本發(fā)明屬于苗木育種
技術(shù)領域：
，涉及一種苗木育種的檢測方法，具體涉及一種癭椒樹親緣關系鑒定的方法。
背景技術(shù)：
：癭椒樹(tapisciasinensisoliv)屬于癭椒樹科，是一種多年生落葉喬木，種群中雄株和兩性株異株(雄全異株)，雄株不結(jié)果，兩性植株6月初完成受精,受精后果實進入休眠狀態(tài)直至第二年三月才開始發(fā)育，其自然種群中兩性花可以產(chǎn)生可育花粉。癭椒樹為我國特有的古老的第三紀古熱帶孑遺樹種，國家三級保護植物。其作為一種古老瀕危樹種，在研究生物進化，植物繁育系統(tǒng)演化，性別決定機制方面具有重要理論意義。srap(sequence-relatedamplfiedpolymorphism，序列相關擴增多態(tài)性)dna分子標記技術(shù)是美國加州大學li與quiros于2001年中開發(fā)出來的一種新型的基于pcr的雙引物分子標記技術(shù)。其利用正向引物的ccgg與外顯子區(qū)域結(jié)合而反向引物的aatt與內(nèi)含子區(qū)域和啟動子區(qū)域結(jié)合的特點對基因保守的orf(openreadingframe，開放閱讀框)進行擴增，擴增結(jié)果與表型/基因型具有密切相關性，同時因為其具有很高的操作簡易性和擴增多態(tài)性，srap標記在物種種群遺傳結(jié)構(gòu)及親緣關系分析中得到了廣泛的應用。目前已經(jīng)成功應用于甘藍，西葫蘆，野牛草，棉花，荔枝等作物遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建，遺傳親緣關系分析等方面。癭椒樹傳統(tǒng)的育苗方式主要兩種類型,即有性繁殖和無性繁殖,有性繁殖以種子繁殖為主。在苗木育種親本選配中，傳統(tǒng)方法依靠育種學家的田野形態(tài)鑒定手段，這在很大程度上限制了新品種選育的準確性和可靠性，分子標記的手段則有助于在育種之前提前理清育種材料之間的親緣關系，大大節(jié)省了育種周期，節(jié)省了育種成本，提高了可靠性。在癭椒樹中利用srap分子標記方法進行親緣關系鑒定和遺傳多樣性分析尚未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在問題，本發(fā)明的目的在于提供一種癭椒樹親緣關系鑒定方法，該方法操作簡單，周期短，成本低效率高，對于癭椒樹育種中親本選配具有重要指導價值。本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn),包括如下步驟：一種癭椒樹親緣關系鑒定方法，包括以下步驟，(1)提取不同居群癭椒樹基因組dna，構(gòu)建總dna池、雄性dna池和兩性dna池；(2)分別以總dna池、雄性dna池和兩性dna池為模板進行srap-pcr擴增，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳及銀染顯色后得到多條多態(tài)性條帶；以總dna池為模板時，采用的引物共10對，包括seqidno.1～no.20；以雄性dna池為模板或以兩性dna池為模板時，采用的引物共10對，包括seqidno.21-no.40；(3)根據(jù)所述多條多態(tài)性條帶得到不同居群不同性別癭椒樹的dna指紋圖譜；(4)根據(jù)dna指紋圖譜表分別得到不同居群和不同性別的癭椒樹親緣關系樹狀圖。步驟(1)中提取基因組dna是通過癭椒樹幼嫩葉片提?。粯?gòu)建dna池具體步驟包括：將每個居群癭椒樹雄性基因組dna和兩性基因組dna等重量混合構(gòu)建對應居群總dna池，每個居群癭椒樹雄性基因組dna構(gòu)成對應居群雄性dna池，每個居群癭椒樹兩性基因組dna構(gòu)成對應居群兩性dna池。步驟(2)中銀染顯色的染色液為質(zhì)量濃度0.02％agno3。所述步驟(4)具體包括：根據(jù)dna指紋圖譜表，計算不同居群癭椒樹間的遺傳相似系數(shù)，通過遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)類平均法聚類分析，構(gòu)件反映不同居群癭椒樹親緣關系的樹狀圖。本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明所選用的引物對在不同居群癭椒樹中反應穩(wěn)定，擴增片段清楚，利用8％非聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用銀染顯色的方法獲得的電泳條帶多態(tài)性高，條帶清晰，有利于結(jié)果統(tǒng)計。同時整個方法操作流程簡單，用時短，成本低。(2)采用本發(fā)明方法可揭示不同癭椒樹種群間的親緣關系遠近，說明種群間的遺傳多樣性，從而在分子水平上加深對癭椒樹種質(zhì)資源的親緣關系的認識，可以為癭椒樹種質(zhì)資源的準確鑒定，雜種優(yōu)勢的預測，親本選配，苗木遺傳分子育種等提供參考。