背景技術(shù)：

x-染色體連鎖的無(wú)丙種球蛋白血癥(xla)是一種遺傳免疫缺陷病，以b淋巴細(xì)胞分化障礙為病因，多數(shù)患者在出生后不久出現(xiàn)反復(fù)且又嚴(yán)重的細(xì)菌感染、低丙種球蛋白血癥、外周血b細(xì)胞的顯著減少和缺乏。1993年，vetrie等通過(guò)定位克隆的方法找到了xla的致病基因btk。

btk基因包含19個(gè)外顯子，其編碼的蛋白由659個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包括c末端的一個(gè)激酶區(qū)(sh1)和n末端的4個(gè)功能區(qū)(ph、th、sh3、sh2)。研究表明，btk蛋白參與了b淋巴細(xì)胞的分化、肥大細(xì)胞的脫顆粒、血小板的聚集和脫顆粒，也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)btk基因發(fā)生突變時(shí)，這種突變將影響其編碼蛋白的正常功能而導(dǎo)致不同程度的xla的發(fā)生。據(jù)目前研究表明btk突變遍布整個(gè)btk基因，而沒(méi)有一種突變的發(fā)生率超過(guò)3％，但其中ph區(qū)域?yàn)橄鄬?duì)的突變多發(fā)區(qū)，故對(duì)btk基因進(jìn)行ph區(qū)外顯子測(cè)序?qū)z測(cè)xla無(wú)疑有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)btk基因突變的寡核苷酸，采用pcr技術(shù)，可用于快速檢測(cè)xla患者體內(nèi)的btk基因ph區(qū)外顯子突變情況。所述寡核苷酸包括至少一對(duì)擴(kuò)增btk基因ph區(qū)外顯子的引物，所述至少一對(duì)擴(kuò)增引物選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r，其堿基序列為：

btk-1f：tgtaaaacgacggccagtacagttgagggggtggaatag；

btk-1r：aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag；

btk-2f：tgtaaaacgacggccagtggaaccaagagggatgaggat；

btk-2r：aacagctatgaccatgctttgactttccggctttagc；

btk-3f：tgtaaaacgacggccagtttcccccacatgacaggtc；

btk-3r：aacagctatgaccatgcaaatctgctgttccccatc；

btk-4f：tgtaaaacgacggccagtttctttggtgtatggtgtagca；

btk-4r：aacagctatgaccatgcagtctcatttcttggttcagc；

btk-5f：tgtaaaacgacggccagtgagcttttaaacgctacattcc；

btk-5r：aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct；

btk-6+f：tgtaaaacgacggccagtgcagttgcttgaagttcacca；

btk-6+r：aacagctatgaccatgtgattggattacatggttgctg。

進(jìn)一步地，所述寡核苷酸還包括一對(duì)測(cè)序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進(jìn)一步地，btk-1f：btk-1r、btk-2f：btk-2r、btk-3f：btk-3r、btk-4f：btk-4r、btk-5f：btk-5r和btk-6+f：btk-6+r的比值均為1。

進(jìn)一步地，m13f：m13r的比值為1。

進(jìn)一步地，btk-1f、btk-1r、btk-2f、btk-2r、btk-3f、btk-3r、btk-4f、btk-4r、btk-5f、btk-5r、btk-6+f和btk-6+r與m13f的比值均為3.125。

進(jìn)一步地，所述寡核苷酸在輔助檢測(cè)無(wú)丙種球蛋白血癥中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測(cè)btk基因突變的方法，包括以下步驟：

(1)抽提樣本中的基因組dna；

(2)利用至少一對(duì)擴(kuò)增引物對(duì)(1)中的dna進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)利用一對(duì)測(cè)序引物m13f和m13r對(duì)(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列；

