本發(fā)明涉及魚類的分子生物學技術領域，具體地說，是一種隆頭魚類群線粒體基因組測定的方法。
背景技術：
線粒體是具有獨特dna分子和完整遺傳信息傳遞和表達的半自主性細胞器，也是細胞進行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，在細胞生命活動中具有重要的意義。真核生物的線粒體dna(簡稱mtdna)多為共價閉合的雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有以串聯(lián)形式排列的多個基因，無內(nèi)含子，可編碼trna、rrna和一些蛋白質(zhì)。由于mtdna表面缺乏組蛋白的保護，其序列易發(fā)生突變且不易修復，這一遺傳的特殊性，已廣泛應用于遺傳學和系統(tǒng)發(fā)育學等方面的研究。自第一例人類線粒體基因組的全部序列公布以來，迄今已報道了上萬物種的mtdna序列。
隸屬于隆頭魚目(labriformes)的隆頭魚科(labridae)是海洋魚類中僅次于蝦虎魚科(gobiidae)的第二大科一級類群，分布于熱帶和亞熱帶海洋，全世界記載有539種。我國自20世紀50年代中期，陸續(xù)開展了黃渤海、東海、南海、南海諸島海域和北部灣等大規(guī)模的海洋魚類區(qū)系普查。我國大陸到20世紀80年代中期記錄了隆頭魚99種，臺灣至2012年收錄了130種，目前有名錄可查的有157種。然而，查詢國際公共數(shù)據(jù)庫，已公布mtdna全序列的隆頭魚物種僅有幾種(<10種)。這可能與幾種常規(guī)的mtdna測序方法不太適用于該類群有關。
目前，基于dna片段差異作為分子標記的主要有5種：(1)sanger測序法。使用物理或酶切的方法，使線粒體分割成測序有效長度內(nèi)的短片段，克隆至噬菌體或質(zhì)料載體，然后利用sanger法測序。該方法步驟繁瑣，費用高。(2)常規(guī)pcr方法。原理是根據(jù)已知的近緣物種的mtdna序列作為參考，設計出能夠覆蓋mtdna的引物，然后應用pcr技術擴增出線粒體基因組，測序獲得mtdna的序列。該方法需要大量的引物和繁瑣的實驗操作，但無法得到長dna片段。(3)對常規(guī)pcr進行改良后，提出了longpcr方法。該法能夠擴增5kb以上的dna片段，2對或更多的引物對擴增出相互重疊的dna長片段，分離純化后作為模板直接進行測序。該方法成功的關鍵在于設計和篩選出通用的mtdna引物對長片段進行有效擴增。(4)滾環(huán)擴增技術。該技術通過隨機六聚體引物和靶序列雜交并進行恒溫持續(xù)延伸，形成一條長度是模板長度數(shù)千倍、具有大量的串聯(lián)重復且與mtdna完全互補的線狀單鏈。然后由第2條引物，在第1條引物擴增產(chǎn)物的基礎上，與產(chǎn)物的部分序列互補，經(jīng)雜化和延伸，獲得mtdna克隆，可作為pcr反應的模板進行擴增和測序。這一技術較少應用于mtdna的測序。(5)下一代高通量測序(ngs)技術。ngs的最大優(yōu)勢在于每次能對多達幾百萬條dna分子進行測序，高效、快速的獲得大量dna序列。ngs用于mtdna測序，需要有mtdna的參考序列，且不易發(fā)現(xiàn)序列組裝的錯誤，并可能有核基因污染，限制了ngs技術的普遍應用。
針對海洋隆頭魚類群的魚類線粒體全基因組測序的方法非常稀少，對于常見的三帶頸鰭魚(iniistiustrivittatus)的線粒體基因組全序列的測定還未見研究報道。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對當前技術存在缺點和不足，提供一種隆頭魚類群線粒體全基因組序列測定的方法。
本發(fā)明提供的高效簡潔的隆頭魚類群線粒體基因組測定的方法，包括以下步驟：
(1)獲得16srrna、co1和cytb基因的部分序列：選擇公開魚類mtdna的3個基因16srrna、co1和cytb的序列，相應的各自設計1對引物，名稱分別為16s、co1和cytb，以隆頭魚dna為模板，進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物直接測序，分別獲得16srrna、co1和cytb基因的部分序列；
(2)獲得16srrna至co1的間隔區(qū)序列、trna-leu至cytb的間隔區(qū)序列和cytb至16srrna的間隔區(qū)序列：將步驟(1)中獲得的16srrna、co1和cytb基因的部分序列，以及公布的mtdna的trna-leu(cun)的序列設計引物，實現(xiàn)引物對sc擴增16srrna至co1的間隔區(qū)序列；引物對ly擴增trna-leu(cun)至cytb的間隔區(qū)序列；引物對ys擴增cytb至16srrna的間隔區(qū)序列；
(3)獲得co1至trna-leu間隔區(qū)的序列：根據(jù)步驟(1)中獲得的co1基因的部分序列和步驟(2)中獲得的trna-leu(cun)至cytb的間隔區(qū)的序列，設計引物對cl，實現(xiàn)擴增co1至trna-leu(cun)間隔區(qū)的序列；
(4)對步驟(1)、(2)和(3)中獲得的序列進行拼接，獲得隆頭魚mtdna基因組全序列。
其中，步驟(1)中所述16s的上游引物如seqidno.1所示、16s的下游引物如seqidno.2所示；所述co1的上游引物如seqidno.3所示、co1的下游引物如seqidno.4所示；所述cytb的上游引物如seqidno.5所示、cytb的下游引物如seqidno.6所示。
