技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于基因診斷領(lǐng)域，具體涉及一種人類hla區(qū)域基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：
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人類白細(xì)胞抗原(hla)基因位于人類第6號(hào)染色體短臂，是目前發(fā)現(xiàn)的人體多態(tài)性最高的基因。hla基因分成三類：ⅰ類、ⅱ類和ⅲ類基因。其中，ⅰ類包括：hla-a、hla-b、hla-c基因；ⅱ類包括：hla-drb1、hla-dqb1、hla-dpa1、hla-dpb1基因。hla系統(tǒng)是目前所知人體最復(fù)雜的多態(tài)系統(tǒng)。自1958年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)hla抗原，到20世紀(jì)70年代，hla便成為免疫遺傳學(xué)、免疫生物學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的一個(gè)重要新興研究領(lǐng)域。現(xiàn)在，已基本弄清其系統(tǒng)的組成、結(jié)構(gòu)和功能，闡明了其理化性質(zhì)和生物學(xué)作用。這些研究成果不僅具有重要的理論意義，而且具有巨大的生物醫(yī)學(xué)價(jià)值。

2016年全國(guó)出生人數(shù)達(dá)1650萬(wàn)，隨著計(jì)劃生育政策的改變，預(yù)計(jì)2017年新生兒數(shù)量可達(dá)2000萬(wàn)，按照15％～20％的自然流產(chǎn)發(fā)生率來(lái)估算，到2017年我國(guó)發(fā)生自然流產(chǎn)的孕婦可達(dá)300萬(wàn)到400萬(wàn)人次。習(xí)慣性流產(chǎn)是指連續(xù)自然流產(chǎn)三次及三次以上者，自然流產(chǎn)者當(dāng)中約1％為習(xí)慣性流產(chǎn)。目前，我國(guó)育齡夫妻每8對(duì)夫妻當(dāng)中有一對(duì)就有不孕不育的情況出現(xiàn)，根據(jù)中國(guó)婦聯(lián)報(bào)道數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)不孕不育患者數(shù)量已經(jīng)超過5000萬(wàn)，不孕不育的原因很多，如染色體異常、內(nèi)分泌失調(diào)、生殖器官解剖結(jié)構(gòu)異常、細(xì)菌或病毒感染、母嬰血型不合、環(huán)境污染等，其中由染色體異常導(dǎo)致的約占15％，故而在發(fā)生自然流產(chǎn)的原因中，染色體異常是其中一個(gè)重要的原因。在發(fā)生習(xí)慣性流產(chǎn)的病例中，夫妻雙方或一方或胚胎染色體異常所致的流產(chǎn)，hla區(qū)域拷貝數(shù)異常是比較重要的原因，因此，需要做hla基因區(qū)域內(nèi)的異常檢測(cè)。

在hla區(qū)域，共有4個(gè)主要位點(diǎn)a，b，c，d//dr，大量證據(jù)表明：習(xí)慣性流產(chǎn)的夫婦具有共同hla抗原的頻率較正常對(duì)照組顯著增高，并發(fā)現(xiàn)與習(xí)慣性流產(chǎn)的抗原主要表現(xiàn)在hla-d傘點(diǎn)上；配偶間d/dr抗原的相容性越高，習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生率也越大。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)夫婦高度共有hla-a，hla-b位點(diǎn)時(shí)，習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)生率也明顯高于正常對(duì)照組。目前，雖然pcr、高通量測(cè)序等拷貝數(shù)變異檢測(cè)技術(shù)一直在發(fā)展，但是由于hla區(qū)域dna排列順序的特殊性以及gc含量特征，不是任何一種拷貝數(shù)變異檢測(cè)技術(shù)都適合，為此，針對(duì)hla區(qū)域拷貝數(shù)變異檢測(cè)的技術(shù)，申請(qǐng)人提供一種人類hla區(qū)域基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的旨在應(yīng)用于習(xí)慣性流產(chǎn)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提供一種人類hla區(qū)域基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法，對(duì)即將要孩子的夫妻進(jìn)行生育風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警以及發(fā)生習(xí)慣性流產(chǎn)的患者找出病因，為產(chǎn)前診斷以確保優(yōu)生優(yōu)育具有重要作用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