(3)本發(fā)明將srap分子標記技術(shù)用于癭椒樹雄性及兩性親緣關系鑒定，能準確成功的辨析不同癭椒樹地理居群中，不同性別植株的演化關系，在研究被子植物繁育系統(tǒng)演化方面具有重要意義。附圖說明圖1是利用不同引物(p1：f1r10，p2:f1r17)對不同居群總dna池進行srap-pcr擴增后用8％非聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖2是利用引物f1r10對不同居群雄性及兩性進行srap-pcr擴增后用8％非聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖3為基于10對srap引物對癭椒樹7個地理種群10個樣本(總dna池為模板擴增)進行遺傳相似度分析結(jié)果表。圖4為基于10對srap引物對癭椒樹7個地理種群10個樣本(總dna池為模板擴增)進行親緣關系和聚類分析所構(gòu)建的樹狀圖。圖5為基于10對srap引物對癭椒樹7個地理種群17個樣(雄性dna池及兩性dna池為模板進行擴增)本進行親緣關系和聚類分析所構(gòu)建的樹狀圖。圖6為基于對比例1的條帶。具體實施方式下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。多態(tài)性條帶為分子標記中的常規(guī)概念，多態(tài)是指不同個體對于同一分子標記pcr條帶不同，條帶的有無，大小，多少等。實施例1：本實施例提供一種癭椒樹親緣關系鑒定方法，具體過程如下：(1)提取不同居群癭椒樹雄性基因組dna和兩性基因組dna，分別構(gòu)建不同居群和不同性別的dna池；dna提?。簩Σ杉云邆€不同居群共十個雄性樣本和十一個兩性樣本(除snb，其余樣本兩性果實均在受精后第二年發(fā)育)的癭椒樹幼嫩葉片進行硅膠干燥保存，具體的采樣點編號，樣地名稱，及采集數(shù)量見表1。表1采集信息采用tiangen的plantgenomicdnakit對上述11組癭椒樹雄性及兩性植株幼嫩葉片進行基因組dna提取，每組提取雄性5株dna，兩性5株dna。具體操作過程按照此試劑盒說明書嚴格執(zhí)行即可，說明書略。構(gòu)建dna池：按照bsa(bulkedsegerantanalysis，群體分離分析方法)，在每組中取雄性及兩性植株各五株的dna等量混合構(gòu)建此樣本的總dna池，獲得xy，ql，ns32，ns101，xx，ys，sk，xf，yn，sn共10個srap-pcr擴增用總dna池。其中ql，ns32，ns101均采自樣地寧陜，xx，ys均采自樣地永順。這樣做的目的是為了對最終所構(gòu)建的親緣關系和聚類分析樹狀圖的準確性進行檢驗，檢驗標準為：如果樹狀圖將同一取樣地的不同樣本聚為一類，則說明所構(gòu)建的樹狀圖準確性及可靠性高，能準確反映癭椒樹不同地理居群之間的親緣關系，遺傳進化關系。相反，如果樹狀圖將同一取樣地的不同樣本沒有聚為一類，則說明所構(gòu)建的樹狀圖準確性及可靠性差，不能準確反映癭椒樹不同地理居群之間的親緣關系，遺傳進化關系。按照bsa在每組中，分別取雄性5株的dna等量混合構(gòu)建該組雄性樣本的dna池，分別取兩性5株的dna等量混合構(gòu)建該組兩性樣本的dna池，獲得xy，ql，ns32，ns101，sn，xx，ys，sk，xf，yn，共10個雄性srap-pcr擴增用dna池，xy，ql，ns32，ns101，sn,snb,xx，ys，sk，xf，yn，共11個兩性srap-pcr擴增用dna池，其中ns32，ns101均采自樣地寧陜。(2)以總dna池、雄性dna池和兩性dna池為模板進行srap-pcr擴增，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳及銀染顯色后得到多條多態(tài)性條帶。以總dna池為模板時，采用的引物共10對，見表4；以雄性dna池為模板或以兩性dna池為模板時，采用的引物共10對見表5。上述引物對的獲取方法如下：以上述步驟得到的dna池為模板進行srap擴增，對400(20fx20r，fr分別代表正向和反向)srap引物進行篩選，篩選所用引物序列如表2，得到擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳和銀染顯色后選擇，有條帶，多態(tài)性良好，條帶清晰可辨的引物對，篩選結(jié)果如表3；srap-pcr擴增體系及擴增程序由本實驗室預先優(yōu)化方法獲得，采用15μl反應體系進行srap擴增：2xtaqpcrmastermix7.5μl；上游引物f(10μm)0.5μl；下游引物r(10μm))0.5μl；植物dna池模板(50ng/μl)0.5μl；滅菌水6μl補足15μl。其中，2xtaqpcrmastermix包含500μmdntps、50mmph8.7tris-hcl、20mmkcl、4.0mmmgcl2、0.1utaqpolymerase/μl。