本發(fā)明涉及分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及利用寡核苷酸探針采用nd-fish方法檢測(cè)小麥背景中簇毛麥染色體以及小麥-簇毛麥易位染色體的方法。
背景技術(shù)：
：：高等生物染色體序列復(fù)雜多樣，在不同區(qū)間存在大量的重復(fù)序列，這為標(biāo)記與鑒定染色體提供了新的思路與方法。在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，可通過構(gòu)建重復(fù)序列探針對(duì)染色體進(jìn)行標(biāo)記，分析染色體上探針信號(hào)的分布狀態(tài)，從而區(qū)分基因組與染色體組。此外，通過比較染色體上探針信號(hào)的變化亦是分析染色體行為的普遍做法。簇毛麥?zhǔn)切←湹牡慕壏N屬，蘊(yùn)含著豐富的優(yōu)良基因，可用于小麥品種改良。創(chuàng)制小麥-簇毛麥易位染色體是利用簇毛麥優(yōu)良基因改良小麥品種的重要環(huán)節(jié)，比如小麥-簇毛麥6al/6vs易位染色體被成功用于小麥抗白粉病育種。在利用簇毛麥優(yōu)良基因改良小麥品種的過程中，準(zhǔn)確快速鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體是必須的，尤其是鑒定小麥-簇毛麥易位染色體，顯得尤為重要。目前用于鑒定小麥背景中簇毛麥染色體的方法主要包括分子標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)方法。但目前的分子標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)方法都存在缺點(diǎn)，還缺乏一種快速準(zhǔn)確的，從小麥背景中鑒定小麥-簇毛麥易位染色體的方法。用基于pcr的分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定。根據(jù)特定的dna序列，開發(fā)出了基于pcr的、簇毛麥特異的分子標(biāo)記(特異引物)。這些分子標(biāo)記(引物)可以檢測(cè)小麥背景中是否有簇毛麥染色體存在。盡管基于pcr的標(biāo)記可以檢測(cè)小麥背景中是否存在簇毛麥染色體，但該技術(shù)僅能證明小麥背景中簇毛麥染色體的存在，不能確定小麥和簇毛麥的染色體是否發(fā)生了易位。gish(genomeinsituhybridization,基因組原位雜交)：用經(jīng)標(biāo)記的動(dòng)植物總基因組dna作探針，與動(dòng)植物染色體進(jìn)行雜交，探明外源染色體的存在及存在方式。以簇毛麥基因組dna為探針，利用基因組原位雜交(gish)技術(shù)鑒定小麥背景中是否存在簇毛麥染色體。該技術(shù)可以確定小麥和簇毛麥的染色體是否發(fā)生了易位，也可以確定易位的片段有多大。但gish技術(shù)需要從簇毛麥中提取基因組dna，然后對(duì)基因組dna進(jìn)行標(biāo)記。探針標(biāo)記好后，在進(jìn)行原位雜交過程中，要對(duì)探針和染色體進(jìn)行變性，然后雜交過夜。該過程十分繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且探針標(biāo)記的成本也高。另外，gish技術(shù)因?yàn)橐哉麄€(gè)簇毛麥基因dna為探針，探針在每條簇毛麥染色體上產(chǎn)生的雜交信號(hào)模式是相同的，因此不能區(qū)分具體是那一條簇毛麥染色體。c-帶技術(shù)(c-banding):植物染色體經(jīng)一定條件處理后，用giemsa染料進(jìn)行染色，在不同染色體上顯示出染色深淺不一的帶紋，不同染色體顯示出的帶紋模式不同，達(dá)到識(shí)別染色體的目的。c-帶技術(shù)也可以用來(lái)鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體。通過c-帶技術(shù)，可以顯示出簇毛麥與小麥不同的帶型，從而將簇毛麥染色體和小麥染色體區(qū)分開。但該技術(shù)存在以下不足：(1)c-帶技術(shù)流程長(zhǎng)，過程繁雜。(2)在使用c-帶技術(shù)過程中，小麥染色體也有較豐富的帶紋，使得小麥背景中識(shí)別簇毛麥染色體存在一定困難，達(dá)不到一目了然的效果。fish(fluorescenceinsituhybridization,熒光原位雜交)：用經(jīng)標(biāo)記的dna序列作探針，與動(dòng)植物染色體進(jìn)行雜交，明確探針序列在染色體上的分布，建立染色體特定界標(biāo)，從而達(dá)到識(shí)別染色體、了解染色體的結(jié)構(gòu)功能和基因組進(jìn)化的目的。