其中，步驟(2)中所述sc的上游引物如seqidno.7所示、sc的下游引物如seqidno.8所示；所述ly的上游引物如seqidno.9所示、ly的下游引物如seqidno.10所示；所述ys的上游引物如seqidno.11所示、ys的下游引物如seqidno.12所示。
其中，步驟(3)中所述cl的上游引物如seqidno.13所示、cl的下游引物如seqidno.14所示。
其中，所述步驟(1)中的每個擴增反應總體積為20ul，其中模板基因組dna100ng，每種dntp，每種引物各0.5ul；其中步驟(1)中的擴增反應為taqdna聚合酶0.25u，94℃預變性3min，94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。
其中，所述步驟(2)和(3)中的每個擴增反應總體積為20ul，其中模板基因組dna100ng，每種dntp，每種引物各0.5ul；步驟(2)和步驟(3)中的擴增反應為long-taqdna聚合酶，94℃預變性3min，94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸10min，共35個循環(huán)，最后在72℃延伸10min。
本發(fā)明的有益效果是可以快速、簡潔、準確和高效地測定隆頭魚mtdna基因組全序列。
附圖說明
圖1是3步引物設計和pcr擴增隆頭魚mtdna基因組全序列的方法所使用的引物位置，及擴增方向。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明：
實施例1
實驗材料
隆頭魚類群選擇三帶頸鰭魚作為代表種，樣本采自廣州沿海。
基因組dna提取
樣本基因組dna的提取，按照上海sangon的uniq－10柱式基因組dna提取試劑盒說明書操作，提取的dna用紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
引物設計
結(jié)合附圖，詳述本發(fā)明的引物設計和pcr擴增在隆頭魚mtdna基因組全序列測定方面的應用。第一步，根據(jù)公布的魚類mtdna相對保守的基因16srrna、co1和cytb的序列，用primerpremier6.0軟件和jellyfish1.4軟件，設計基因特異引物，進行pcr擴增和測序。第二步，依據(jù)已測序的序列和其他魚類公布的mtdna的trna-leu(cun)的序列，用primerpremier6.0軟件和jellyfish1.4軟件，設計特異引物擴增基因間隔區(qū)的序列，進行pcr擴增和測序。第三步，根據(jù)已測序的序列，設計特異引物擴增基因間隔區(qū)的序列，進行pcr擴增和測序。
所述pcr擴增的引物序列分別是：
16s的上游引物：agagaaagtaccgcaagggaaagc(seqidno.1)；
16s的下游引物：tcctgatccaacatcgaggtcgta(seqidno.2)；
co1的上游引物：ggctacaacccaccgcttaaacc(seqidno.3)；
co1的下游引物：agtctgagtatcgtcgaggcattcc(seqidno.4)；
cytb的上游引物：accaccgttgttattcaactacaagaac(seqidno.5)；
cytb的下游引物：ccgacttccggattacaagaccg(seqidno.6)。
sc的上游引物：aagcagatatgttaatcacctcctacagag(seqidno.7)
sc的下游引物：gccgaagaatcagaataagtgttggtag(seqidno.8)
ly的上游引物：acagctcatccgttggtcttagg(seqidno.9)
ly的下游引物：gaggtgtagtgtatggcgaggaa(seqidno.10)
ys的上游引物：cctcagtcctgtacttcttcctcttc(seqidno.11)
ys的下游引物：cgataggtctgtcaccgctactc(seqidno.12)
cl的上游引物：tttcaagccaaccacataac(seqidno.13)
cl的下游引物：cgaccccttcccagccaata(seqidno.14)
pcr擴增和測序
pcr擴增反應在德國eppendorf公司生產(chǎn)的
序列拼接和分析
pcr產(chǎn)物經(jīng)回收測序后，利用序列兩端的重疊序列，采用jellyfish軟件進行序列拼接，獲得隆頭魚中的三帶頸鰭魚(iniistiustrivittatus)的完整的mtdna基因組序列，全長16820bp，經(jīng)blastn軟件在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸序列相似性分析，與隆頭魚中的遠東擬隆頭魚(pseudolabruseoethinus)的mtdna基因組(登陸號:eu560728)全序列的相似性為73.5％，確認本方法獲得了一個新的、有效的隆頭魚mtdna基因組。
以上所述為本發(fā)明的較佳實施例而已，但本發(fā)明不應該局限于該實施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護的范圍。
sequencelisting
<110>上海海洋大學
<120>一種高效簡潔的隆頭魚類群線粒體基因組測定的方法
<130>
<160>14
<170>patentinversion3.3
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<213>人工序列
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