本發(fā)明屬于基因診斷制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)rhd陰性血型的引物組及其應(yīng)用。

發(fā)明背景

rh血型系統(tǒng)(rhesusmonkeys)是由著名科學(xué)家、諾貝爾獎(jiǎng)得主karllandsteiner率先從恒河猴的紅細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，故因此得名。rh血型系統(tǒng)是目前人類36個(gè)血型系統(tǒng)中最復(fù)雜的，其重要性僅次于abo系統(tǒng)，在臨床輸血、新生兒溶血病的診治中占有重要地位。rh血型系統(tǒng)中d抗原是免疫原性最強(qiáng)、多態(tài)性最復(fù)雜的。對(duì)于中國大陸的漢族人來講，rhd陰性人群只占千分之三左右，由于十分罕見，故又名熊貓血。由于rhd的強(qiáng)抗原性，導(dǎo)致rhd陰性者不能接受rhd陽性血液，因?yàn)閞hd抗原將刺激rhd陰性個(gè)體產(chǎn)生抗-rhd抗體。如果再次輸入rhd陽性血液，即可導(dǎo)致溶血性輸血反應(yīng)。同樣，若rhd陰性婦女由于妊娠或輸血刺激體內(nèi)產(chǎn)生抗-rhd抗體，再次懷孕則會(huì)導(dǎo)致新生兒溶血病的發(fā)生。

rhd血型系統(tǒng)而除了正常的rhd陽性、陰性外，還存在許多變異型，包括弱d(weakd)、部分d(partiald)及del型(放散型)。這些變異型的紅細(xì)胞表面存在不完全的、或者變異的rhd抗原，若輸注給陰性個(gè)體也有可能刺激產(chǎn)生抗體，因此這些變異型的個(gè)體有兩個(gè)主要特點(diǎn)：一是他們作為受血者和獻(xiàn)血者是不同的兩種處理，作為受血者，他們只能輸入rhd陰性血液；而作為獻(xiàn)血者，他們的血液只能作為rhd陽性血使用。二是容易漏檢，由于rhd抗原的變異，導(dǎo)致在常規(guī)的血型血清學(xué)檢測(cè)時(shí)常規(guī)抗體無法與之反應(yīng)，故易錯(cuò)判為rhd陰性，由于目前沒有特別有效的清除不規(guī)則抗體的措施，所以這對(duì)于需多次輸血的患者、妊娠期婦女來說危害十分巨大。因此準(zhǔn)確的定型是確保正確輸注的前提。目前血型的常規(guī)檢測(cè)方法是血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，但這個(gè)實(shí)驗(yàn)受多種限制，比如樣本的質(zhì)量、自身抗體或不規(guī)則抗體的干擾、疾病的影響等，同時(shí)對(duì)于del型這種只能通過吸收放散試驗(yàn)才能檢測(cè)到的類別更是無法判斷，這就需要利用分子生物學(xué)的方法在基因水平進(jìn)行診斷。

rh基因位于人類第一號(hào)染色體短臂34.3-36.1區(qū)域，由rhd基因(編碼rhd抗原)和rhce基因(編碼rhc、c、e和e抗原)緊密串聯(lián)排列組成。rhd基因和rhce基因結(jié)構(gòu)高度同源，均由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，其中兩者的第8外顯子完全相同，差異較大的是外顯子3、4、5、7、9和內(nèi)含子4。因此采用分子生物學(xué)的手段，建立rhd基因檢測(cè)系統(tǒng)，并應(yīng)用于臨床和采供血工作當(dāng)中，有助于rhd陰性個(gè)體的準(zhǔn)確檢出，有助于降低受血者不規(guī)則抗體的產(chǎn)生，有助于產(chǎn)前不規(guī)則抗體的預(yù)防和監(jiān)測(cè)，有助于降低新生兒溶血病的發(fā)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)rhd陰性血型的引物組，可以更有效的確證rhd陰性血型，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

