本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)的蔬菜品種鑒定與良種領(lǐng)域，公開了一種快速、準(zhǔn)確檢測甜瓜種子純度的方法。

背景技術(shù)：

甜瓜果肉鮮美多汁，風(fēng)味甜美，是我國重要作物，在我國經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)中具有十分重要地位，且其種子單價(jià)高、銷售利潤可觀。在甜瓜品種制種過程中，由于人工去雄不徹底，導(dǎo)致自交種混雜，是種子純度降低最主要的因素，給生產(chǎn)和經(jīng)營帶來的商業(yè)隱患。此外，人為造假、摻假等假冒偽劣種子也導(dǎo)致了大量侵害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的事故。

為了確保甜瓜生產(chǎn)安全，常規(guī)的種子純度鑒定方法是田間形態(tài)學(xué)鑒定以及基于核基因組的分子標(biāo)記鑒定。雖然田間形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果可靠，實(shí)施簡單，但需要占據(jù)大量寶貴的溫室空間，且檢測周期長，耗時(shí)費(fèi)工，難以滿足實(shí)際生產(chǎn)需求；而隨著基因技術(shù)的快速房展，基于核基因組的分子標(biāo)記鑒定技術(shù)已經(jīng)在一些蔬菜作物品種種子純度檢驗(yàn)中得到應(yīng)用。

申請?zhí)枮?01310305714.9，公布號(hào)為cn103627786a的中國發(fā)明專利申請公開了一種甜瓜種子純度檢驗(yàn)的方法，是利用ssr分子標(biāo)記對金露三號(hào)甜瓜種子進(jìn)行純度檢驗(yàn)的方法。其利用一對ssr引物flwssrl和flwssrr對甜瓜雜交品種金露三號(hào)的父母本和雜交一代的基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳分離，找出雜交一代與父母本差異的特征譜帶，通過受檢種子純度計(jì)算，對金露三號(hào)雜一代種子樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。申請?zhí)枮?01410332784.8，公布號(hào)為cn104059992a的發(fā)明專利申請公開了一種基于est-ssr標(biāo)記的甜瓜品種綠天使雜交種種子純度鑒定的方法。該方法以甜瓜品種綠天使雜交種及其雙親的基因組dna為模板，通過genebank數(shù)據(jù)庫上公布的214條甜瓜est序列，利用primer3.0在線引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了57對est-ssr引物。經(jīng)過篩選，得到1對雜交種帶型為雙親的互補(bǔ)帶型引物，經(jīng)田間驗(yàn)證試驗(yàn)引物穩(wěn)定性良好，且與田間試驗(yàn)結(jié)果較為吻合，能夠?qū)μ鸸想s交品種進(jìn)行純度鑒定。但是核基因組的鑒定技術(shù)，由于親本材料遺傳背景不確定，需要大規(guī)模篩選核基因組特異標(biāo)記，限制了品種純度檢測的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所解決的現(xiàn)有技術(shù)的問題是：雖然基于核基因組dna的鑒定技術(shù)在解決了常規(guī)田間形態(tài)學(xué)鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但是現(xiàn)有的基于甜瓜種子的純度的鑒定方法集中在對于甜瓜核基因組dna的鑒定，而針對核基因組dna的鑒定技術(shù)，由于親本材料遺傳背景不確認(rèn)，需要大規(guī)模篩選核基因組特異標(biāo)記，從而限制了甜瓜品種純度檢測的效率。