(4)將(3)中的堿基序列與btk基因ph區(qū)外顯子野生型參考序列進(jìn)行比較，確定突變位點(diǎn)是否存在，其中，所述至少一對(duì)擴(kuò)增引物選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r，所述至少一對(duì)擴(kuò)增引物和所述一對(duì)測(cè)序引物的堿基序列為：

btk-1f：tgtaaaacgacggccagtacagttgagggggtggaatag；

btk-1r：aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag；

btk-2f：tgtaaaacgacggccagtggaaccaagagggatgaggat；

btk-2r：aacagctatgaccatgctttgactttccggctttagc；

btk-3f：tgtaaaacgacggccagtttcccccacatgacaggtc；

btk-3r：aacagctatgaccatgcaaatctgctgttccccatc；

btk-4f：tgtaaaacgacggccagtttctttggtgtatggtgtagca；

btk-4r：aacagctatgaccatgcagtctcatttcttggttcagc；

btk-5f：tgtaaaacgacggccagtgagcttttaaacgctacattcc；

btk-5r：aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct；

btk-6+f：tgtaaaacgacggccagtgcagttgcttgaagttcacca；

btk-6+r：aacagctatgaccatgtgattggattacatggttgctg；

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進(jìn)一步地，所述寡核苷酸還包括一對(duì)測(cè)序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進(jìn)一步地，btk-1f：btk-1r、btk-2f：btk-2r、btk-3f：btk-3r、btk-4f：btk-4r、btk-5f：btk-5r和btk-6+f：btk-6+r的比值均為1。

進(jìn)一步地，m13f：m13r的比值為1。

進(jìn)一步地，btk-1f、btk-1r、btk-2f、btk-2r、btk-3f、btk-3r、btk-4f、btk-4r、btk-5f、btk-5r、btk-6+f和btk-6+r與m13f的比值均為3.125。

本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測(cè)btk基因突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測(cè)體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、測(cè)序體系反應(yīng)液，其中，檢測(cè)體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液包括至少一對(duì)擴(kuò)增引物，所述測(cè)序體系反應(yīng)液包括一對(duì)測(cè)序引物m13f和m13r，其特征在于，所述至少一對(duì)擴(kuò)增引物選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r，所述至少一對(duì)擴(kuò)增引物和所述一對(duì)測(cè)序引物的堿基序列為：

btk-1f：tgtaaaacgacggccagtacagttgagggggtggaatag；

btk-1r：aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag；

btk-2f：tgtaaaacgacggccagtggaaccaagagggatgaggat；

btk-2r：aacagctatgaccatgctttgactttccggctttagc；

btk-3f：tgtaaaacgacggccagtttcccccacatgacaggtc；

btk-3r：aacagctatgaccatgcaaatctgctgttccccatc；

btk-4f：tgtaaaacgacggccagtttctttggtgtatggtgtagca；

btk-4r：aacagctatgaccatgcagtctcatttcttggttcagc；

btk-5f：tgtaaaacgacggccagtgagcttttaaacgctacattcc；

btk-5r：aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct；

btk-6+f：tgtaaaacgacggccagtgcagttgcttgaagttcacca；

btk-6+r：aacagctatgaccatgtgattggattacatggttgctg；

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進(jìn)一步地，所述寡核苷酸還包括一對(duì)測(cè)序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進(jìn)一步地，btk-1f：btk-1r、btk-2f：btk-2r、btk-3f：btk-3r、btk-4f：btk-4r、btk-5f：btk-5r和btk-6+f：btk-6+r的比值均為1。

進(jìn)一步地，m13f：m13r的比值為1。

進(jìn)一步地，btk-1f、btk-1r、btk-2f、btk-2r、btk-3f、btk-3r、btk-4f、btk-4r、btk-5f、btk-5r、btk-6+f和btk-6+r與m13f的比值均為3.125。

進(jìn)一步地，所述檢測(cè)體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液還包括2×pcrbuffer、dntps和kodfxdnapolymerase。

進(jìn)一步地，所述測(cè)序體系反應(yīng)液還包括測(cè)序純化液、牛小腸堿性磷酸酶、edta、無(wú)水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。