申請(qǐng)人從226例血清學(xué)確證實(shí)驗(yàn)檢測(cè)為rhd陰性或d變異的個(gè)體進(jìn)行rhd基因測(cè)序，rhd基因1-10外顯子全部陰性的樣本166例(73.45％)，部分或全部存在的標(biāo)本60例(26.55％)，共得到11種等位基因型，分別是rhd1227g>a28例(12.39％)、rhd-ce-(2-9)-d19例(8.41％)、rhd845g>a4例(1.77％)、rhd711delc2例(0.88％)、rhd697g>a1例(0.44％)、rhd-ce-(3-7)-d1例(0.44％)、rhd3g>a1例(0.44％)、rhd1013t>c1例(0.44％)、rhd1227a/g1例(0.44％)、rhd1-10外顯子未發(fā)現(xiàn)突變1例(0.44％)、和新的snp突變導(dǎo)致rhd陰性1例(0.44％)。該新的snp位點(diǎn)是rhd基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第208位堿基發(fā)生了突變，由c突變?yōu)閠；第211位堿基發(fā)生插入了g，導(dǎo)致后續(xù)移碼突變并提前終止。通過對(duì)rhd基因的檢測(cè)可以準(zhǔn)確判定待檢血樣的rhd血型，從而促成了本發(fā)明。

本發(fā)明首先提供用于的檢測(cè)rhd陰性血型的引物對(duì)，所述引物對(duì)的上下游引物序列為seqidno:1-20中，

其具體的引物信息如下：

rhd-1f:5’-aactccatagagaggccagcac-3’seqidno:1

rhd-1r:5’-agatgggggaatctttttcctt-3’seqidno:2

rhd-2f:5’-tccccctcgtccttctcg-3’seqidno:3

rhd-2r:5’-caggatgcccagttaatttgaat-3’seqidno:4

rhd-3f:5’-ccacagaaagtaggtgcccaa-3’seqidno:5

rhd-3r:5’-tctttatttttcaaaaccctggaaa-3’seqidno:6

rhd-4f:5’-tccaaggactatcagggcttg-3’seqidno:7

rhd-4r:5’-cttcagacacccaggggaac-3’seqidno:8

rhd-5f:5’-cagccctaggattctcatccaa-3’seqidno:9

rhd-5r:5’-gcagaaatggggttcaaactg-3’seqidno:10

rhd-6f:5’-cccatcatgtccactgatgaa-3’seqidno:11

rhd-6r:5’-agccaaagcagaggaggttagtt-3’seqidno:12

rhd-7f:5’-aactccccgatgatgtgagtg-3’seqidno:13

rhd-7r:5’-caaggtaggggctggacag-3’seqidno:14

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rhd-8r:5’-tcctggcaatggtggaagaa-3’seqidno:16

rhd-9f:5’-tactgtcgttttgacacacaatatttc-3’seqidno:17

rhd-9r:5’-gggaagtgtggccagtgaaa-3’seqidno:18

rhd-10f：5’-tcagtatgtgggttcatctgcaa-3’seqidno:19

rhd-10r:5’-tggatgaccaccatcatatatgc-3’seqidno:20；

本發(fā)明其次提供用于檢測(cè)rhd陰性血型的測(cè)序引物，所述引物序列為上述擴(kuò)增序列的其中一條，其引物信息如下：

rhd-1:5’-aactccatagagaggccagcac-3’seqidno:1

rhd-2:5’-caggatgcccagttaatttgaat-3’seqidno:4

rhd-3:5’-ccacagaaagtaggtgcccaa-3’seqidno:5

rhd-4:5’-tccaaggactatcagggcttg-3’seqidno:7

rhd-5:5’-cagccctaggattctcatccaa-3’seqidno:9

rhd-6:5’-cccatcatgtccactgatgaa-3’seqidno:11

rhd-7:5’-aactccccgatgatgtgagtg-3’seqidno:13

rhd-8:5’-tggaggctctgagaggttgag-3’seqidno:15

rhd-9:5’-tactgtcgttttgacacacaatatttc-3’seqidno:17

rhd-10:5’-tggatgaccaccatcatatatgc-3’seqidno:20；

上述的引物對(duì)用于制備用于檢測(cè)檢測(cè)rhd陰性血型的制品；

所述的制品，優(yōu)選為分子檢測(cè)試劑盒，包含有上述的引物對(duì)中的任一種或幾種。

本發(fā)明提供了檢測(cè)rhd基因的引物組，從而提供了一種有效進(jìn)行rhd陰性血型的鑒定途徑，應(yīng)用效果表明本發(fā)明所提供的檢測(cè)引物可以有效的用于臨床患者及血站獻(xiàn)血員進(jìn)行rhd基因的快速檢測(cè)，從而準(zhǔn)確確定其rhd血型。

附圖說明

圖1：實(shí)施例1的部分rhd陰性或變異型的rhd基因測(cè)序圖，分別為rhd711delc，rhd3g>a，rhd1013t>c，rhd845g>a，rhd1227g>a，rhd697g>a和rhd208c>t、211insg。

