本發(fā)明涉及一種測定纖溶酶純度的方法，具體是一種測定重組枯草桿菌纖溶酶純度的方法，屬于生物醫(yī)藥和分析檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：重組枯草桿菌纖溶酶是一種超高活性的溶栓蛋白酶，具有高效的溶栓效用，具有藥理作用直接且多元化、體內(nèi)作用時間長、分子量較小，可直接通過胃腸系統(tǒng)直接被人體吸收、抗氧化、防止血管內(nèi)皮損傷、延緩血管老化、安全性高等諸多優(yōu)點。因此，重組枯草桿菌纖溶酶具有開發(fā)成新一代高效溶栓藥物的潛力。現(xiàn)有技術(shù)中存在的重組枯草桿菌纖溶酶的純度測定方法為電泳法，該方法無法進(jìn)行定量測定，也無法測定產(chǎn)品的具體純度，為枯草桿菌纖溶酶精制及其藥物的工業(yè)化生產(chǎn)帶來很大障礙。目前，還沒有關(guān)于重組枯草桿菌纖溶酶純度測定的有效方法，而重組枯草桿菌纖溶酶廣闊的藥用前景亟待開發(fā)成藥物用于治療血栓等疾病。高效液相色譜法(hplc)分離效果好、選擇性好、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣和分析速度快，不僅適用于各種多元組分復(fù)雜混合物的分析，而且能分析其中微量成分，定量分析目標(biāo)物含量，為藥物成分的定量和定性提供了迅速可靠的途徑。但是常規(guī)的普通hplc方法很難準(zhǔn)確測定重組枯草桿菌纖溶酶的純度。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種測定重組枯草桿菌纖溶酶純度的方法，該方法能夠快速、高效的測定重組枯草桿菌的純度，為重組枯草桿菌纖溶酶藥物研發(fā)和質(zhì)量控制提供可靠的檢測方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的：一種測定重組枯草桿菌纖溶酶純度的方法，該方法包括如下步驟：1)選用適合蛋白分析的色譜柱，并預(yù)設(shè)柱溫溫度；2)利用二極管陣列檢測器檢測色譜柱；3)采用三氟乙酸乙腈溶液和三氟乙酸水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫分析；4)通過面積歸一法將色譜柱定量。所述步驟1)中的色譜柱為agilentzorbax300sb-c18色譜柱。所述步驟1)中的預(yù)設(shè)柱溫溫度為50℃。所述步驟3)中的三氟乙酸(tfa)乙腈溶液和三氟乙酸水溶液的量均為1％。本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法基于高效液相色譜檢測方法，不僅可以準(zhǔn)確對重組枯草桿菌纖溶酶純度進(jìn)行定量，為其開發(fā)成藥物提供可靠的原材料，而且還可以分離純化過程中的分離效率計算提供可靠依據(jù)，重組枯草桿菌纖溶酶hplc純度標(biāo)準(zhǔn)方法的建立為客觀的表述重組枯草桿菌纖溶酶的純度提供可靠依據(jù)。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例檢測結(jié)果示意圖。具體實施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。一種測定重組枯草桿菌纖溶酶純度的方法，該方法包括如下步驟：1)選用適合蛋白分析的色譜柱，并預(yù)設(shè)柱溫溫度；2)利用二極管陣列檢測器檢測色譜柱；3)采用三氟乙酸乙腈溶液和三氟乙酸水溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫分析；4)通過面積歸一法將色譜柱定量。所述步驟1)中的色譜柱為agilentzorbax300sb-c18色譜柱。所述步驟1)中的預(yù)設(shè)柱溫溫度為50℃。所述步驟3)中的三氟乙酸(tfa)乙腈溶液和三氟乙酸水溶液的量均為1％。目前重組枯草桿菌纖溶酶的純度檢測技術(shù)指標(biāo)和檢測標(biāo)準(zhǔn)，本發(fā)明對其深入研究，制定檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，為重組枯草桿菌纖溶酶開發(fā)成藥物提供技術(shù)服務(wù)，具體如下：采用適合蛋白分析的agilentzorbax300sb-c18色譜柱，0.1％tfa乙腈和0.1％tfa作為流動相，采用梯度洗脫的方法進(jìn)行分析，面積歸一化法進(jìn)行定量，建立能夠快速測定重組枯草桿菌纖溶酶的純度的hplc方法。高效液相色譜法對重組枯草桿菌纖溶酶的純度進(jìn)行測定，使用agilent1260液相色譜儀，配dad檢測器。具體檢測條件為：色譜柱：agilentzorbax300sb-c18色譜柱250*4.6mm(5μm)流動相a：0.1％三氟乙酸水溶液流動相b：0.1％三氟乙酸乙腈溶液時間(min)流動相a(％)流動相b(％)09551559515.195521955進(jìn)樣量：20μl流速：1ml/min柱溫：50℃檢測波長：280nm樣品制備將發(fā)酵液先離心處理，經(jīng)過疏水純化和脫鹽純化后及冷凍干燥后得到的重組枯草桿菌纖溶酶進(jìn)行高效液相色譜法檢測純度。