一種人類hla區(qū)域基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)采集人的組織、血液或其他體液基因組作為樣品，將樣品與cytoscanhd芯片進(jìn)行雜交，雜交完成后對(duì)芯片進(jìn)行洗滌，然后在gcd3000系統(tǒng)的數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)中進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，生成cel文件；

(2)將cel文件輸入chas軟件進(jìn)行初級(jí)質(zhì)控，將質(zhì)控合格的芯片生成的cychp文件導(dǎo)入chas軟件，根據(jù)拷貝數(shù)特征、marker數(shù)量以及cnvgain和cnvloss片段大小三個(gè)指標(biāo)篩選出目的marker。

進(jìn)一步地，步驟(1)中采集的樣品與cytoscanhd芯片進(jìn)行雜交之前經(jīng)過標(biāo)本采集、外周血基因組提取、dna濃度與純度測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢基因組dna獲得質(zhì)控良好的基因組dna。

進(jìn)一步地，將上述質(zhì)控良好的基因組dna經(jīng)過酶切、連接、擴(kuò)增、片段化并進(jìn)行標(biāo)記后，將通過質(zhì)控的dna與芯片進(jìn)行雜交，優(yōu)選地，雜交條件為50℃60r/min，雜交時(shí)間為16～18h。

進(jìn)一步地，步驟(2)中導(dǎo)入chas軟件的cnv片段大小以及marker數(shù)報(bào)告閾值設(shè)置為全區(qū)間。

本發(fā)明人類hla區(qū)域基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法，運(yùn)用cytoscanhd芯片精確檢測(cè)拷貝數(shù)變異的能力和結(jié)合chas軟件直觀且簡(jiǎn)化的分析流程，并通過對(duì)chas軟件區(qū)間的特定設(shè)置，可以更加合理和準(zhǔn)確地檢測(cè)出hla-a、hla-b、hla-c、hla-d//dr的位點(diǎn)，由芯片雜交結(jié)果分析得到目的基因序列數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明的方法大大提高了檢測(cè)hla區(qū)域拷貝數(shù)變異的準(zhǔn)確率，得到的數(shù)據(jù)更加可靠、真實(shí)，為預(yù)防習(xí)慣性流產(chǎn)和產(chǎn)前診斷得到了重要的保障。

附圖說(shuō)明：

圖1是本發(fā)明人類hla區(qū)域基因拷貝數(shù)變異檢測(cè)方法的分析流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例中芯片雜交圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中chas軟件分析結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

實(shí)施例1對(duì)已知習(xí)慣性流產(chǎn)被檢測(cè)者的基因組樣品進(jìn)行hla區(qū)域基因拷貝數(shù)變異的檢測(cè)

被檢測(cè)者情況簡(jiǎn)介：

張某，男，腸道有輕度炎癥、維生素d中度缺乏、機(jī)體代謝失衡(碳水化合物代謝、三羧酸循環(huán)代謝及神經(jīng)遞質(zhì)代謝、脂肪酸代謝失衡)、機(jī)體內(nèi)維生素b族不足、缺乏運(yùn)；無(wú)相關(guān)疾病家族遺傳史；

張某某，女，被蟲蚊叮咬易起打包，難消掉；營(yíng)養(yǎng)不良、亞臨床甲減、腸道炎癥(菌群紊亂、食物不耐受等級(jí))、活細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)分析顯示(維生素b族、維生素d中度缺乏；鋅、鉻缺乏，導(dǎo)致胰島素抵抗，敏感性下降；整體抗氧化能力下降)；機(jī)體代謝失衡(碳水化合物代謝、三羧酸循環(huán)代謝、神經(jīng)遞質(zhì)代謝、脂肪酸代謝、肝臟解毒功能及腸道真菌或酵母菌感染等)、肝膽需要營(yíng)養(yǎng)支持；無(wú)相關(guān)疾病家族史；

第一次懷孕，胎兒3個(gè)月后監(jiān)測(cè)不到胎心，流掉；第二次懷孕，全程孕期檢測(cè)全做，無(wú)任何異常指標(biāo)，足月生產(chǎn)后，孩子患有先心病，部分肺靜脈異位引流，未能下手術(shù)臺(tái)；第三次懷孕，孕酮低，一個(gè)月后流產(chǎn)。