srap-pcr擴增程序如下：94℃預變性3min30sec，一個循環(huán)；94℃變性30sec，一個循環(huán)；35℃低溫退火30sec，5個循環(huán)；72℃延伸1min30sec，一個循環(huán)；94℃第二次變性30sec，一個循環(huán)；52℃高溫退火45sec，35個循環(huán)；72℃延伸1min30sec，一個循環(huán)；72℃延伸10min；16℃保存。其中2xtaqpcrmastermix購自北京天根，引物由上海生工生物有限公司合成。400對srap-pcr篩選所用引物具體如表2所示，篩選后，后續(xù)srap-pcr擴增中涉及到的引物具體如表3所示；以每個居群總dna池為模板時，srap-pcr擴增所采用的10對引物組合見表4所示；以10個雄性srap-pcr擴增用dna池，10個兩性srap-pcr擴增用dna池，為模板擴增所采用的引物組合見表5所示。表2引物篩選所用的400對引物ts-f1tgagtccaaaccggatats-r1gactgcgtacgaattaatts-f2tgagtccaaaccggagcts-r2gactgcgtacgaatttgcts-f3tgagtccaaaccggaatts-r3gactgcgtacgaattgacts-f4tgagtccaaaccggaccts-r4gactgcgtacgaatttgats-f5tgagtccaaaccggaagts-r5gactgcgtacgaattaacts-f6tgagtccaaaccggacats-r6gactgcgtacgaattgcats-f7tgagtccaaaccggacgts-r7gactgcgtacgaattcaats-f8tgagtccaaaccggactts-r8gactgcgtacgaattcacts-f9tgagtccaaaccggaggts-r9gactgcgtacgaattcagts-f10tgagtccaaaccggaaats-r10gactgcgtacgaattcatts-f11tgagtccaaaccggaacts-r11gactgcgtacgaattctats-f12tgagtccaaaccggagats-r12gactgcgtacgaattctcts-f13tgagtccaaaccggttats-r13gactgcgtacgaattctgts-f14tgagtccaaaccggtccts-r14gactgcgtacgaattcttts-f15tgagtccaaaccggtgcts-r15gactgcgtacgaattggtts-f16tgagtccaaaccggtaats-r16gactgcgtacgaattgtcts-f17tgagtccaaaccggtagts-r17gactgcgtacgaatttcgts-f18tgagtccaaaccggttgts-r18gactgcgtacgaattatgts-f19tgagtccaaaccggtgtts-r19gactgcgtacgaattagcts-f20tgagtccaaaccggtcats-r20gactgcgtacgaatttag表3后續(xù)srap擴增涉及到的引物列表上游引物f5＇-3＇下游引物r5＇-3＇ts-f1tgagtccaaaccggatats-r1gactgcgtacgaattaatts-f2tgagtccaaaccggagcts-r2gactgcgtacgaatttgcts-f3tgagtccaaaccggaatts-r4gactgcgtacgaatttgats-f4tgagtccaaaccggaccts-r6gactgcgtacgaattgcats-f5tgagtccaaaccggaagts-r10gactgcgtacgaattcatts-f6tgagtccaaaccggacats-r11gactgcgtacgaattctats-f10tgagtccaaaccggaaats-r12gactgcgtacgaattctcts-f14tgagtccaaaccggtccts-r14gactgcgtacgaattcttts-f15tgagtccaaaccggtgcts-r17gactgcgtacgaatttcg表4srap-pcr擴增采用的引物組合列表seqid上游引物f5＇-3＇下游引物r5＇-3＇1-2ts-f1tgagtccaaaccggatats-r10gactgcgtacgaattcat3-4ts-f1tgagtccaaaccggatats-r17gactgcgtacgaatttcg5-6ts-f2tgagtccaaaccggagcts-r6gactgcgtacgaattgca7-8ts-f3tgagtccaaaccggaatts-r2gactgcgtacgaatttgc9-10ts-f4tgagtccaaaccggaccts-r12gactgcgtacgaattctc11-12ts-f5tgagtccaaaccggaagts-r