本發(fā)明屬于疾病臨床診斷領(lǐng)域，具體涉及一種通過分子生物學(xué)檢測手段診斷膀胱癌的技術(shù)，尤其涉及一種通過檢測fgfr3基因突變以診斷膀胱癌的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

膀胱尿路上皮癌是泌尿道的最常見的惡性腫瘤。癌發(fā)病率水平在全國32個腫瘤登記處的合計為6.69/10萬，占全部惡性腫瘤新發(fā)病例的2.52％。按性別統(tǒng)計，膀胱癌男、女性發(fā)病率分別為10.10/10萬和3.20/10萬，男性是女性的3.16倍。膀胱癌死亡率水平在全國32個腫瘤登記中為2.53/10萬，占全部惡性腫瘤死亡總數(shù)的1.47％。

fgfr3可導(dǎo)致酪氨酸激酶受體基因激活，觸發(fā)幾種下游激酶途徑，導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。是尿路上皮癌的最常見的突變，fgfr3突變被發(fā)現(xiàn)于80％的低度惡性膀胱性尿路上皮癌和20％的高度惡性膀胱尿路上皮癌中，總突變率為40-50％。現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)定為膀胱癌的驅(qū)動突變，其突變的檢測為膀胱癌的診斷提供了較好的目標(biāo)基因。

目前臨床上通過尿液進行膀胱癌的早期診斷的方法主要包括：尿液分析、尿脫落細(xì)胞分析，超聲、ct或mri成像等。特異性膀胱腫瘤標(biāo)志物是實現(xiàn)快速、便捷、檢測的重要手段，cn106093389a、cn103018461b等致力于通過血清學(xué)方法對尿樣進行檢測來診斷膀胱癌；cn104620109a、cn105779641a、cn105229169a等主要在基因水平通過檢測膀胱腫瘤標(biāo)志物診斷膀胱癌。

然而，現(xiàn)有技術(shù)中膀胱癌腫瘤標(biāo)記物眾多，各檢測指標(biāo)的檢測效果和檢出率變異較大。一方面，為使檢測結(jié)果具有臨床診斷意義，必須要綜合使用大量標(biāo)記物，但另一方面，應(yīng)用了大量標(biāo)記物不但費時耗力、價格昂貴，而且各標(biāo)記物的診斷結(jié)果之間往往不一致難以給出具有臨床價值的診斷結(jié)論。此較成熟的無創(chuàng)篩查和監(jiān)測膀胱癌尿基標(biāo)記物，如食品和藥物管理局(fda)批準(zhǔn)的immunocy，核基質(zhì)蛋白22，和熒光原位雜交(fish)具有較為確定的臨床診斷意義，然而仍需要更方便、快捷，臨床意義明確的診斷方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種臨床價值明確，操作簡單快捷、結(jié)果直觀可靠、以尿液為檢測材料的無創(chuàng)傷膀胱癌早期臨床診斷方法和試劑盒。

發(fā)明概述

一方面，本發(fā)明提供fgfr3基因的檢測試劑在制備膀胱癌診斷試劑盒中的應(yīng)用，其中所述fgfr3基因檢測試劑選自由以下組成的組：外顯子7的檢測試劑、外顯子10的檢測試劑和外顯子15的檢測試劑，優(yōu)選所述檢測試劑為實時熒光pcr試劑。

本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中針對每種外顯子的檢測試劑都包括一組探針和引物，所述探針包括供體探針和受體探針，其中供體探針3’端標(biāo)記有熒光供體，所述受體探針的5’端標(biāo)記有熒光受體、3’端進行磷酸化修飾；上游引物和下游引物分別位于探針結(jié)合位點的兩側(cè)。

本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中外顯子7的檢測試劑能夠檢測fgfr3基因外顯子7中248-249位點的突變，外顯子10的檢測試劑能夠檢測fgfr3基因外顯子10中366-379位點的突變，外顯子15的檢測試劑能夠檢測fgfr3基因外顯子15中650-653位點的突變。

本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中外顯子7的檢測試劑包括seqidno：1-2、外顯子10的檢測試劑包括seqidno：3-4、外顯子15的檢測試劑包括seqidno：5-6。