如圖1所示，具體操作如下：

(一)標(biāo)本采集

外周靜脈血5ml至edta抗凝管；

(二)外周血基因組提取

按照qiagen全基因組核酸提取試劑盒使用說(shuō)明，對(duì)外周血樣本提取基因組dna；

按照puregenedna提取試劑盒使用說(shuō)明對(duì)羊水細(xì)胞提取基因組dna。

外周血樣本dna提取具體步驟如下：

1.按樣本編號(hào)排好ep離心管，并標(biāo)記；

2.向每個(gè)1.5ml的ep管中加入pk酶溶液20ul，然后分別加入臍血、外周血和含生理鹽水的絨毛樣本200ul；

3.向每個(gè)ep管中加入蛋白酶k液200ul，蓋好ep管蓋，在漩渦振蕩器上振蕩15秒，隨后瞬時(shí)離心；

4.將各ep管放入懸浮泡沫孔中，置56℃水浴箱10-30min，期間可適當(dāng)翻轉(zhuǎn)；

5.取出各離心管，瞬時(shí)離心后，向各管中加入無(wú)水乙醇200ul，振蕩混勻15秒，瞬時(shí)離心；

6.將ep管中的酶解混合物轉(zhuǎn)移至q柱上，8000rpm，離心1分鐘；

7.換廢液收集管，加aw1液500ul，8000rpm，離心1分鐘；

8.換廢液收集管，加aw2液500ul，13000rpm，離心3分鐘；

9.將q柱轉(zhuǎn)移至新標(biāo)記好的1.5ml離心管中，加入60ulae液，室溫靜置10分鐘后，8000rpm，離心1分鐘；

10.丟棄q柱，將dna留置于ep管中。

(三)dna濃度與純度測(cè)定

取2uldna提取液，根據(jù)nanodrop公司的nd-1000型紫外分光光度計(jì)的操作說(shuō)明測(cè)定dna的濃度與純度，記錄測(cè)定值后余dna溶液放置于-20℃冰箱中備用。(注：dna濃度介于50～100ng/ul，且純度介于1.8～2.0。)

(四)瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢基因組dna

1.配制濃度2％瓊脂糖：用電子天平秤0.8g瓊脂糖，放入一個(gè)潔凈的三角燒瓶中，加入40ml0.5*tbe，置微波爐中加熱使其溶解至透亮后取出。

2.制備凝膠板：將底板放入水平放置的制膠所用的模板中，垂直對(duì)應(yīng)插槽插入梳子；待凝膠冷卻至50-60℃時(shí)，向其中加入3ulgoldview，充分搖勻后，將凝膠液緩慢倒入凝膠板上，室溫靜置30-40分鐘，至凝膠完全凝固；然后將凝膠板上的梳子垂直拔出，將凝膠板放入裝有足夠0.5*tbe的電泳槽(中點(diǎn)樣端朝向電泳槽的陰極)。

3.點(diǎn)樣：按順序用移液器取2ul樣本dna于干凈的點(diǎn)樣板上，再分別加入1ul電泳加樣緩沖液，用移液器吹打混勻后，依次加2％瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。

4.電泳：加完樣本后，接通電源，電壓120mv左右，觀察染料與加樣孔的距離適時(shí)終止。

5.觀察結(jié)果：將完成電泳的凝膠板放入凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察dna條帶，并拍照記錄。

(五)基因芯片實(shí)驗(yàn)

1.根據(jù)affymetrix公司提供的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作流程對(duì)樣本dna進(jìn)行消化、連接、擴(kuò)增、純化、片段化、標(biāo)記信號(hào)、與芯片雜交及洗滌、染色與掃描芯片操作。

基因組dna的準(zhǔn)備：根據(jù)所測(cè)定的dna濃度與純度值，若濃度低10ng/ul應(yīng)放棄使用，或重新提??；高于100ng/ul可加相應(yīng)的溶液稀釋至50ng/ul左右使用。使用前將每個(gè)樣本分裝15ul至新的ep管中，并作標(biāo)記作為本次實(shí)驗(yàn)用。只有濃度、純度和電泳質(zhì)檢均合格的dna樣本才能進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)操作。