4gactgcgtacgaatttga13-14ts-f6tgagtccaaaccggacats-r6gactgcgtacgaattgca15-16ts-f10tgagtccaaaccggaaats-r14gactgcgtacgaattctt17-18ts-f14tgagtccaaaccggtccts-r11gactgcgtacgaattcta19-20ts-f15tgagtccaaaccggtgcts-r1gactgcgtacgaattaat表5srap-pcr擴增采用的引物組合列表seqid上游引物f5＇-3＇下游引物r5＇-3＇21-22ts-f1tgagtccaaaccggatats-r10gactgcgtacgaattcat23-24ts-f2tgagtccaaaccggagcts-r6gactgcgtacgaattgca25-26ts-f5tgagtccaaaccggaagts-r4gactgcgtacgaatttga27-28ts-f10tgagtccaaaccggaaats-r14gactgcgtacgaattctt29-30ts-f11tgagtccaaaccggaacts-r3gactgcgtacgaattgac31-32ts-f12tgagtccaaaccggagats-r3gactgcgtacgaattgac33-34ts-f13tgagtccaaaccggttats-r14gactgcgtacgaattctt35-36ts-f15tgagtccaaaccggtgcts-r1gactgcgtacgaattaat37-38ts-f17tgagtccaaaccggtagts-r12gactgcgtacgaattctc39-40ts-f20tgagtccaaaccggtcats-r19gactgcgtacgaattagc凝膠電泳：pcr擴增產(chǎn)物用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離。每孔上樣7μl，300v電壓,200a電流，100w功率，直至指示帶距膠底部3-5cm，停止電泳，電泳2h。試劑配方：100ml8％聚丙烯酰胺凝膠工作液中：純水52.7ml，30％母液26.6ml，5×tbe緩沖液20ml，10％過硫酸銨溶液0.7ml，temed0.065ml。30％聚丙烯酰胺凝膠母液配方：聚丙烯酰胺145g，甲叉雙丙烯酰胺5g，加雙蒸水定容至500ml；5×tbe緩沖液配方：tris27g，硼酸13.75g，0.5mph8.0edta10ml,定容至500ml,電泳緩沖液為1×tbe。銀染顯色：具體包括如下步驟：水洗：將電泳后凝膠從玻璃板揭下，放入染色盤中，用清水沖洗三遍，每次15sec；在染色盤中倒入250ml染色液，放在搖床上勻速染色10min；倒掉染色液，用清水小心沖洗凝膠三遍，每次15sec；在染色盤中倒入250ml顯色液，放在搖床上染色約10min后出現(xiàn)清晰條帶；倒掉顯色液，用清水沖洗凝膠15sec；將顯影的凝膠在膠片觀察燈上，用手機拍照。檢測所用試劑配方：0.02％agno3染色液：1gagno3加雙蒸水定容至500ml；顯影液：naoh6g,naco30.2g，甲醛2ml加雙蒸水定容至500ml。如圖1所示，是利用不同引物(p1：f1r10，p2:f1r17)對不同居群總dna池進行srap-pcr擴增，用8％非聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色之后的多態(tài)性條帶，其中m為dl2000marker(takara)。如圖2所示，是利用引物f1r10對不同居群雄性dna池及兩性dna池癭椒樹進行srap-pcr擴增，用8％非聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色之后的多態(tài)性條帶。表示雄性植株，表示兩性植株。(3)根據(jù)每對引物擴增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果建立指紋圖譜，即以樣本編號為橫行，以每條譜帶的引物及其條帶位置為縱行，條帶位置是指，按照從上到下即由大片段向小片段的讀帶方向從1開始編號。在每一橫縱坐標交結(jié)處，根據(jù)條帶的有無轉(zhuǎn)換成[0,1]矩陣數(shù)據(jù)表，即強擴增譜帶和弱擴增譜帶記為“1”，無帶記錄為“0”，從而將電泳膠圖中條帶的有無轉(zhuǎn)化成[0,1]矩陣，分別繪制所有引物對供試品種的dna指紋圖譜表，所采用的10對srap引物共產(chǎn)生119條差異條帶。以表6所列10個樣本為例，利用10對引物的擴增結(jié)果構(gòu)建的指紋圖譜表如下(以f1r10-4為例，“f1r10”表示上下游引物標號，“-4”表示多態(tài)性譜帶是從上到下第四條被計數(shù)的條帶)。表7用10對srap引物對10個雄性dna池，11個兩性dna池擴增結(jié)果構(gòu)建的指紋圖譜表。