本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中外顯子7的檢測試劑還包括seqidno：7-8、外顯子10的檢測試劑還包括seqidno：9-10、外顯子15的檢測試劑還包括seqidno：11-12。

第二方面，本發(fā)明提供一種實時熒光pcr檢測試劑盒，其特征在于包括fgfr3基因檢測試劑，所述fgfr3基因檢測試劑選自由以下組成的組：外顯子7檢測試劑、外顯子10檢測試劑和外顯子15檢測試劑，優(yōu)選所述檢測試劑為實時熒光pcr試劑。

本發(fā)明所述試劑盒，其中針對每種外顯子的檢測試劑都包括一組探針和引物，所述探針包括供體探針和受體探針，其中供體探針3’端標(biāo)記有熒光供體，所述受體探針的5’端標(biāo)記有熒光受體、3’端進行磷酸化修飾；上游引物和下游引物分別位于探針結(jié)合位點的兩側(cè)。

本發(fā)明所述的試劑盒，其中外顯子7的檢測試劑能夠檢測fgfr3基因外顯子7中248-249位點的突變，外顯子10的檢測試劑能夠檢測fgfr3基因外顯子10中366-379位點的突變，外顯子15的檢測試劑能夠檢測fgfr3基因外顯子15中650-653位點的突變。

本發(fā)明所述的試劑盒，其中外顯子7的檢測試劑包括seqidno：1-2、外顯子10的檢測試劑包括seqidno：3-4、外顯子15的檢測試劑包括seqidno：5-6。

本發(fā)明所述的試劑盒，其中外顯子7的檢測試劑還包括seqidno：7-8、外顯子10的檢測試劑還包括seqidno：9-10、外顯子15的檢測試劑還包括seqidno：11-12。

發(fā)明詳述

除另有說明以外，本發(fā)明所用術(shù)語均是本領(lǐng)域常規(guī)的含義，對術(shù)語的解釋可參考例如薩姆布魯克等主編的《分子克隆(第三版)》。對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容進行詳述如下：

第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測fgfr3基因外顯子7中的248-249位點突變、外顯子10中366-379位點突變、外顯子15中650-653位點突變的試劑盒，所述試劑盒含有特異性識別fgfr3基因外顯子突變的熒光標(biāo)記探針。

本發(fā)明中，當(dāng)檢測fgfr3基因存在突變時，突變特異性探針與基因組dna特異性結(jié)合，而野生型dna則因為有單點的不配對，形成“泡”，從而顯示較低的熔點。

在膀胱癌fgfr3基因外顯子突變中，特異性fgfr3基因外顯子7的突變占50-80％，外顯子10占15-40％，外顯子15占5-10％。發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，三型突變之和約占膀胱癌fgfr3突變的99％。在此研究基礎(chǔ)上，可以實現(xiàn)對膀胱癌的精準(zhǔn)檢測。

根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒含有特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變、外顯子10中366-379位點突變、外顯子15中650-653位點突變或其組合的熒光標(biāo)記探針。

具體地，所述試劑盒可以只含有特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變的熒光標(biāo)記探針，可以只含有特異性識別fgfr3基因外顯子10中366-379位點突變的熒光標(biāo)記探針，也可以只含有特異性識別fgfr3基因外顯子15中650-653位點突變的熒光標(biāo)記探針，或者是同時含有特異性識別三種或其中兩型位點突變的熒光標(biāo)記探針。

本發(fā)明中，當(dāng)采用同時含有識別fgfr3特異性三型外顯子基因突變的三對熒光標(biāo)記探針時，相比采用單一的熒光標(biāo)記探針，其能夠大大增加對膀胱癌fgfr3基因外顯子突變的檢測效率，并提高檢測準(zhǔn)確率，使檢測準(zhǔn)確率接近99％。

根據(jù)本發(fā)明，所述熒光標(biāo)記探針含有供體探針和受體探針，例如特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變的供體探針，含有特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變的受體探針；特異性識別外顯子10中366-379位點突變的供體探針，特異性識別外顯子10中366-379位點突變的受體探針；含有特異性識別外顯子15中650-653位點突變的供體探針，特異性識別外顯子15中650-653位點突變的受體探針。