供試品：疏水純化后的重組枯草桿菌纖溶酶(簡稱疏水蛋白)、脫鹽純化后的重組枯草桿菌纖溶酶(簡稱脫鹽蛋白)及冷凍干燥后的凍干粉。實施例一1、儀器agilent1260液相色譜儀2、試劑水：超純水乙腈：sigmahplc乙腈tfa(三氟乙酸)：上海麥克林生物科技有限公司流動相a：0.1％tfa溶液，過0.22μm的水系濾膜流動相b：0.1％tfa乙腈溶液，過0.22μm的有機(jī)系濾膜3、檢測方法樣品的制備：若為疏水蛋白或脫鹽蛋白溶液則直接稀釋到1mg/ml，過0.22μm水系濾膜，若為凍干粉則加水溶解后稀釋至1mg/ml。色譜柱：德國邁克c8色譜柱，5μm，250*4.6mm德國邁克c18色譜柱，5μm，250*4.6mm月旭科技c18色譜柱，5μm，250*4.6mmagilentzorbax300sb-c18色譜柱，5μm，250*4.6mm梯度洗脫方法：時間(min)流動相a(％)流動相b(％)09551559515.195521955進(jìn)樣量：20μl流速：1ml/min柱溫：25℃檢測波長：280nm4、檢測結(jié)果用超純水作為空白對照，檢測樣品為1mg/ml的疏水蛋白。通過對比檢測純度、雜峰及分離度來看，采用agilentzorbax300sb-c18色譜柱的效果最好。實施例二1、儀器agilent1260液相色譜儀2、試劑水：超純水乙腈：sigmahplc級乙腈甲醇：sigmahplc級甲醇tfa(三氟乙酸)：上海麥克林生物科技有限公司乙酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(ar)tea(三乙胺)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(ar)磷酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(ar)二水合磷酸二氫鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(ar)十二水合磷酸氫二鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(ar)流動相a：流動相a①：0.1％tfa的50mmol磷酸緩沖液流動相a②：0.1％tea的50mmol磷酸緩沖液流動相a③：1％乙酸的50mmol磷酸緩沖液流動相a④：0.1％tfa溶液流動相a⑤：0.1％tea溶液流動相a⑥：1％乙酸溶液流動相b:流動相b①：乙腈流動相b②：甲醇3、檢測方法色譜柱：agilentzorbax300sb-c18色譜柱，5μm，250*4.6mm梯度洗脫方法：時間(min)流動相a(％)流動相b(％)09551559515.195521955進(jìn)樣量：20μl流速：1ml/min柱溫：25℃檢測波長：280nm4、檢測結(jié)果用超純水作為空白對照，檢測樣品為1mg/ml的疏水蛋白。通過12種流動相的組合對比來看，采用0.1％tfa溶液與乙腈的組合最為適合分析重組枯草桿菌纖溶酶。實施例三1、儀器agilent1260液相色譜儀2、試劑水：超純水乙腈：sigmahplc乙腈tfa(三氟乙酸)：上海麥克林生物科技有限公司流動相a：0.1％tfa溶液，過0.22μm的水系濾膜流動相b：0.1％tfa乙腈溶液，過0.22μm的有機(jī)系濾膜3、檢測方法色譜柱：agilentzorbax300sb-c18色譜柱，5μm，250*4.6mm梯度洗脫方法：時間(min)流動相a(％)流動相b(％)09551559515.195521955進(jìn)樣量：20μl流速：1ml/min檢測波長：280nm柱溫分別為：25℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃及70℃4、檢測結(jié)果用超純水作為空白對照，檢測樣品為1mg/ml的疏水蛋白。通過實施例一、實施例二和實施例三可得，如圖1所示：采用不同的柱溫來檢測，發(fā)現(xiàn)在柱溫為50℃，枯草桿菌纖溶酶的分離度最高、峰不拖尾、純度最高。以上所舉實施例為本發(fā)明的較佳實施方式，僅用來方便說明本發(fā)明，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識者，若在不脫離本發(fā)明所提技術(shù)特征的范圍內(nèi)，利用本發(fā)明所揭示技術(shù)內(nèi)容所做出局部更動或修飾的等效實施例，并且未脫離本發(fā)明的技術(shù)特征內(nèi)容，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)特征的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12