進(jìn)一步地，所述測(cè)序純化液包括核酸外切酶i、牛小腸堿性磷酸酶。

進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品。

進(jìn)一步地，所述試劑盒在輔助檢測(cè)無(wú)丙種球蛋白血癥中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，btk-1f/btk-1r是一對(duì)擴(kuò)增btk基因ph區(qū)第1外顯子序列的引物，btk-2f/btk-2r是一對(duì)擴(kuò)增btk基因ph區(qū)第2外顯子序列的引物，btk-3f/btk-3r是一對(duì)擴(kuò)增btk基因ph區(qū)第3外顯子序列的引物，btk-4f/btk-4r是一對(duì)擴(kuò)增btk基因ph區(qū)第4外顯子序列的引物，btk-5f/btk-5r是一對(duì)擴(kuò)增btk基因ph區(qū)第5外顯子序列的引物，btk-6+f/btk-6+r除了能夠擴(kuò)增btk基因ph區(qū)第6外顯子之外，還能夠擴(kuò)增與btk基因ph區(qū)相鄰的一個(gè)區(qū)域上的一個(gè)外顯子。

有益效果：(1)本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增btk基因ph區(qū)全部6個(gè)外顯子序列的擴(kuò)增引物，通過(guò)加接頭，使所有6對(duì)引物的pcr產(chǎn)物均可以用一對(duì)測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，而現(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)要對(duì)每種擴(kuò)增產(chǎn)物設(shè)計(jì)特異性的測(cè)序引物，這就需要設(shè)計(jì)6條測(cè)序引物(單向測(cè)序)或12條測(cè)序引物(雙向測(cè)序)，因此，本發(fā)明采用的引物在覆蓋突變多發(fā)區(qū)域的同時(shí)顯著地減少了引物的使用對(duì)數(shù)，同時(shí)也顯著降低引物使用成本；(2)本發(fā)明采用pcr技術(shù)，通過(guò)調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴(kuò)增效率達(dá)到最佳；(3)常用的熒光定量pcr法要針對(duì)btk基因ph區(qū)的不同突變類型設(shè)計(jì)多個(gè)探針，因此，在ph區(qū)的6個(gè)外顯子中，如果每個(gè)外顯子存在5個(gè)突變位點(diǎn)，則要設(shè)計(jì)30個(gè)探針，檢測(cè)成本顯著增加，而本發(fā)明通過(guò)給設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物添加接頭，僅需使用一對(duì)測(cè)序引物就可檢測(cè)這30個(gè)突變位點(diǎn)以及還未被發(fā)現(xiàn)的其他突變類型，從而使得檢測(cè)成本顯著降低。

附圖說(shuō)明

圖1為btk基因在染色體上的定位圖。

圖2為btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r、btk-6+f/btk-6+r的電泳圖。

圖3、4、5、6、7、8分別為樣本1btk第1、2、3、4、5、6+號(hào)外顯子測(cè)序截圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實(shí)施例1

檢測(cè)btk基因突變的寡核苷酸，該寡核苷酸是針對(duì)btk基因ph區(qū)外顯子突變所設(shè)計(jì)的，包括至少一對(duì)擴(kuò)增引物，所述至少一對(duì)擴(kuò)增引物選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r，其堿基序列為：

btk-1f：tgtaaaacgacggccagtacagttgagggggtggaatag；

btk-1r：aacagctatgaccatgcggcctctctaatcaccagaag；

btk-2f：tgtaaaacgacggccagtggaaccaagagggatgaggat；

btk-2r：aacagctatgaccatgctttgactttccggctttagc；

btk-3f：tgtaaaacgacggccagtttcccccacatgacaggtc；

btk-3r：aacagctatgaccatgcaaatctgctgttccccatc；

btk-4f：tgtaaaacgacggccagtttctttggtgtatggtgtagca；

btk-4r：aacagctatgaccatgcagtctcatttcttggttcagc；

btk-5f：tgtaaaacgacggccagtgagcttttaaacgctacattcc；

btk-5r：aacagctatgaccatgcttttcctcccgtctatctcct；

btk-6+f：tgtaaaacgacggccagtgcagttgcttgaagttcacca；

btk-6+r：aacagctatgaccatgtgattggattacatggttgctg。

所述寡核苷酸還包括一對(duì)測(cè)序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

一種檢測(cè)btk基因突變的試劑盒，包括檢測(cè)體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液和測(cè)序體系反應(yīng)液，其中，