本發(fā)明基于前期發(fā)現(xiàn)，即甜瓜線粒體基因組表現(xiàn)出的獨(dú)特的父系遺傳特性，設(shè)計(jì)了基于甜瓜線粒體基因組的引物序列，用來檢測甜瓜品種純度。甜瓜線粒體基因組表現(xiàn)出的獨(dú)特的父系遺傳特性，為甜瓜種子純度鑒定提供了優(yōu)良的檢測載體，具有以下優(yōu)越性：(1)父系遺傳，通過父本材料的花粉進(jìn)行傳播，可鑒定、追溯品種的父本來源；(2)單親遺傳，檢測結(jié)果清晰明了，可快速判斷品種純度；(3)多態(tài)性高，甜瓜線粒體基因組龐大，存在大量重復(fù)序列，序列變異速度高于核基因組；(4)表現(xiàn)中性，遺傳方式獨(dú)立于核基因組，并不與不良性狀存在連鎖關(guān)系；(5)拷貝數(shù)多，相對其他核基因組分子標(biāo)記所具有更高的穩(wěn)定性及檢測效率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了一種用于甜瓜種子純度檢測的特異性序列，所述序列選自以下序列組中的一組或兩組以上：

seqidno.01和seqidno.02；seqidno.03和seqidno.04；seqidno.05和seqidno.06；seqidno.07和seqidno.08；seqidno.09和seqidno.10；seqidno.11和seqidno.12；seqidno.13和seqidno.14；seqidno.15和seqidno.16；seqidno.17和seqidno.18；seqidno.19和seqidno.20；seqidno.21和seqidno.22；seqidno.23和seqidno.24；seqidno.25和seqidno.26；seqidno.27和seqidno.28；seqidno.29和seqidno.30；seqidno.31和seqidno.32；seqidno.33和seqidno.34；seqidno.35和seqidno.36；seqidno.37和seqidno.38；seqidno.39和seqidno.40；seqidno.41和seqidno.42；seqidno.43和seqidno.44；seqidno.45和seqidno.46；seqidno.47和seqidno.48；seqidno.49和seqidno.50；seqidno.51和seqidno.52；seqidno.53和seqidno.54；seqidno.55和seqidno.56；seqidno.57和seqidno.58；seqidno.59和seqidno.60；seqidno.61和seqidno.62；seqidno.63和seqidno.64；seqidno.65和seqidno.66；seqidno.67和seqidno.68；seqidno.69和seqidno.70；seqidno.71和seqidno.72；seqidno.73和seqidno.74；seqidno.75和seqidno.76；seqidno.77和seqidno.78；或者seqidno.79和seqidno.80。

本發(fā)明還提供了一種甜瓜種子純度檢測的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)提取被測樣本的基因組dna；

(2)利用引物序列對樣本線粒體基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增和檢測；

(3)對檢測結(jié)果進(jìn)行ssr多態(tài)性標(biāo)記和特征條帶統(tǒng)計(jì)；

(4)計(jì)算甜瓜種子純度。

優(yōu)選的，以上方法中，步驟(1)中所述被測樣本包括親本材料和群體材料。

優(yōu)選的，以上方法中，步驟(2)中所述引物序列選自以下序列組中的一組或兩組以下：

seqidno.01和seqidno.02；seqidno.03和seqidno.04；seqidno.05和seqidno.06；seqidno.07和seqidno.08；seqidno.09和seqidno.10；seqidno.11和seqidno.12；seqidno.13和seqidno.14；seqidno.15和seqidno.16；seqidno.17和seqidno.18；seqidno.19和seqidno.20；seqidno.21和seqidno.22；seqidno.23和seqidno.24；seqidno.25和seqidno.26；seqidno.27和seqidno.28；seqidno.29和seqidno.30；seqidno.31和seqidno.32；seqidno.33和seqidno.34；seqidno.35和seqidno.36；seqidno.37和seqidno.38；seqidno.39和seqidno.40；seqidno.41和seqidno.42；seqidno.43和seqidno.44；seqidno.45和seqidno.46；seqidno.47和seqidno.48；seqidno.49和seqidno.50；seqidno.51和seqidno.52；seqidno.53和seqidno.54；seqidno.55和seqidno.56；seqidno.57和seqidno.58；seqidno.59和seqidno.60；seqidno.61和seqidno.62；seqidno.63和seqidno.64；seqidno.65和seqidno.66；seqidno.67和seqidno.68；seqidno.69和seqidno.70；seqidno.71和seqidno.72；seqidno.73和seqidno.74；seqidno.75和seqidno.76；seqidno.77和seqidno.78；或者seqidno.79和seqidno.80。