(為了最終的結(jié)果簡潔，在構(gòu)建指紋圖譜時候?qū)U增時候用于對照的雄性ql,ys，兩性的ql,ys樣本刪除，同時只保留來自同一地理居群的ns32，ns101)。表6用10對srap引物對10個樣本擴增結(jié)果構(gòu)建的指紋圖譜表表7不同居群雄性dna池及兩性dna池擴增后構(gòu)建的dna指紋圖譜(4)根據(jù)dna指紋圖譜表，分別得到反映不同居群和不同性別的癭椒樹親緣關系的樹狀圖。利用nntsys-pc(2.1版本)，根據(jù)相似矩陣采用upgma(非加權(quán)類平均法)法聚類分析，得到遺傳相似系數(shù)，并根據(jù)遺傳相似系數(shù)構(gòu)建遺傳關系樹狀圖，最后對七個居群10個樣本之間的親緣遠近關系(遺傳相似度)及聚類進行分析。遺傳相似度結(jié)果見圖2所示，橫坐標和縱坐標均為采樣樣本編號，數(shù)字代表遺傳相似度，數(shù)字大小代表了遺傳相似度的高低，數(shù)字越大代表遺傳相似度越高，聚類進行分析結(jié)果見圖3，橫坐標為cofficient(遺傳相似系數(shù))，?、ⅱ榫垲惤Y(jié)果。利用10對于srap引物組合產(chǎn)生的119條dna差異條帶段計算了10個供試樣本之間的遺傳相似系數(shù)。srap標記揭示10個樣本材料間遺傳相似系數(shù)值變化范圍為0.429～0.906。其中，ql與sn居群之間遺傳相似系數(shù)最低0.429，說明這兩個居群親緣關系最遠，ns32與ns101居群之間遺傳相似系數(shù)最高0.906，說明這兩個樣本之間親緣關系最近，同時ql與ns32，ns101三個居群之間遺傳相似系數(shù)變化范圍0.656～0.906，xx與ys居群之間遺傳相似系數(shù)0.664，因為ql與ns32，ns101三個樣本均來自于同一樣地寧陜，xx與ys兩個樣本來自于同一樣地永順，相似系數(shù)高，說明了遺傳相似性分析結(jié)果的可靠性高。xy與ql居群之間遺傳相似系數(shù)0.726，說明這兩個居群親緣關系近，這與這兩個居群在地里上都位于陜西省是一致的。表明srap標記可以用來揭示材料間的親緣關系的遠近和材料間的遺傳變異。樹狀圖：不同居群：根據(jù)srap標記計算的遺傳相似系數(shù)矩陣，按upgma法(非加權(quán)類平均法)構(gòu)建了材料間的遺傳關系聚類圖。srap聚類圖結(jié)果表明，遺傳相似系數(shù)值約0.56時，可將所有供試材料劃分為3大類：第i類群包含4個樣本材料(xy、ql、ns32和ns101)，第ii類群包含5個樣本材料(xx、ys、sk、xf、yn)，第iii類群只包含1份材料sn。從以上的聚類結(jié)果可以看出，同一地理位置的不同樣本首先聚在一起：xy、ql、ns32和ns101聚在一起組成第i類群，xx,ys聚在一起，屬于第ii類群，而sn單獨組成第iii類群，表明sn居群與其他九個居群親緣關系遠，同時在進化樹上首先區(qū)分出來，表明sn居群在進化位置上處于較原始位置。表明各種質(zhì)的聚類結(jié)果與地理來源有明顯的聯(lián)系，同時也表明了地理來源也不能作為親緣關系遠近劃分的唯一依據(jù)?？傊?，通過這種方法可以非常清晰和直觀地說明各個居群之間的親緣關系遠近和聚類關系，為育種上面親本選配提供理論依據(jù)，對我國癭椒樹新品種培育具有重要參考價值。不同居群不同性別：根據(jù)srap標記計算遺傳相似系數(shù)矩陣，按upgma法構(gòu)建了8個雄性dna池，9個兩性dna池，共17個樣本材料間的遺傳進化關系樹狀圖。結(jié)果表明，癭椒樹snb及sn兩性為最原始的種群，而sn雄性則出現(xiàn)的較晚，暗示了癭椒樹種群現(xiàn)在的雄全異株繁育系統(tǒng)可能由兩性祖先進化而來。同時sn雄性與sk雄性，兩性,xf雄性，兩性聚為第ii類群，表明其遺傳關系接近，xy,ns32，ns101，yn這四個居群的雄性及兩性聚為第i類群，表明這四個居群的雄性及兩性遺傳關系接近，而sn兩性及snb單獨為第iii類群，并且在進化上處于原始位置。對比例1：本對比例其他步驟同實施例1，不同點在于：本對比例步驟(2)中，所選取的引物對不同于表4和表5，對比例為以下引物的跑膠結(jié)果：a(f2r8)b(f7r3)c(f9r16)d(f19r20)。最終得到的條帶如圖6所示，a電泳無條帶，b電泳條帶不清晰，c電泳條帶不利于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，d電泳條帶多態(tài)性差，用這些條帶去進行后續(xù)的步驟，要么無法實施，要么得到的樹狀圖不能正確反映癭椒樹的親緣關系，其余本發(fā)明未選取引物跑膠結(jié)果均屬于以上四種結(jié)果之一，或者以上四種結(jié)果組合，因此，引物是否正確在本發(fā)明的方法中顯得很重要。