測(cè)體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液包括：2×pcrbuffer(10.0μl)；dntps(2mm)；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；btk基因ph區(qū)各個(gè)外顯子的上、下游引物btk-1f(10μm)、btk-1r(10μm)、btk-2f(10μm)、btk-2r(10μm)、btk-3f(10μm)、btk-3r(10μm)、btk-4f(10μm)、btk-4r(10μm)、btk-5f(10μm)、btk-5r(10μm)、btk-6+f(10μm)、btk-6+r(10μm)。

測(cè)序體系反應(yīng)液包括：測(cè)序純化液(核酸外切酶i:0.6u，牛小腸堿性磷酸酶:1.2u)；edta(125mm)；無(wú)水乙醇；75％乙醇；hidi(高度去離子甲酰胺)；一對(duì)測(cè)序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)；bigdyeterminatorv3.1(購(gòu)買自美國(guó)appliedbiosystems公司)。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括血液dna抽提試劑。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品。陽(yáng)性對(duì)照品為含有人btk基因ph區(qū)外顯子dna的溶液，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。陰性對(duì)照品為ddh2o?？瞻讓?duì)照品為2μl生理鹽水或不加任何物質(zhì)。

實(shí)施例2血液樣本dna抽提

血液樣本dna抽提(根據(jù)天根生物血液/細(xì)胞/組織基因dna提取試劑盒說(shuō)明書)：抽提人血液樣本dna，具體抽提方法如下：

(1)抽取300μl血液加入900μl紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。12000rpm離心1min，吸去上清，留下白細(xì)胞沉淀，加200μl緩沖液ga，振蕩至徹底混勻；

(2)加入20μl蛋白酶k溶液，混勻；

(3)加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

(4)加入200μl無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中；

(6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

(7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

(8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12000rpm離心30秒，倒掉廢液；

(9)將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

(10)將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液te，室溫放置2～5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

實(shí)施例3樣本dna擴(kuò)增

按照實(shí)施例2抽提的血液樣本dna，然后利用實(shí)施例1中的擴(kuò)增引物擴(kuò)增btk基因ph區(qū)外顯子，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增時(shí)在常規(guī)pcr儀上進(jìn)行，可用儀器包括abiveriti(美國(guó)appliedbiosystems公司)等。詳情如下所示：

(i)按樣品數(shù)n(樣品數(shù)＝待測(cè)樣本數(shù)+陰性對(duì)照1個(gè)+陽(yáng)性對(duì)照1個(gè)+空白對(duì)照1個(gè))取測(cè)體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液，每管19μl分裝于反應(yīng)管中；

(ii)將上述處理好的待測(cè)樣本和陰性對(duì)照品、陽(yáng)性對(duì)照品各取1μl分別加入反應(yīng)管中，混勻，低速離心數(shù)秒，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。測(cè)體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液配制方法如表1所示。pcr擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)條件如表2所示。每對(duì)擴(kuò)增引物的詳細(xì)信息如表3所示。

表1.測(cè)體系pcr擴(kuò)增反應(yīng)液配制

注：表中的primerf和primerr選自btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r，或btk-6+f/btk-6+r。

表2.pcr擴(kuò)增擴(kuò)增反應(yīng)條件

表3.每對(duì)擴(kuò)增引物信息

注：表中的“6+”的含義是一對(duì)引物btk-6+f/btk-6+r，除了能夠擴(kuò)增btk基因ph區(qū)第6外顯子之外，還能夠擴(kuò)增與btk基因ph區(qū)相鄰的一個(gè)區(qū)域上的一個(gè)外顯子。

實(shí)施例4sanger測(cè)序

取9μl實(shí)施例3中的擴(kuò)增產(chǎn)物和2μl實(shí)施例1中的測(cè)序純化液按照表4中所述的程序進(jìn)行純化，從而獲得純化產(chǎn)物。

表4純化程序

將1μl所獲得的純化產(chǎn)物分別與實(shí)施例1中的測(cè)序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)按照表5中的體系進(jìn)行混合，然后按照表6中的測(cè)序反應(yīng)程序進(jìn)行測(cè)序。