優(yōu)選的，以上方法中，步驟(2)中所述pcr擴(kuò)增為touch-downpcr。

優(yōu)選的，以上方法中，touch-downpcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?4-95℃預(yù)變性2-5min；然后94-95℃變性20-30s，65-70℃退火50s-2min，72℃延伸30-60s，共5-8個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低2℃；然后94-95℃變性20s，55-60℃退火1min，72℃延伸30-60s，共7-10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃；然后94-95℃變性20-30s，50-55℃退火30s，72℃延伸30s，共13-18個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min保存。

優(yōu)選的，以上方法中，步驟(2)中采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。

優(yōu)選的，以上方法中，步驟(2)中采用8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。

優(yōu)選的，以上方法中，步驟(4)中根據(jù)甜瓜群體材料的特征條帶結(jié)果，分別統(tǒng)計(jì)與父本材料和母本材料條帶一致的個(gè)體數(shù)量，計(jì)算種子純度。

本發(fā)明還提供了以上所述的特異性序列在甜瓜種子純度檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明所取得的有益效果是：本發(fā)明通過提供一種利用線粒體基因組ssr標(biāo)記快速檢測甜瓜種子純度的方法，該套標(biāo)記的發(fā)明用于甜瓜種子純度檢測，不僅具有試驗(yàn)結(jié)果的可靠性及穩(wěn)定性等基本特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用過程中還具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，適宜于構(gòu)建大規(guī)模品種的線粒體基因組特異性指紋圖譜、大量樣品種子純度的快速檢測以及假冒偽劣品種的鑒定等。該方法不僅避免了田間表型鑒定的繁雜耗時(shí)工作，而且較基于核基因組分子標(biāo)記更加高效，能快速檢測甜瓜種子純度和真?zhèn)?，大幅度提高工作效率，將有力促進(jìn)甜瓜品種保護(hù)以及生產(chǎn)、經(jīng)營者的合法權(quán)益。

附圖說明

圖1是多態(tài)性引物在‘夏蜜’親本材料的pcr擴(kuò)增結(jié)果，其中marker為dl2000marker，m為母本，p為父本，ddh2o為陰性對照；

圖2是引物mtssr34對‘夏蜜’親本及其雜交種的pcr擴(kuò)增結(jié)果，其中marker為dl2000marker，m為母本，p為父本，1-50為‘夏蜜’雜交種；

圖3是引物mtssr20對‘夏蜜’親本及其雜交種的pcr擴(kuò)增結(jié)果，其中marker為dl2000marker，m為母本，p為父本，1-50為‘夏蜜’雜交種；

圖4是引物mtssr15對‘夏蜜’親本及其雜交種的pcr擴(kuò)增結(jié)果，其中marker為dl2000marker，m為母本，p為父本，1-50為‘夏蜜’雜交種。

具體實(shí)施方式

如上所述，本發(fā)明提供了一種用于甜瓜種子純度檢測的特異性序列。

甜瓜線粒體基因組ssr標(biāo)記是基于甜瓜線粒體基因組中的簡單串聯(lián)重復(fù)序列的側(cè)翼保守序列開發(fā)的一類分子標(biāo)記，特異性擴(kuò)增在遺傳學(xué)上定義為一個(gè)位點(diǎn)的dna片段。一般擴(kuò)增片段長度為100-200bp，檢測方便。同時(shí)由于檢測載體為線粒體基因組，具有父系遺傳以及多拷貝的特點(diǎn)，因此具有帶型單一、簡單，重復(fù)性及穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。所以，本發(fā)明將甜瓜線粒體基因組ssr標(biāo)記成為甜瓜品種分子育種、品種鑒定以及種子純度檢測的首選。在該基礎(chǔ)上，針對線粒體基因組dna設(shè)計(jì)了40對特異性引物序列，對甜瓜線粒體基因組進(jìn)行ssr標(biāo)記，然后利用親本材料之間的多態(tài)性標(biāo)記，從中篩選出18對特異性引物序列，準(zhǔn)確分辨品種群體中自交種和雜交種，計(jì)算種子純度。