本發(fā)明中特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變的供體探針，其核苷酸序列含有如seqidno.1所示的片段，所述特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變的受體探針的核苷酸序列含有如seqidno.2所示的片段；

本發(fā)明中特異性識別fgfr3基因外顯子10中366-379位點突變的供體探針的核苷酸序列含有如seqidno.3所示的片段，所述特異性識別外顯子10中366-379位點突變的受體探針的核苷酸序列含有如seqidno.4所示的片段。

本發(fā)明中特異性識別fgfr3基因外顯子15中650-653位點突變的供體探針的核苷酸序列含有如seqidno.5所示的片段，所述特異性識別外顯子15中650-653位點突變的受體探針的核苷酸序列含有如seqidno.6所示的片段。

本發(fā)明中，所述seqidno.1-6熒光標(biāo)記探針含有的氨基酸序列優(yōu)選采用如下序列：

seqidno.1：5’-acagagcgctccccgcaccgg-flc-3’

seqidno.2：5’-lc640-atcctgcaggcggggctgccg-phos-3’

seqidno.3：5’-gagctggtggaggctgacgag-flc-3’

seqidno.4：5’-lc640-ggcagtgtgtatgcaggcatcc-phos-3’

seqidno.5：5’-gacccccacccccgcaccc-flc-3’

seqidno.6：5’-lc640-ggccgggctcacgttggtcgtcttc-phos-3’

此外本發(fā)明中特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變的核苷酸序列含有如seqidno.7-8所示的片段

本發(fā)明中特異性識別fgfr3基因外顯子10中366-379位點突變的核苷酸序列含有如seqidno.9-10所示的片段

本發(fā)明中特異性識別fgfr3基因外顯子15中650-653位點突變的核苷酸序列含有如seqidno.11-12所示的片段

本發(fā)明中含有的檢測fgfr3基因三型突變的特異性引物序列如下；

seqidno.7：5’-gagcgtcatctgcccc-3’

seqidno.8：5’-gtcactgcgtgtcggggt-3’

seqidno.9：5’-aggcctcaacgcccatgt-3’

seqidno.10：5’-gagcccaggcctttcttg-3’

seqidno.11：5’-aggcctcaacgcccatgt-3’

seqidno.12：5’-gagcccaggcctttcttg-3’

根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒含有檢測fgfr3的mastermix，例如還含有實時熒光定量pcr技術(shù)中涉及到的onetaqdna聚合酶、dntps。本發(fā)明中的mastermix試劑濃度和反應(yīng)參數(shù)均經(jīng)過優(yōu)化和驗證，并含有陽性和陰性對照dna樣本。

本發(fā)明中，所有試劑包括熒光標(biāo)記探針、特異性引物、pcr緩沖液和dntps(除酶之外)均已混合，作為“主液”，不需要單獨配制，極大地方便用戶操作。

本發(fā)明中所述mastermix為4×濃度，其包括優(yōu)化后的pcr反應(yīng)所需緩沖液、dntps和onetaqdna聚合酶。

根據(jù)本發(fā)明，所述dntps的濃度為0.05-1μm，例如可以是0.05μm、0.06μm、0.08μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1μm，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

本發(fā)明中，所述dntps的濃度優(yōu)選為0.1-0.8μm，進一步優(yōu)選為0.2μm。

根據(jù)本發(fā)明，所述dna聚合酶的濃度為0.5-8u/mg，例如可以是0.5u/mg、0.6u/mg、0.7u/mg、0.8u/mg、1u/mg、1.2u/mg、1.5u/mg、2u/mg、2.5u/mg、3u/mg、3.5u/mg、4u/mg、4.5u/mg、5u/mg、5.5u/mg、6u/mg、6.5u/mg、7u/mg、7.5u/mg或8u/mg，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