<110>西北大學<120>癭椒樹親緣關系鑒定方法<141><160><210>1<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f1的核苷酸序列<220><223><400>15＇-tgagtccaaaccggata-3＇<210>2<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r10的核苷酸序列<220><223><400>25＇-gactgcgtacgaattcat-3＇<210>3<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f1的核苷酸序列<220><223><400>35＇-tgagtccaaaccggata-3＇<210>4<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r17的核苷酸序列<220><223><400>45＇-gactgcgtacgaatttcg-3＇<210>5<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f2的核苷酸序列<220><223><400>55＇-tgagtccaaaccggagc-3＇<210>6<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r6的核苷酸序列<220><223><400>65＇-gactgcgtacgaattgca-3＇<210>7<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f3的核苷酸序列<220><223><400>75＇-tgagtccaaaccggaat-3＇<210>8<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r2的核苷酸序列<220><223><400>85＇-gactgcgtacgaatttgc-3＇<210>9<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f4的核苷酸序列<220><223><400>95＇-tgagtccaaaccggacc-3＇<210>10<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r12的核苷酸序列<220><223><400>105＇-gactgcgtacgaattctc-3＇<210>11<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f5的核苷酸序列<220><223><400>115＇-tgagtccaaaccggaag-3＇<210>12<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r4的核苷酸序列<220><223><400>125＇-gactgcgtacgaatttga-3＇<210>13<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f6的核苷酸序列<220><223><400>135＇-tgagtccaaaccggaca-3＇<210>14<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r6的核苷酸序列<220><223><400>145＇-gactgcgtacgaattgca-3＇<210>15<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f10的核苷酸序列<220><223><400>155＇-tgagtccaaaccggaaa-3＇<210>16<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r14的核苷酸序列<220><223><400>165＇-gactgcgtacgaattctt-3＇<210>17<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f14的核苷酸序列<220><223><400>175＇-tgagtccaaaccggtcc-3＇<210>18<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r11的核苷酸序列<220><223><400>185＇-gactgcgtacgaattcta-3＇<210>19<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f15的核苷酸序列<220><223><400>195＇-tgagtccaaaccggtgc-3＇<210>20<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r1的核苷酸序列<220><223><400>205＇-gactgcgtacgaattaat-