甜瓜屬作為線粒體父系遺傳的植物，相比較于其他的線粒體父系遺傳的植物，甜瓜線粒體基因組更加復(fù)雜，基因組更加龐大，包含不同的scaffold。所以在前期設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記時(shí)，需要付出大量的工作。另一方面，因?yàn)樘鸸系木€粒體基因組的特殊性，具有大量重復(fù)序列，所以通過篩選出的40對引物的一種或者多種組合，其具有很高的實(shí)用性。

在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，采用以下序列組中的一種或者兩種以上可以用于甜瓜種子的多態(tài)性標(biāo)記，進(jìn)一步用來鑒定種子純度：seqidno.01和seqidno.02；seqidno.03和seqidno.04；seqidno.05和seqidno.06；seqidno.07和seqidno.08；seqidno.09和seqidno.10；seqidno.11和seqidno.12；seqidno.13和seqidno.14；seqidno.15和seqidno.16；seqidno.17和seqidno.18；seqidno.19和seqidno.20；seqidno.21和seqidno.22；seqidno.23和seqidno.24；seqidno.25和seqidno.26；seqidno.27和seqidno.28；seqidno.29和seqidno.30；seqidno.31和seqidno.32；seqidno.33和seqidno.34；seqidno.35和seqidno.36；seqidno.37和seqidno.38；seqidno.39和seqidno.40；seqidno.41和seqidno.42；seqidno.43和seqidno.44；seqidno.45和seqidno.46；seqidno.47和seqidno.48；seqidno.49和seqidno.50；seqidno.51和seqidno.52；seqidno.53和seqidno.54；seqidseqidno.55和seqidno.56；seqidno.57和seqidno.58；no.59和seqidno.60；seqidno.61和seqidno.62；seqidno.63和seqidno.64；seqidno.65和seqidno.66；seqidno.67和seqidno.68；seqidno.69和seqidno.70；seqidno.71和seqidno.72；seqidno.73和seqidno.74；seqidno.75和seqidno.76；seqidno.77和seqidno.78；或者seqidno.79和seqidno.80。例如，采用引物序列組：seqidno.67和seqidno.68可以用于鑒定甜瓜種子的純度。采用引物序列組組合，包括：seqidno.29和seqidno.30，引物序列組seqiidno.39和seqidno.40，鑒定甜瓜種子純度。采用兩組或兩種以上序列組鑒定甜瓜種子純度，相互之間可以用來驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。因?yàn)檫@40組序列在甜瓜中多態(tài)性較高，所以，通過這些序列對之間的隨機(jī)組合，例如seqidno.01和seqidno.02，與seqidno.03和seqidno.04序列組合可以用于檢測某個(gè)甜瓜品種的種子純度；再如采用序列seqidno.15和seqidno.16，與序列seqidno.21和seqidno.22，與序列seqidno.37和序列seqidno.38組合可以用于檢測另外一個(gè)甜瓜品種的種子純度。因?yàn)榘l(fā)明人所設(shè)計(jì)的引物序列在甜瓜屬中高的多態(tài)性，因此可以適用于不同甜瓜品種的種子純度的檢測，實(shí)用性非常高。

同時(shí)本發(fā)明還提供了一種基于甜瓜線粒體基因組ssr標(biāo)記進(jìn)行甜瓜種子純度檢測的方法。

其中在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種基于線粒體基因組ssr標(biāo)記快速檢測甜瓜種子純度的方法，其包含以下步驟：