表5

表6.測(cè)序反應(yīng)程序

沉淀環(huán)節(jié)：

向完成測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物中加入2μl125mm的edta，靜置5min；加入15l無(wú)水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50l70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μlhidi后進(jìn)行變性試驗(yàn)。變性試驗(yàn)步驟如表7所示。

表7變性試驗(yàn)步驟

變性程序結(jié)束后，上測(cè)序儀(abi3730)測(cè)序。

(7)結(jié)果判斷：分別將測(cè)序結(jié)果與btk基因野生型參考序列(genbankaccn：nc_000005.10)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)實(shí)際突變情況對(duì)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。

實(shí)施例5臨床樣本檢測(cè)

取3例臨床血液樣本(樣本編號(hào)為1～3)先后按照實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3和實(shí)施例4，配制試劑、抽提樣本dna、擴(kuò)增(獲得擴(kuò)增產(chǎn)物)和測(cè)序。

利用所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，開展dna電泳，電泳條件為1.5％瓊脂糖凝膠電泳，110v，25min，凝膠成像系統(tǒng)觀察。電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2為這3例血液樣本以btk-1f/btk-1r、btk-2f/btk-2r、btk-3f/btk-3r、btk-4f/btk-4r、btk-5f/btk-5r、btk-6+f/btk-6+r等6對(duì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增后所得擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜，m為markerdl2000，1～3為送檢的血液樣本編號(hào)1～3號(hào)。這6對(duì)引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度分別為443bp、408bp、266bp、537bp、368bp、820bp，通過(guò)電泳圖的分析表明這6對(duì)引物擴(kuò)增有效，且條帶單一。

在這3例樣品中，以樣本1為例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。樣本1的測(cè)序結(jié)果如圖3-8所示。

圖3顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)1號(hào)外顯子野生型測(cè)序截圖，說(shuō)明樣本1的1號(hào)外顯子未發(fā)生突變。

圖4顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)2號(hào)外顯子野生型測(cè)序截圖，說(shuō)明樣本1的2號(hào)外顯子未發(fā)生突變。

圖5顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)3號(hào)外顯子野生型測(cè)序截圖，說(shuō)明樣本1的3號(hào)外顯子未發(fā)生突變。

圖6顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)4號(hào)外顯子野生型測(cè)序截圖，說(shuō)明樣本1的4號(hào)外顯子未發(fā)生突變。

圖7顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)5號(hào)外顯子野生型測(cè)序截圖，說(shuō)明樣本1的5號(hào)外顯子未發(fā)生突變。

圖8顯示是樣本1的btk基因ph區(qū)6+號(hào)外顯子野生型測(cè)序截圖，說(shuō)明樣本1的6+號(hào)外顯子未發(fā)生突變，其中“6+”的含義是一對(duì)引物btk-6+f/btk-6+r，除了能夠擴(kuò)增btk基因ph區(qū)第6外顯子之外，還能夠擴(kuò)增與btk基因ph區(qū)相鄰的一個(gè)區(qū)域上的一個(gè)外顯子。

從檢測(cè)結(jié)果可以看出，本發(fā)明已經(jīng)把btk基因ph區(qū)外顯子序列包括在內(nèi)了，能夠擴(kuò)增出btk基因ph區(qū)全部外顯子，以及與btk基因ph區(qū)相鄰的一個(gè)區(qū)域上的一個(gè)外顯子，并且測(cè)序結(jié)果完全準(zhǔn)確。由檢測(cè)結(jié)果可知，樣本1的btk基因ph區(qū)的6個(gè)外顯子和相鄰一個(gè)區(qū)域上的一個(gè)外顯子均為野生型。另外，對(duì)btk基因ph區(qū)突變陽(yáng)性樣本的檢測(cè)也表明本發(fā)明的寡核苷酸、方法和試劑盒能夠檢測(cè)出btk基因ph區(qū)外顯子及其相鄰一個(gè)區(qū)域上的一個(gè)外顯子的突變情況。

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<110>杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

<120>檢測(cè)btk基因突變的方法、寡核苷酸及其應(yīng)用

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