2.限制性內(nèi)切酶消化：

1)將5ul基因組dna加入已標(biāo)記的孔板中；

2)將10xnspⅰbuffer和100xbsa在室溫下解凍，震蕩混勻離心后置冰盒中；nspi一直保持在-20℃冰箱直到使用前將其取出，震蕩一次，瞬時(shí)離心；

3)取1.5mlep管，標(biāo)記后放置在冰塊上，向其中加入affymetrixnuclease-freewater110.9ul、10xnspibuffer19.2ul、100xbsa1.9ul、nspi9.6ul，共141.6ul消化混合液；

4)高速震蕩ep管中的消化混合液3次，每次持續(xù)1s，瞬時(shí)離心；

5)將混合液分裝至已標(biāo)記的8聯(lián)管中，每管大約分裝16.3ul，瞬時(shí)離心；

6)用排槍從8聯(lián)管中吸取14.75ul混合液加入已有樣本dna的孔板中，此時(shí)每份樣本的總?cè)萘繛?9.75ul；

7)對(duì)pcrsystem9700進(jìn)行預(yù)熱；

8)用塑料封膜將孔板密封；分5部分高速震蕩孔板，每部分持續(xù)1s；

9)離心，2000rpm，1min；

10)把孔板放入pcr儀中，運(yùn)行cytoscandigest程序：37℃，2h；65℃，20min；4℃，維持。

3.連接反應(yīng)：

1)從pcr儀上取下孔板，確?？装迕芊馔旰?，2000rpm離心1min；

2)取1.5mlep管，標(biāo)記后放置在冰塊上；

3)準(zhǔn)備連接反應(yīng)混合液：吸取預(yù)先準(zhǔn)備好的10xt4dnaligasebuffer25ul、50μmadaptornspi7.5ul,t4dnaligase20ul于ep管中，高速震蕩、瞬時(shí)離心；

4)將混合液分裝至已標(biāo)記的8聯(lián)管中，每管約6.3ul，瞬時(shí)離心后，用10ul排槍從8聯(lián)管中吸取5.25ul連接反應(yīng)混合液至相應(yīng)的樣本孔板中，此時(shí)每份樣本的總?cè)萘繛?5ul；

5)預(yù)熱pcr儀，密封孔板，充分震蕩混勻樣本中的液體，離心，2000rpm，1min；

6)運(yùn)行cytoscanligate程序：16℃，3h；70℃，20min；4℃，維持。(注：若不能繼續(xù)pcr反應(yīng)，可把樣本放置-20℃保存。)

4.pcr反應(yīng)：

1)從pcr儀上取下孔板，確?？装迕芊馔旰?，離心2000rpm，1min；

2)稀釋連接反應(yīng)產(chǎn)物：向每份產(chǎn)物中加入75ulchillednuclease-freewater；

3)密封孔板；高速震蕩孔板，離心，2000rpm，1min；

4)從每份樣本中吸取10ul稀釋液，對(duì)應(yīng)加入新標(biāo)記的4排8聯(lián)pcr孔板中，每孔均為10ul，共從每份樣本中移取40ul稀釋液(注：原孔板中剩下的樣本可密封放-20℃保存，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束)；

5)配置pcr反應(yīng)混合液：除酶以外的所有試劑均預(yù)先解凍混勻準(zhǔn)備好，將15ml離心管放在冰塊上，向其中加入nuclease-freewater1453.6ul，10xtitaniumtmtaqpcrbuffer368.0ul,gc-meltreagent736.0ul，dntpmixture515.2ul,pcrprimer002165.6ul，50xtitaniumtmtaqdna聚合酶73.6ul，總共混合液3312.0ul，震蕩混勻；

6)將pcr反應(yīng)混合液加入加樣槽中，使用100ul排槍向每份樣本加90ul混合液，共轉(zhuǎn)移4次，此時(shí)每孔的總?cè)萘繛?00ul；

7)密封pcr孔板，充分震蕩，離心2000rpm，1min；

8)將密封后的孔板置于冰塊上，進(jìn)入post-pcr室；

9)確保pcr儀已預(yù)熱；把孔板放入pcr儀上，運(yùn)行cytoscanpcr程序：94℃3min；(94℃30s，60℃45s，68℃15s)×30個(gè)循環(huán)；68℃7min；4℃維持(pcr反應(yīng)完樣本可放置于4℃保存)。