3＇<210>21<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f1的核苷酸序列<220><223><400>215＇-tgagtccaaaccggata-3＇<210>22<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r10的核苷酸序列<220><223><400>225＇-gactgcgtacgaattcat-3＇<210>23<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f2的核苷酸序列<220><223><400>235＇-tgagtccaaaccggagc-3＇<210>24<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r6的核苷酸序列<220><223><400>245＇-gactgcgtacgaattgca-3＇<210>25<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f5的核苷酸序列<220><223><400>255＇-tgagtccaaaccggaag-3＇<210>26<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r4的核苷酸序列<220><223><400>265＇-gactgcgtacgaatttga-3＇<210>27<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f10的核苷酸序列<220><223><400>275＇-tgagtccaaaccggaaa-3＇<210>28<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r14的核苷酸序列<220><223><400>285＇-gactgcgtacgaattctt-3＇<210>29<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f11的核苷酸序列<220><223><400>295＇-tgagtccaaaccggaac-3＇<210>30<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r3的核苷酸序列<220><223><400>305＇-gactgcgtacgaattgac-3＇<210>31<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f12的核苷酸序列<220><223><400>315＇-tgagtccaaaccggaga-3＇<210>32<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r3的核苷酸序列<220><223><400>325＇-gactgcgtacgaattgac-3＇<210>33<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f13的核苷酸序列<220><223><400>335＇-tgagtccaaaccggtta-3＇<210>34<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r14的核苷酸序列<220><223><400>345＇-gactgcgtacgaattctt-3＇<210>35<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f15的核苷酸序列<220><223><400>355＇-tgagtccaaaccggtgc-3＇<210>36<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r1的核苷酸序列<220><223><400>365＇-gactgcgtacgaattaat-3＇<210>37<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f17的核苷酸序列<220><223><400>375＇-tgagtccaaaccggtag-3＇<210>38<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r12的核苷酸序列<220><223><400>385＇-gactgcgtacgaattctc-3＇<210>39<211>17<212>dna<213>上游引物ts-f20的核苷酸序列<220><223><400>395＇-tgagtccaaaccggtca-3＇<210>40<211>18<212>dna<213>下游引物ts-r19的核苷酸序列<220><223><400>405＇-gactgcgtacgaattagc-3＇當前第1頁12