本發(fā)明中，所述dna聚合酶優(yōu)選為onetaqdna聚合酶，其濃度優(yōu)選為0.5-8u/mg，進一步優(yōu)選為1.5u/mg。

根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒還含有介紹該試劑盒的使用說明書。

第二方面，本發(fā)明提供了一種利用如第一方面所述的用于檢測fgfr3基因突變的試劑盒在非疾病診斷和治療目的中檢測fgfr3基因突變的方法，其包括以下步驟：

(1)從篩選的病例尿液樣本中離心提取尿液細(xì)胞；

(2)從尿液細(xì)胞中提取全基因組dna5-20ng，利用含有seqidno.7-8，seqidno.9-10，seqidno.11-12所示片段的特異性引物對所述模板dna進行實時pcr擴增；

(3)將步驟(2)擴增后的片段分別加入含有如seqidno.1-2，seqidno.3-4，seqidno.5-6所示片段的熒光標(biāo)記探針或其混合物中進行加溫熔解；

(4)通過得到的pcr產(chǎn)物的熔解曲線來判斷fgfr3基因的突變情況。

根據(jù)本發(fā)明，所述檢測fgfr3基因外顯子突變的方法主要用于膀胱癌的診斷和治療，在具體檢測時，可以從尿液離心沉淀細(xì)胞中檢測fgfr3基因外顯子7、10、15的特異性突變，也可以是從膀胱組織活檢標(biāo)本中實現(xiàn)對fgfr3基因外顯子7、10、15的特異性突變的檢測，對于檢測樣品以及模板dna的來源也可以采用其它途徑。

本發(fā)明中，步驟(1)所述待測樣品優(yōu)選為尿液細(xì)胞離心沉淀物和/或膀胱組織，因此，所述模板dna優(yōu)選來自于尿液細(xì)胞沉淀物和/或膀胱組織活檢標(biāo)本。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述實時pcr擴增的條件為：

(a)95℃預(yù)變性4min，1循環(huán)；

(b)94℃變性20s、58℃退火20s、68℃延伸40s，50個循環(huán)；

(c)37℃延伸30s，1循環(huán)。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述加溫熔解的條件為：95℃1min，62℃30s，45℃30s，40℃2min，再以0.1℃/秒的速度升高至70℃。

本發(fā)明中，所述試劑盒由特異性dna引物和熒光標(biāo)記的激發(fā)探針與被激發(fā)探針構(gòu)成，被激發(fā)探針3’磷酸化以防止其延伸，在pcr反應(yīng)過程中，如無目標(biāo)點突變，則探針與dna100％互補，從而表現(xiàn)為一定的溫度融解。

根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)所述判斷fgfr3基因的突變情況的方法為：

當(dāng)預(yù)測熔點(55.7℃)±1℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔融曲線峰，則待測樣品含有fgfr3三型突變之一或其組合的細(xì)胞克隆。

當(dāng)預(yù)測熔點(52.8℃)±1℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔融峰，而(55.7℃)±1℃缺乏熔融曲線峰時，則待測樣本為含有野生型細(xì)胞群。

當(dāng)兩個熔融曲線峰存在，分別位于(55.7℃)±1℃和(52.8℃)±1℃，則待測樣本含有混合細(xì)胞群，即含有相應(yīng)突變克隆，三型突變以及野生型非突變細(xì)胞。

第三方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的用于檢測fgfr3基因外顯子三型突變的試劑盒在用于非疾病診斷和治療目的的檢測fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變、外顯子10中366-379位點突變、外顯子15中650-653位點突變或其組合突變中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相此，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)三型突變的組合，覆蓋率高，有效彌補了單一靶標(biāo)熒光定量pcr的不足。經(jīng)驗證，fgfr3基因外顯子三型突變的組合，即外顯子7中248-249位點突變、外顯子10中366-379位點突變、外顯子15中650-653位點突變，在膀胱癌群體中的陽性率超過了90％，而假陽性率僅在6％左右，針對上述位點進行檢測能夠有效的實現(xiàn)膀胱癌的篩選。

(2)融合了普通熒光pcr檢測和多重?zé)晒鈖cr檢測的優(yōu)點。引物探針的設(shè)計中采用了相同的熒光標(biāo)記方案，同時使擴增產(chǎn)物大小相似，既避免了多重?zé)晒鈖cr中采用多種熒光的技術(shù)復(fù)雜性，又確保了對多種靶標(biāo)的同時檢測。只要三個外顯子中任意一個攜帶突變，就能獲得陽性結(jié)果。