5.pcr產(chǎn)物電泳質(zhì)檢：

1)分裝5ulnuclease-freewater至已標(biāo)記的新8聯(lián)管中；

2)從每個(gè)樣本的pcr反應(yīng)產(chǎn)物中轉(zhuǎn)移3ul產(chǎn)物至相應(yīng)的8聯(lián)管中；

3)密封8聯(lián)管，震蕩混勻，離心；

4)把全部的8ul稀釋pcr產(chǎn)物與loadingbuffer混合后在2％的凝膠上進(jìn)行電泳；電泳結(jié)果大部分產(chǎn)物片段應(yīng)在150-2000bp之間，合格后進(jìn)行以下步驟，否則重做。

6.pcr產(chǎn)物純化反應(yīng)：

1)將每個(gè)樣本的四份pcr產(chǎn)物均完全轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的1.5mlep管中；

2)混勻磁珠，加720ul純化磁珠至每份樣本中；

3)確保每個(gè)ep管已蓋緊，上下顛倒10次以充分混合，室溫孵育10min；

4)ep管蓋的尖端朝外，以最大的速度16100rcf，離心3min；

5)置ep管于磁力架上，吸去上清液而不要觸碰磁珠，丟棄上清液至廢液缸；

6)用1000ul移液器吸取1.0mlpurificationwashbuffer加入ep管中(注意：在purificationwashbuffer使用之前確保已加入45ml無(wú)水乙醇)；

7)蓋好ep管蓋，放入泡沫振蕩器，以最大速度震蕩2min；

8)離心，ep管蓋尖端朝外，16100rcf，3min；

9)將ep管置于磁力架上，等磁珠吸附完全時(shí)，移走上清液而不要觸碰到磁珠，丟棄上清液；

10)使ep管蓋尖端朝外16100rcf離心30s，隨后把ep管放回磁力架上；

11)使用20ul移液器，完全移走每個(gè)ep管底部的液體；

12)把每個(gè)ep管從磁力架上移至空的架子上，打開每個(gè)管蓋，室溫靜置10min，使管中剩余的液體蒸發(fā)；

13)使用200ul移液器，加52ulelutionbuffer至每個(gè)ep管，使液體直接加到磁珠上；

14)蓋上ep管，置泡沫振蕩器上，以最大的速度震蕩10min使磁珠懸??；如果磁珠沒有完全懸浮，輕彈ep管使磁珠離開管壁，額外再震蕩2min；

15)離心，ep管蓋尖端朝外，16100rcf，3min；

16)把ep管放回磁力架上10min，靜置，直到所有的磁珠均吸附在管壁的一側(cè)；

17)轉(zhuǎn)移47ul洗脫后的樣本至一排新的已標(biāo)記的孔板上；

18)密封孔板，高速震蕩孔板混勻樣本，離心，2000rpm1min(注：若不連續(xù)做以下的操作，可置樣本于-20℃保存)

7.對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行定量分析：

1)分裝18ulnuclease-freewater至新的已標(biāo)記的8聯(lián)管中；

2)從每份純化樣本中轉(zhuǎn)移2ul至相應(yīng)的8聯(lián)管中；

3)密封8聯(lián)管，震蕩，離心；

4)使用nanodrop分光光度計(jì)測(cè)量稀釋后純化樣本的濃度和純度：用nuclease-freewater空白對(duì)照后，取2ul稀釋后的樣本測(cè)量其在320nm處的od值；

5)評(píng)估od值：平均純化產(chǎn)物od值應(yīng)該大于等于300ng/ul，如果小于250ng/ul則不建議進(jìn)行以下的步驟；od260/280比值應(yīng)介于1.8-2.0之間；od320應(yīng)盡量接近0。

8.片段化反應(yīng)：

1)預(yù)冷離心機(jī)至4℃，預(yù)熱pcr儀；

2)將純化、定量后的樣本從-20℃冰箱中取出，室溫解凍后，確?？装迕芊猓鹗?、離心，把孔板置冰塊上；

3)直到使用前fragmentationreagent一直放置在-20℃，其他所有試劑使用之前均已溶解，震蕩混勻后置于冰塊上，操作均在冰上進(jìn)行；

4)取1.5mlep管，并作標(biāo)記，根據(jù)片段化試劑管標(biāo)簽上的濃度配制片段化混合液于ep管中；

5)高速震蕩混勻混合液3次，每次持續(xù)1s；

6)將ep管中的片段化混合液分裝到8聯(lián)管中，每管36ul，使用移液器從8聯(lián)管中轉(zhuǎn)移10ul片段化混合液至每份樣本，此時(shí)每個(gè)樣本的總?cè)萘繎?yīng)為55ul；