(1)親本材料及品種群體材料dna的提取；

(2)親本材料之間標(biāo)記的touch-downpcr擴(kuò)增及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；

(3)親本材料之間多態(tài)性標(biāo)記以及特征條帶統(tǒng)計(jì)；

(4)多態(tài)性線粒體ssr標(biāo)記特征描述及群體純度檢測，根據(jù)甜瓜群體材料的特征條帶結(jié)果，獲得與父本、母本材料條帶一致個(gè)體數(shù)量，由此計(jì)算種子純度。

其中，touchdownpcr是一種尋找最佳復(fù)性溫度的方法。隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時(shí)已經(jīng)擴(kuò)增出來，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。利用“熱循環(huán)pcr儀”在連續(xù)的循環(huán)中逐漸降低復(fù)性溫度的方法來確定最適的ta值，所以只用一次pcr就可以確定最適ta值，避免了對每對引物進(jìn)行最佳復(fù)性溫度的優(yōu)化與測定工作。采用touchdownpcr的方法可以簡化退化溫度的優(yōu)化程度，同時(shí)提高實(shí)驗(yàn)效率。

下面對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。需要說明的是，以下采用的甜瓜品種僅僅是作為品種代表，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的40對引物可以適用于不同甜瓜品種的種子純度的檢測。

實(shí)施例一

(一)甜瓜線粒體基因組dna引物序列的設(shè)計(jì)

根據(jù)甜瓜線粒體基因組dna序列，設(shè)計(jì)了大量的引物序列，超過600對以上的引物序列，然后經(jīng)過常規(guī)實(shí)驗(yàn)的篩選，篩選出40對引物，40對引物具有較高的多態(tài)性，將這些引物進(jìn)一步用作甜瓜品種純度的檢測。

表1用于線粒體基因組ssr標(biāo)記的引物序列及相關(guān)信息

(二)對甜瓜線粒體進(jìn)行多態(tài)性ssr標(biāo)記和純度鑒定

1.甜瓜材料的準(zhǔn)備：以甜瓜新品種‘夏蜜’及其親本為實(shí)例樣品(夏蜜品種浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所培育的品種，可以通過購買得到)，55℃浸種崔芽后播種于穴盤內(nèi)，于兩葉一心期進(jìn)行移栽，并在幼苗期進(jìn)行單株編號(hào)，隨機(jī)選取親本材料以及‘夏蜜’材料50株，取幼嫩葉片備用。

2.甜瓜基因組dna提取

根據(jù)植物基因組dna快速提取試劑盒(購自于杭州寶賽生物科技有限公司)說明書提取dna，簡要如下：

(1)取適量甜瓜幼嫩葉片(100mg)于2ml離心管中，加入玻璃珠并置于液氮中冷卻，使用植物組織研磨儀進(jìn)行充分研磨；

(2)加入500μl已在65℃預(yù)熱的pl1(已經(jīng)加入β-巰基乙醇至0.2％)以及5μlrnasea，劇烈渦旋震蕩，在65℃的水浴鍋中溫浴10min；

(3)加入170μl的bufferpl2溶液，充分混勻，室溫放置5min，12000rpm離心5min，將上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的離心管中；

(4)向上述溶液中加入750μl的pl3溶液，立刻混勻，并將所得溶液轉(zhuǎn)入吸附柱rb中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；

(5)向吸附柱中加入700μl漂洗液wb，12000rpm離心1min，倒掉廢液；

(6)重復(fù)(5)步驟一次；

(7)將吸附柱rb放回收集管中，12000rpm離心2min，除盡漂洗液；

(8)取出吸附柱rb，放入新的1.5ml離心管中，在吸附柱中加入100μl雙蒸水，室溫靜置3min，12000rpm離心1min，洗脫基因組dna；

(9)dna經(jīng)純度及濃度檢測，稀釋到50ng/μl，存放于-20℃冰箱中備用。

3.甜瓜線粒體基因組ssr擴(kuò)增

采用標(biāo)準(zhǔn)ssr-pcr擴(kuò)增體系，總體積為25μl，具體包括：2×taqmastermix為12.5μl，正反向線粒體ssr引物終濃度為0.4μm，模板dna為50ng，用去離子無菌水補(bǔ)足25μl體系。