圖2：實(shí)施例2的snp突變先證者及其父母rhd基因第二外顯子測(cè)序圖，其中a：先證者父親，正常rhd陽性表型，攜帶rhd全缺失基因；b：先證者母親，正常rhd陽性表型，攜帶突變基因；c：先證者，rhd陰性表型。該家系中兩名rhd基因編碼區(qū)域由起始密碼子起第208位堿基發(fā)生了突變，由c突變?yōu)閠，第211位堿基發(fā)生插入突變，插入g，導(dǎo)致后續(xù)移碼突變。

具體實(shí)施方式

申請(qǐng)人對(duì)226例血清學(xué)確證實(shí)驗(yàn)檢測(cè)為rhd陰性或d變異型的個(gè)體進(jìn)行rhd基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)rhd基因1-10外顯子全部陰性的樣本166例，部分或全部存在的標(biāo)本60例(26.55％)，共得到11種等位基因型，其中10種為已報(bào)道，1種未見報(bào)道，對(duì)新的基因型的檢測(cè)能夠用來鑒定rhd陰性或d變異型的個(gè)體，從而促成了本發(fā)明。

rh基因位于染色體1p34.3-1p36.1區(qū)域，可轉(zhuǎn)錄成2837bp的mrna(ncbi登錄號(hào)為nm_016124.4)，最終翻譯形成417個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1：從血清學(xué)rhd陰性或變異型獻(xiàn)血員中篩選rhd基因的突變位點(diǎn)

1、提取外周血基因組dna：

在符合國家相關(guān)政策規(guī)定，并在取樣對(duì)象同意的基礎(chǔ)上，抽取rhd陰性或變異型獻(xiàn)血員外周靜脈血2-5ml，放入edta抗凝管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆?；凍存的edta抗凝血在室溫融化后，取500μl放于離心管，加入等體積te(ph8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。

加入180μlte、20μlsds(10％)、8μl蛋白酶k(l0mg/ml)混勻，置于37℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時(shí)離心沉淀樣本。在反應(yīng)管中加入等體積的tris-飽和酚(約300μl)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μl)至一新離心管中。重復(fù)酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。

加入等體積的tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入等體積的tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入l/10體積3mol/l、ph5.2醋酸鈉(約30μl)，2倍體積預(yù)冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心10分鐘，使dna沉淀于管底，棄上清。

向dna沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μlte(ph8.0)，4℃過夜溶解dna。

對(duì)提取的dna行瓊脂糖膠電泳，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm比色，檢測(cè)dna純度及濃度。

2、直接測(cè)序法尋找該獻(xiàn)血員rhd基因的突變

pcr擴(kuò)增目的片段：反應(yīng)條件與反應(yīng)體系：

(1)pcr反應(yīng)條件：95℃5m；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5m。

(2)反應(yīng)體系：(onelambda公司faststarttaqpolymerase)

應(yīng)用該反應(yīng)體系分別進(jìn)行每位rhd陰性獻(xiàn)血員的基因組dna模板與該rhd引物的擴(kuò)增反應(yīng)。

pcr產(chǎn)物測(cè)序：應(yīng)用常規(guī)sanger測(cè)序法對(duì)上述pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，最終共得到11種等位基因型，分別是rhd1227g>a、rhd-ce-(2-9)-d、rhd845g>a、rhd711delc、rhd697g>a、rhd-ce-(3-7)-d、rhd3g>a、rhd1013t>c、rhd1227a/g、rhd1-10外顯子未發(fā)現(xiàn)突變和1例新的snp突變(圖1)。該snp位點(diǎn)的檢出是通過rhd-2f:5’-tccccctcgtccttctcg-3’seqidno:3和rhd-2r:5’-caggatgcccagttaatttgaat-3’seqidno:4擴(kuò)增rhd基因第二外顯子，使用rhd-2r:5’-caggatgcccagttaatttgaat-3’seqidno:4進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)第208位堿基c突變?yōu)閠，第211位堿基發(fā)生g插入突變，從而導(dǎo)致后續(xù)移碼突變，475-477位堿基編碼為taa終止密碼，第二外顯子只翻譯出159個(gè)氨基酸，并且導(dǎo)致后續(xù)8個(gè)外顯子均無法翻譯為蛋白，rhd蛋白翻譯提前終止，造成rhd陰性血型。多次測(cè)序結(jié)果表明該突變位點(diǎn)并不是因?yàn)閿U(kuò)增或測(cè)序錯(cuò)誤引進(jìn)的。該突變?yōu)橐恍律蛔?。該突變不存在于下面的四個(gè)數(shù)據(jù)庫中：單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計(jì)劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，hapmap8數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics.org.cn/)，表明該突變非常罕見。而在200例rhd陽性獻(xiàn)血員的外周血基因組dna樣本中進(jìn)行該位點(diǎn)的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。