7)使用塑料膜密封孔板，充分震蕩混勻；

8)在已經(jīng)預(yù)冷的離心機(jī)離心，2000rpm，1min；

9)確保pcr儀已經(jīng)預(yù)熱，把孔板放入pcr儀中，運(yùn)行cytoscanfragment程序：37℃35min，95℃15min，4℃保存。

9.片段化產(chǎn)物電泳質(zhì)檢：

1)離心樣本后，從孔板中轉(zhuǎn)移每個(gè)已經(jīng)片段化的樣本4ul至8聯(lián)管中，并作標(biāo)記；

2)向8聯(lián)管的每份樣本中加入28ulnuclease-freewater，密封8聯(lián)管，震蕩混勻、離心；

3)從8聯(lián)管中取8ul稀釋后的片段化樣本在4％的凝膠上進(jìn)行電泳，5v/cm電泳45min；

4)核查電泳結(jié)果，平均片段化產(chǎn)物長(zhǎng)度應(yīng)在25-125bp之間。若此步質(zhì)檢結(jié)果良好，則進(jìn)行下一步驟；若片段化產(chǎn)物長(zhǎng)度不符合要求，則不建議進(jìn)行下一步。

10.標(biāo)記反應(yīng)：1)把5xtdtbuffer和30mmdnalabelingreagent在室溫解凍后震蕩3次，每次1s，瞬時(shí)離心后放置于冰上；tdtenzyme一直放置在-20℃，直到使用時(shí)從冰箱中取出，快速震蕩、瞬時(shí)離心后放置在冰盒中；

2)配制標(biāo)記混合液：取1.5ml離心管，向其中加入5xtdtbuffer134.4ul、30mmdnalabelingreagent19.2ul和tdt33.6ul，總共187.2ul混合液；

3)震蕩標(biāo)記反應(yīng)混合液，瞬時(shí)離心；把混合液分裝至8聯(lián)管中，每管約23ul，離心，用移液器向每份樣本中加入19.5ul標(biāo)記混合液，此時(shí)每個(gè)樣本中的總?cè)萘繎?yīng)為70.5ul；

4)密封孔板，分5個(gè)部分高速震蕩；離心2000rpm1min；

5)把孔板放入已經(jīng)預(yù)熱的pcr儀中，運(yùn)行cytoscanlabel程序：37℃4h，95℃15min，4℃維持(如果不準(zhǔn)備馬上進(jìn)行雜交反應(yīng)，儲(chǔ)存標(biāo)記孔板于-20℃過夜冰箱)。

11.雜交反應(yīng)：

1)從4℃冰箱中取出樣本數(shù)量的芯片，置于干凈的工作臺(tái)面上10-15min，使其接近室溫；

2)接通雜交箱電源，50℃預(yù)熱至少1h，并使其中的轉(zhuǎn)桿處于旋轉(zhuǎn)狀態(tài)；

3)在計(jì)算機(jī)上注冊(cè)芯片；

4)打開芯片包裝，在芯片背面標(biāo)記上相應(yīng)樣本的次序及編號(hào)；

5)向每張芯片背面右上方加樣孔插入一個(gè)200ul的槍頭，并在芯片上方的邊緣貼上小的圓形粘貼紙的1/2；

6)把雜交所需的試劑置室溫，融解后震蕩3次，每次1s，瞬時(shí)離心后放在冰塊上；

7)配制雜交混合液：取15ml離心管放置于冰上，向其中加入hybbufferpart11584.0ul、hybbufferpart2144.0ul、hybbufferpart367.2ul、hybbufferpart49.6ul和oligocontrolreagent010019.2ul，總共混合液1824.0ul；