其中，正反向線粒體ssr引物為表1中所列出的所有引物，將不同組的正反向引物分別加入到不同的pcr試管中，配制共計(jì)40組擴(kuò)增體系樣品。

pcr擴(kuò)增體系采用touch-down程序，具體程序?yàn)椋?/p>

94℃預(yù)變性2min；然后94℃變性20s，68℃退火1min，72℃延伸30s，共6個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低2℃；然后94℃變性20s，58℃退火1min，72℃延伸30s，共9個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃；然后94℃變性20s，50℃退火30s，72℃延伸30s，共15個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min，16℃保存。

4.聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

pcr擴(kuò)增結(jié)束后，采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×tbe，0.8～1.0μl上樣，200v電泳2.5～3.0h后，銀染顯色，拍照采集電泳圖像并統(tǒng)計(jì)多樣性。具體的凝膠溶液包括：取丙烯酰胺溶液(具體溶液配制：稱取145g丙烯酰胺以及5g甲叉-雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至500ml)25ml，5×tbe15ml，去離子無菌水35ml，10％的過硫酸銨溶液750μl以及temd為60μl。

具體的染膠流程為：

(1)拆膠后放入去離子水中清洗一遍；

(2)加入0.2％的硝酸銀溶液，并在搖床上緩慢搖晃8～10min；

(3)倒掉硝酸銀溶液，再用去離子水清洗兩遍；

(4)加入含有1.5％的氫氧化鈉以及0.4％甲醛的顯色液，搖床上緩慢搖晃，直至顯色成功；

(5)倒掉顯色液，自來水清洗兩遍，使用保鮮膜包裹，晾干觀察。

5.多態(tài)性線粒體ssr標(biāo)記篩選

在甜瓜‘夏蜜’親本材料之間進(jìn)行多態(tài)性分析，隨機(jī)選取母本及父本材料各10株，分別建立母本、父本dna混池，進(jìn)行多態(tài)性線粒體ssr標(biāo)記篩選。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，在40對線粒體ssr標(biāo)記中，有39對標(biāo)記可擴(kuò)增出穩(wěn)定且清晰的條帶，不同引物擴(kuò)增的條帶大小為100～200bp之間，其中在親本之間表現(xiàn)為多態(tài)性的標(biāo)記有18對，如圖1所示，占總標(biāo)記數(shù)的45％。

6.多態(tài)性標(biāo)記對‘夏蜜’群體種子純度的鑒定

實(shí)驗(yàn)選用由步驟5制備篩選的引物序列，對夏蜜群體種子純度進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)過程中，分別以引物mtssr34(即引物序列seqidno.67和seqidno.68)，引物mtssr20(即引物序列seqidno.39和seqidno.40)，引物mtssr15(即引物序列seqidno.29和seqidno.30)為例，對夏蜜群體種子純度進(jìn)行鑒定。

其中，甜瓜群體種子純度的計(jì)算公式為：

種子純度＝雜交種子數(shù)/供檢測樣品種子數(shù)×100％

(1)使用引物mtssr34對‘夏蜜’親本材料及50個(gè)‘夏蜜’單株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在49個(gè)單株中都能擴(kuò)增出‘夏蜜’父本材料特異性條帶，1個(gè)單株(單株9)的擴(kuò)增條帶與‘夏蜜’母本材料一致(如圖2所示)。因?yàn)樘鸸暇€粒體基因組表現(xiàn)出獨(dú)特的父系遺傳，而單株9的擴(kuò)增條帶與“夏蜜”母本材料一致，因此，推斷單株9為母本自交種，‘夏蜜’群體的雜交率及純度為98％。