通過上述的分析，證明rhd基因擴(kuò)增及測(cè)序引物可以準(zhǔn)確測(cè)定rhd基因，從而可以更加精準(zhǔn)的確定待測(cè)者的rhd血型，對(duì)于患者制定輸血政策具有重要意義。

實(shí)施例2：對(duì)snp突變先證者的父母進(jìn)行遺傳驗(yàn)證

1、提取外周血基因組dna：

在符合國家相關(guān)政策規(guī)定，并在取樣對(duì)象同意的基礎(chǔ)上，抽取rhd陰性或變異型獻(xiàn)血員外周靜脈血2-5ml，放入edta抗凝管內(nèi)，-80℃凍存?zhèn)溆茫粌龃娴膃dta抗凝血在室溫融化后，取500μl放于離心管，加入等體積te(ph8.0)，混勻，4℃，10000rpm離心10分鐘，棄上清。

加入180μlte、20μlsds(10％)、8μl蛋白酶k(l0mg/ml)混勻，置于37℃水浴過夜。從水浴中取出樣品，瞬時(shí)離心沉淀樣本。在反應(yīng)管中加入等體積的tris-飽和酚(約300μl)，充分混勻，室溫下10000rpm離心10分鐘，吸取上清液(約300μl)至一新離心管中。重復(fù)酚抽提一次，吸取上清液至一新離心管中。

加入等體積的tris飽和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入等體積的tris飽和酚:氯仿:異戊醇混合液(酚、氯仿、異戊醇各100μl)，混勻，室溫10000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至一新離心管。

加入l/10體積3mol/l、ph5.2醋酸鈉(約30μl)，2倍體積預(yù)冷100％乙醇，輕輕混合，可見白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心10分鐘，使dna沉淀于管底，棄上清。

向dna沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室溫7000rpm離心5分鐘，棄上清，置于室溫中揮發(fā)剩余乙醇，最后加入50μlte(ph8.0)，4℃過夜溶解dna。

對(duì)提取的dna行瓊脂糖膠電泳，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)在260nm和280nm比色，檢測(cè)dna純度及濃度。

2、直接測(cè)序法尋找該先證者父母rhd基因第二外顯子的突變

pcr擴(kuò)增目的片段：反應(yīng)條件與反應(yīng)體系：

(1)pcr反應(yīng)條件：95℃5m；95℃30s，58℃30s，72℃60s，35cycles；72℃5m。

(2)反應(yīng)體系：(onelambda公司faststarttaqpolymerase)

應(yīng)用該反應(yīng)體系分別進(jìn)行先證者父母的基因組dna模板與擴(kuò)增rhd基因第二外顯子的rhd-2f:5’-tccccctcgtccttctcg-3’seqidno:3和rhd-2r:5’-caggatgcccagttaatttgaat-3’seqidno:4引物的擴(kuò)增反應(yīng)。

pcr產(chǎn)物測(cè)序：采用常規(guī)sanger測(cè)序法、應(yīng)用rhd-2r:5’-caggatgcccagttaatttgaat-3’seqidno:4對(duì)上述pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(圖2)，先證者父親(a)為正常rhd陽性表型，攜帶rhd全缺失基因；先證者母親(b)為正常rhd陽性表型，攜帶突變基因，表現(xiàn)為rhd正?；蚺csnp突變基因雜合峰；先證者(c)遺傳父親rhd全缺失基因和母親snp突變基因，顧表現(xiàn)為rhd陰性表型。該突變不存在于下面的四個(gè)數(shù)據(jù)庫中：單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因組計(jì)劃(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，hapmap8數(shù)據(jù)庫(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黃數(shù)據(jù)庫(http://yh.genomics.org.cn/)，表明該突變非常罕見。而在200例rhd陽性獻(xiàn)血員的外周血基因組dna樣本中進(jìn)行該位點(diǎn)的突變篩查，未發(fā)現(xiàn)該突變。

上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該snp突變位點(diǎn)能夠精準(zhǔn)的確定待測(cè)者的rhd血型，對(duì)于患者制定輸血政策具有重要意義。

sequencelisting

<110>青島市中心血站（青島市公民義務(wù)獻(xiàn)血辦公室青島市輸血醫(yī)學(xué)研究所）

<120>一種用于檢測(cè)rhd陰性血型的引物組及其應(yīng)用

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