8)高速震蕩雜交混合液3次，每次持續(xù)3s，隨后把混合物倒入放置在冰塊上的加樣槽中；

9)用移液器向每個(gè)樣本中加入190ul雜交混合液；

10)密封孔板，反復(fù)震蕩確?？装逯袠颖九c雜交混合液充分混勻，離心，2000rpm1min；

11)把孔板放入已經(jīng)預(yù)熱的pcr儀中，運(yùn)行cytoscanhyb程序：95℃10min，49℃保存；

12)將樣本加入芯片之前確保樣本在49℃時(shí)至少維持1min后，用200ul移液器向每張芯片加入200ul樣本，此時(shí)樣本仍然置于pcr儀上；

13)擦凈加樣孔周圍的所有液體，用上方的圓形貼紙粘住加樣孔，同時(shí)拔去之前插入的空200ul槍頭，也用貼紙貼上小孔，按緊后立即將芯片放入雜交箱中；

14)等所有樣本均加完雜交液放入雜交箱后，讓芯片在雜交箱中以50℃、60rpm轉(zhuǎn)速雜交16-18小時(shí)。

12.洗滌、染色與掃描芯片：

1)準(zhǔn)備洗滌芯片之前要確保洗滌用的washa，washb和去離子水(diwater)足夠；

2)對(duì)洗滌工作站進(jìn)行一次shutdown維護(hù)；

3)對(duì)洗滌工作站進(jìn)行一次prime維護(hù)；

4)工作站在prime期間可準(zhǔn)備洗滌芯片用的染液：將下列試劑分別加入1.5ml的離心管中：a.500ulstainbuffer1溶液加入外面套有錫箔紙的管中；b.500ulstainbuffer2直接加入管中；c.800ularrayholdingbuffer加入外層套有錫箔紙的管中；

5)計(jì)算機(jī)選擇命令，將芯片從雜交箱中取出，揭下背面貼的兩張小貼紙，放入工作站的block中，把a(bǔ)、b、c三種染料從左至右順次放入針孔對(duì)應(yīng)的槽中，按照工作站上面的顯示屏指示完成操作；

6)洗滌過程完成后從block中取出芯片，注意觀察芯片的窗口中是否有氣泡。若無(wú)氣泡，即可直接用小的圓形粘貼紙貼住背面的兩個(gè)加樣孔；若有氣泡，則立即將芯片重新放入block中，關(guān)閉block，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)去除氣泡，運(yùn)行停止后，取出芯片觀察沒有氣泡后即可用粘貼紙貼住背面的兩個(gè)加樣孔，室溫避光放置。

若有條件工作站一次性可洗滌8張芯片，則可對(duì)洗滌工作站進(jìn)行一次shutdown維護(hù)即可；若一次性只能洗滌4張芯片，則重復(fù)此過程中的步驟4-6，完全洗滌完后，對(duì)工作站進(jìn)行一次shutdown維護(hù)，即可關(guān)閉工作站的電源；打開掃描芯片軟件，選擇命令，將洗滌完的芯片放入已經(jīng)預(yù)熱好的掃描儀中，進(jìn)行掃描，所有芯片掃描完后即可關(guān)閉掃描儀電源。

13.芯片雜交結(jié)果分析

1)從圖2芯片雜交圖中可以得知：被檢測(cè)者基因組dna的hla區(qū)域基因上高度共有hla-a位點(diǎn)。

2)芯片初級(jí)質(zhì)控

3)在chas軟件中將markersize和markercount設(shè)置為整個(gè)區(qū)間，然后綜合cnstate，markersize和markercount從而得到目的marker為圖3中被紅色標(biāo)記的內(nèi)容。

由上可知，本發(fā)明的方法對(duì)被檢測(cè)者h(yuǎn)la區(qū)域基因上的基因組dna的分析，通過chas軟件出具目的marker分析報(bào)告顯示出：被檢測(cè)者習(xí)慣性流產(chǎn)基因拷貝數(shù)變異風(fēng)險(xiǎn)的高低，由醫(yī)師向被檢測(cè)者詳細(xì)說(shuō)明和提出產(chǎn)前診斷的建議性方案。該方法的檢測(cè)結(jié)果可靠性高、可重復(fù)性驗(yàn)證，對(duì)即將要孩子的夫妻進(jìn)行生育風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警以及發(fā)生習(xí)慣性流產(chǎn)的患者找出病因，為產(chǎn)前診斷以確保優(yōu)生優(yōu)育具有重要作用。