(3)結(jié)果判斷簡單、明確。由于本申請雖然針對三個外顯子靶標(biāo)進行檢測，三個外顯子靶標(biāo)中1個、2個或3個存在突變都表現(xiàn)為陽性結(jié)果，沒有突變則為陰性結(jié)果。不需要對每個靶標(biāo)的檢測結(jié)果引入復(fù)雜的結(jié)果分析模型進行分析即可做出診斷，特別適用于快速篩查。

附圖說明

圖1：為本發(fā)明試劑盒檢測原理圖。

圖2：陽性對照樣本(膀胱癌細(xì)胞系)的檢測結(jié)果，出現(xiàn)55.7℃的熔融曲線峰。

圖3：正常尿液樣本檢測結(jié)果，出現(xiàn)52.8℃的熔融曲線峰。

圖4：早期膀胱癌患者尿液樣本檢測結(jié)果，形成兩個分別對應(yīng)55.7℃、52.8℃的熔融曲線峰。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1

用于檢測fgfr3基因外顯子7突變的試劑盒，其包括：

(1)特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變的熒光標(biāo)記探針，其供體探針和受體探針的核苷酸序列如下：

248-249位點突變的供體探針：5’-acagagcgctccccgcaccgg-flc-3’

248-249位點突變的受體探針：5’-lc640-atcctgcaggcggggctgccg-phos-3’

(2)檢測fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變的特異性引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5’-gagcgtcatctgcccc-3’

下游引物：5’-gtcactgcgtgtcggggt-3’

(3)mastermix，其包括：1pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶和10ng的dna模板；

(4)使用說明書一份。

實施例2

用于檢測fgfr3基因外顯子10中366-379位點突變的試劑盒，其包括：

(1)特異性識別fgfr3基因外顯子10中366-379位點突變的熒光標(biāo)記探針，其供體探針和受體探針的核苷酸序列如下：

366-379位點突變的供體探針：5’-gagctggtggaggctgacgag-flc-3’

366-379位點突變的受體探針：5’-lc640-ggcagtgtgtatgcaggcatcc-phos-3’

(2)檢測fgfr3基因外顯子10中366-379位點突變的特異性引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5’-aggcctcaacgcccatgt-3’

下游引物：5’-gagcccaggcctttcttg-3’

(3)mastermix，其包括：1pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶和10ng的dna模板；

(4)使用說明書一份。

實施例3

用于檢測fgfr3基因外顯子15中650-653位點突變的試劑盒，其包括：

(1)特異性識別fgfr3基因外顯子15中650-653位點突變的熒光標(biāo)記探針，其供體探針和受體探針的核苷酸序列如下：

650-653位點突變的供體探針：5’-gacccccacccccgcaccc-flc-3’

650-653位點突變的受體探針：5’-lc640-ggccgggctcacgttggtcgtcttc-phos-3’

(2)檢測fgfr3基因外顯子15中650-653位點突變的特異性引物，其核苷酸序列如下：

上游引物：5’-aggcctcaacgcccatgt-3’

下游引物：5’-gagcccaggcctttcttg-3’

(3)mastermix，其包括：1pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶和10ng的dna模板；

(4)使用說明書一份。

實施例4

聯(lián)合檢測fgfr3基因外顯子7、10、15突變的試劑盒。

(1)特異性識別fgfr3基因外顯子7中248-249位點突變、外顯子10中366-379位點突變、外顯子15中650-653位點突變的熒光標(biāo)記探針。

外顯子7中第248-249位點突變的供體探針：5’-acagagcgctccccgcaccgg-flc-3’；

外顯子7中第248-249位點突變的受體探針：5’-lc640-atcctgcaggcggggctgccg-phos-3’；

外顯子10中第366-379位點突變的供體探針：5’-gagctggtggaggctgacgag-flc-3’；

外顯子10中第366-379位點突變的受體探針：5’-lc640-ggcagtgtgtatgcaggcatcc-phos-3’；

外顯子15中第650-653位點突變的供體探針：5’-gacccccacccccgcaccc-flc-3’；

外顯子15中第650-653位點突變的受體探針：5’-lc640-ggccgggctcacgttggtcgtcttc-phos-3’；

所述6種熒光標(biāo)記探針混合包裝于同一容器中。

(2)同時擴增fgfr3基因外顯子7、10、15突變片段的試劑盒。

外顯子7突變片段上游引物：5’-gagcgtcatctgcccc-3’