(2)使用引物mtssr20對‘夏蜜’親本材料及50個(gè)‘夏蜜’單株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在49個(gè)單株中都能擴(kuò)增出‘夏蜜’父本材料特異性條帶，1個(gè)單株(單株9)的擴(kuò)增條帶與‘夏蜜’母本材料一致(如圖3所示)。因此，推斷單株9為母本自交種，‘夏蜜’群體的雜交率及純度為98％。

(3)使用引物mtssr15對‘夏蜜’親本材料及50個(gè)‘夏蜜’單株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，在49個(gè)單株中都能擴(kuò)增出‘夏蜜’父本材料特異性條帶，1個(gè)單株(單株9)的擴(kuò)增條帶與‘夏蜜’母本材料一致(如圖4所示)。因此，推斷單株9為母本自交種，‘夏蜜’群體的雜交率及純度為98％。

基于以上結(jié)果，引物mtssr34、mtssr20和mtssr15均能準(zhǔn)確分辨‘夏蜜’群體中的自交種和雜交種，并快速鑒定種子的純度，且相互驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。

實(shí)施例二

將實(shí)施例一通過引物進(jìn)行多態(tài)性檢測的結(jié)果與田間試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比，分別將夏蜜品種母本、父本以及夏蜜群體按照表2進(jìn)行編號(hào)。按照《甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》對雌花花瓣形狀、子房形狀、成熟果果皮底色、成熟種子顏色分別進(jìn)行描述，結(jié)果見表2。

表2田間試驗(yàn)結(jié)果

其中，表2中a為第一雌花節(jié)位上雌花花瓣形狀，主要針對雌花開放時(shí)花瓣頂端形狀，b為第一雌花節(jié)位雌花開放時(shí)子房的外部輪廓形狀，c為甜瓜果實(shí)成熟時(shí)果實(shí)表面的顏色，d為甜瓜果實(shí)成熟后，成熟種子表面的顏色。

從表2可以看出，夏蜜9的形狀表現(xiàn)與夏蜜母本一致，與采用引物序列檢測的結(jié)果相一致。

以上僅僅是本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式，本發(fā)明的發(fā)明人還采用了其他的甜瓜品種進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，引物序列檢測結(jié)果同田間檢測結(jié)果均保持一致。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物序列具有很高的實(shí)用性，可以用于甜瓜品種種子純度的檢測。

綜上所述，本發(fā)明首次基于甜瓜線粒體基因組父系遺傳特性，開發(fā)了一套多態(tài)性較高的甜瓜線粒體基因組ssr標(biāo)記，用于甜瓜種子純度的快速檢測，并為進(jìn)一步構(gòu)建甜瓜品種的特異性線粒體指紋圖譜，追溯花粉污染來源以及鑒定假冒偽劣品種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明以甜瓜品種‘夏蜜’為示例，也可應(yīng)用于其他甜瓜品種種子純度的鑒定。實(shí)驗(yàn)過程中共設(shè)計(jì)了40對甜瓜線粒體ssr標(biāo)記在甜瓜‘夏蜜’親本材料之間進(jìn)行多態(tài)性分析，共檢測到18對多態(tài)性標(biāo)記?；谶@些多態(tài)性標(biāo)記對‘夏蜜’群體進(jìn)行鑒定，雜交種的特異條帶與父本一致，自交種的特異條帶與母本一致。因此可以利用甜瓜線粒體父系遺傳特性，快速準(zhǔn)確鑒定‘夏蜜’種子純度，鑒定群體中表現(xiàn)為母本材料特異條帶單株的比率就是自交種子的比率。

應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。以上所述僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例，并不用于局限本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的修改、等同替換和改進(jìn)等，均需要包含在發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>甜瓜種子純度檢測的特異性序列及檢測方法和應(yīng)用

<130>oicn1701

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<170>patentinversion3.3

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