完成；更優(yōu)選地，使用6對或者更少的引物對完成；更優(yōu)選地，使用4對或者更少的引物對完成，更優(yōu)選地，使用3對或者更少的引物對完成，最少2對PCR引物來完成，雖然減少引物對數(shù)會加快PCR擴增效率，但同時也會導致對DNA模板的質(zhì)量要求更高，以及對Taq酶的要求也更高等等；而設計更多對的引物來擴增線粒體基因組，如26對、43對，PCR和后續(xù)的純化操作繁瑣，PCR產(chǎn)物片段更短，對后續(xù)拼接和測序產(chǎn)生困難，因此，為了快速、低成本、并容易地獲得青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA序列，發(fā)明人選擇設計了3對引物，對模板的要求低，PCR產(chǎn)物錯配率低，檢測準確性高，更適用于如高通量測序平臺等現(xiàn)代測序技術(shù)。

本發(fā)明還提供了一種青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA的檢測方法，包括以下步驟：

1)收集青藏高原藏羊線粒體相關(guān)基因序列，并與近緣種線粒體基因組序列進行比對，分析相關(guān)基因在近緣種線粒體全基因組序列上的相對位置；

2)根據(jù)所述線粒體相關(guān)基因在所述近緣種線粒體全基因組序列上的相對位置設計引物，采用PCR方法擴增相鄰的兩個已知序列間的未知序列；

3)對所述PCR的產(chǎn)物進行測序、序列分析，將所有線粒體相關(guān)基因序列進行組裝，獲得全基因組DNA序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟1)中所述青藏高原藏羊線粒體相關(guān)基因序列來源于測序獲得的基因組文庫或轉(zhuǎn)錄組文庫。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟1)中的所述近緣種為歐洲摩弗倫羊、盤羊或羱羊。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟2)中的所述引物為3對：即

第1對引物：SEQ ID NO 3與SEQ ID NO 4；

第2對引物：SEQ ID NO 5與SEQ ID NO 6；

第3對引物：SEQ ID NO 7與SEQ ID NO 8。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟2)中的所述引物對的退火溫度為：

所述第1對引物的退火溫度為54℃；所述第2對引物的退火溫度為56℃；所述第3對引物的退火溫度為60℃。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟2)中的所述PCR的擴增反應體系為35uL，包括基因組DNA模板2.4uL、3pM上下游引物各3.6uL、2.5mM dNTP 2.4uL、Taq DNA聚合酶0.2uL、10×Buffer 3.6uL、最后補充滅菌雙蒸水至總體積為35uL；所述PCR反應程序為：94℃預變性5分鐘、94℃變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72℃延伸50秒、36個循環(huán)、72℃延伸10分鐘。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟3)中的所述PCR產(chǎn)物的測序方法為雙向直接測序。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟3)中的組裝方法是以歐洲摩弗倫羊、盤羊或源羊線粒體全基因組DNA序列為參照，將祁連白藏羊或甘加藏羊線粒體基因序列進行拼接，分別獲得祁連白藏羊或甘加藏羊線粒體全基因組DNA序列。

通過以上優(yōu)選的方法，本發(fā)明獲得了青藏高原2個地方藏羊品種2個個體的線粒體全基因組DNA序列，具有如SEQ ID NO 1.或SEQ ID NO 2.所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明獲得的青藏高原2個地方藏羊品種2個個體的線粒體全基因組DNA序列均為閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)，長度均為16618bp。

此外，本發(fā)明還提供了上述引物對在擴增青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA序列的用途。

通過本發(fā)明引物對及檢測方法，所獲得的青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA序列可用于祁連白藏羊和甘加藏羊種群遺傳變異分析、種質(zhì)資源鑒定、母系起源和系統(tǒng)發(fā)育等領域。

綜上所述，本發(fā)明有益效果：

(1)本發(fā)明通過設計較少的3對引物，完成了對青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA的擴增和檢測，簡化了PCR和后續(xù)的純化操作，適合高通量測序平臺等現(xiàn)代測序技術(shù)；此外，該引物對對模板的要求低，PCR產(chǎn)物錯配率低，檢測準確性高，具有預料不到的較少引物對通常所能達到的效果；

(2)本發(fā)明的檢測方法具有速度快、成本低、易掌握等優(yōu)點，能夠有效檢測出青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA序列，從而為青藏高原藏羊分子遺傳學及分子系統(tǒng)進化學研究提供有效的研究平臺；

(3)本發(fā)明提供的青藏高原藏羊線粒體全基因組DNA序列可應用于祁連白藏羊和甘加藏羊種群遺傳變異分析、種質(zhì)資源鑒定、母系起源和系統(tǒng)發(fā)育等領域。

附圖說明

圖1祁連白藏羊線粒體全基因組DNA環(huán)狀圖；

圖2甘加藏羊線粒體全基因組DNA環(huán)狀圖；

圖3基于線粒體基因組序列構(gòu)建的10個個體物種的NJ樹。

具體實施方式

實施例1

(1)青藏高原藏羊線粒體相關(guān)基因序列的收集與分析

首先，本發(fā)明從測序獲得的基因組文庫和轉(zhuǎn)錄組文庫中篩選青藏高原藏羊線粒體相關(guān)基因序列，然后，將收集到的青藏高原藏羊線粒體相關(guān)基因序列與近緣種歐洲摩弗倫羊、盤羊或羱羊線粒體全基因組序列進行比對，分析相關(guān)基因在近緣種線粒體全基因組序列上的相對位置；

(2)引物設計與PCR擴增

根據(jù)青藏高原藏羊線粒體基因在近緣種全基因組序列上的相對位置，以青藏高原藏羊基因為模板設計特異性引物3對：

引物序列和退火溫度如下表：

采用PCR方法擴增相鄰的兩個已知基因間的未知序列。PCR擴增反應體系為35uL，包括基因組DNA模板2.4uL、3pM上下游引物各3.6uL、2.5mM dNTP 2.4uL、Taq DNA聚合酶0.2uL、10×Buffer 3.6uL、最后補充滅菌雙蒸水至總體積為35uL；PCR反應程序為：94℃預變性5分鐘、94℃變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72℃延伸50秒、36個循環(huán)、72℃延伸10分鐘。PCR反應完成后，采用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的質(zhì)量。

(3)PCR產(chǎn)物測序與序列組裝

將上述PCR產(chǎn)物送測序公司進行雙向直接測序。將每個PCR產(chǎn)物的雙向測序結(jié)果拼接為一條完整的序列。然后，以青藏高原藏羊可能的母系起源物種，近緣種歐洲摩弗倫羊、盤羊、源羊線粒體全基因組序列為參照，將所有的線粒體相關(guān)基因進行組裝。最后獲得青藏高原祁連白藏羊(SEQ ID NO 1)和甘加藏羊線粒體全基因組DNA序列(SEQ ID NO 2)。

(4)基于線粒體基因組序列構(gòu)建青藏高原藏羊與近緣種NJ進化樹

利用本發(fā)明測序組裝獲得的祁連白藏羊和甘加藏羊線粒體基因組DNA序列以及從GenBank數(shù)據(jù)庫下載的2個摩弗倫羊、4個盤羊和2個源羊的線粒體基因組DNA序列(摩弗倫羊、盤羊和源羊登錄號見圖3)，通過MEGA 5.1軟件基于Kimura兩參數(shù)距離采用鄰位相接法(NJ)構(gòu)建10個個體物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)。結(jié)果表明祁連白藏羊和甘加藏羊與摩弗倫羊親緣關(guān)系最近，與盤羊次之，與羱羊最遠。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。