外顯子7突變片段下游引物：5’-gtcactgcgtgtcggggt-3’

外顯子10突變片段上游引物：5’-aggcctcaacgcccatgt-3’

外顯子10突變片段下游引物：5’-gagcccaggcctttcttg-3’

外顯子15突變片段上游引物：5’-aggcctcaacgcccatgt-3’

外顯子15突變片段下游引物：5’-gagcccaggcctttcttg-3’

所述三對引物混合包裝于同一容器中。

(3)mastermix，其包括：1pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶和10ng的dna模板；

(4)使用說明書一份。

實施例5

利用實施例1-4的試劑盒檢測fgfr3基因點突變進行檢測，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的尿液，離心提取尿液細(xì)胞，提取細(xì)胞全dna，利用含有特異性引物對模板dna進行實時pcr擴增；

pcr擴增反應(yīng)體系如下：1pcr緩沖液、0.2μm的dntps、1.5u/mg的onetaqdna聚合酶、10ng的dna模板、特異性引物、供體探針和受體探針；

pcr反應(yīng)條件如下：

(2)將步驟(1)擴增后的片段加入特異性熒光標(biāo)記探針進行加溫熔解；

加溫熔解反應(yīng)條件如下：

(3)通過得到的pcr產(chǎn)物的熔解曲線來判斷fgfr3基因的位點突變情況。

檢測原理如圖1所示，從圖1可以說明當(dāng)檢測fgfr3存在位點突變時，突變特異性探針與基因組dna特異性結(jié)合，而野生型dna則因為有單點的不配對，而形成“泡”，從而顯示較低的熔點。

檢測結(jié)果如圖2-4所示，如果目的基因fgfr3上存在上述點突變，探針與擴增產(chǎn)物之間完全配對熔解溫度較高，為55.7℃；如果目的基因fgfr3無上述點突變存在，則在探針與dna之間出現(xiàn)單個非互補鹼基，融解溫度較低，為52.8℃。如果同時出現(xiàn)55.7℃的熔解峰和52.8℃的熔解峰，則表明樣本中即存在fgfr3上述位點的發(fā)生突變的癌變細(xì)胞，也存在fgfr3上述位點未發(fā)生突變的野生型正常細(xì)胞。

實施例6：

臨床樣本雙盲篩檢測

采集68例臨床確診患有早期膀胱癌患者的尿液樣本，以30例正常人體檢留存尿液樣本作為對照，進行檢測。以實施例1的試劑盒進行檢測，檢出55例陽性樣本，檢出率為80.88％；以實施例2的試劑盒進行檢測，檢出8例陽性樣本，檢出率為11.76％；以實施例3的試劑盒進行檢測，檢出6例陽性樣本，檢出率為8.22％。

以實施例4的試劑盒進行檢測，檢出62例陽性樣本，綜合檢出率為91.18％；30個正常樣本中2例檢出陽性，假陽性率約為3.23％。上述結(jié)果表明，同時對fgfr3基因外顯子7、10、15的突變進行檢測是最優(yōu)選的技術(shù)方案，檢出率高、假陽性率低特別適合于膀胱癌的臨床篩查。

上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍，本發(fā)明的保護范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。

序列表

<110>申請人名稱

<120>一種檢測fgfr3基因突變以診斷膀胱癌的方法及試劑盒

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

acagagcgctccccgcaccgg21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

atcctgcaggcggggctgccg21

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gagctggtggaggctgacgag21

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggcagtgtgtatgcaggcatcc22

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gacccccacccccgcaccc19

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ggccgggctcacgttggtcgtcttc25

<210>7

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gagcgtcatctgcccc16

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

gtcactgcgtgtcggggt18

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

aggcctcaacgcccatgt18

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gagcccaggcctttcttg18

<210>11

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

aggcctcaacgcccatgt18

<210>12

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gagcccaggcctttcttg18