利用常規(guī)fish技術(shù)鑒定小背景中的簇毛麥染色體。克隆簇毛麥特異的重復(fù)序列，以這樣的重復(fù)序列為探針，用常規(guī)fish技術(shù)鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體。這種方法也能很好地從小麥背景中將簇毛麥染色體識(shí)別出來(lái)，其效果類似gish技術(shù)。但常規(guī)fish技術(shù)所需探針的制備過程也非常繁瑣。首先需要獲得大量的特異重復(fù)序列，這涉及克隆、轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌、質(zhì)粒提取等繁雜過程。另外，與gish技術(shù)一樣，獲得的重復(fù)序列還需要標(biāo)記，要購(gòu)買標(biāo)記試劑盒，成本高。探針與染色體雜交之前，探針和染色體也都需要變性。因此常規(guī)fish技術(shù)過程復(fù)雜，成本高。nd-fish(non-denaturingfluorescenceinsituhybridization,非變性熒光原位雜交)：通常以合成的單鏈寡核苷酸為探針，與非變性的染色體進(jìn)行原位雜交，能夠低成本、快速、方便地明確探針序列在染色體上的分布，建立染色體特定界標(biāo)，從而達(dá)到識(shí)別染色體、了解染色體的結(jié)構(gòu)功能和基因組進(jìn)化的目的。利用nd-fish技術(shù)鑒定簇毛麥染色體。合成簇毛麥染色體特異的寡核苷酸探針，采用nd-fish技術(shù)鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體。該方法與常規(guī)fish技術(shù)相比，減少了探針制備的繁瑣過程，且寡核苷酸探針的合成成本較低。雜交過程中探針和染色體不需要變性?，F(xiàn)有的鑒定簇毛麥染色體的nd-fish技術(shù)中，所使用的寡核苷酸探針還不完善。目前所使用的寡核苷酸探針，其信號(hào)不能完全覆蓋整條簇毛麥染色體，因而只有在簇毛麥染色體保持完整的狀態(tài)下才能清楚地識(shí)別，如果與小麥染色體發(fā)生易位，而且參與易位的區(qū)段很有可能不帶有寡核苷酸探針信號(hào)(因?yàn)槟壳八褂玫墓押塑账崽结樞盘?hào)不能全覆蓋簇毛麥染色體)，這樣就不能將簇毛麥染色體識(shí)別出來(lái)。用寡核苷酸探針和nd-fish技術(shù)代替基因組gish技術(shù)鑒定小麥背景中的外源染色體。利用寡核苷酸探針oligo-1162、oligo-psc200和oligo-psc250以及nd-fish技術(shù)，可以代替以黑麥基因組dna為探針的gish技術(shù)鑒定小麥背景中的黑麥染色體。目前利用寡核苷酸探針oligo-1162、oligo-psc200和oligo-psc250以及nd-fish技術(shù)鑒定小麥背景中的黑麥染色體，只能起到gish技術(shù)的效果，即只能將小麥背景中的黑麥染色體與小麥染色體區(qū)分開，但不能識(shí)別具體是那一條黑麥染色體。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種能區(qū)分小麥與簇毛麥雜交后代中的簇毛麥染色體、能識(shí)別單個(gè)簇毛麥染色體、并能鑒定小麥-簇毛麥易位染色體的方法。本發(fā)明依據(jù)轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列在植物基因組中呈散步方式分布的特點(diǎn)，從分析轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列入手，尋找寡核苷酸探針。基于從簇毛麥基因組中分離克隆的轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列相對(duì)較少的情況，依據(jù)麥類作物各物種之間具有一定親緣關(guān)系的原理，考慮采用物種間序列轉(zhuǎn)移方法，開發(fā)合適的寡核苷酸探針。具體方法如下：(1)收集所有已報(bào)道的從黑麥基因組中分離克隆的轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列和已報(bào)道的黑麥特異寡核苷酸探針序列。(2)利用perl語(yǔ)言編程對(duì)收集的所有序列進(jìn)行比對(duì)，分析序列特點(diǎn)，找到保守性強(qiáng)、但與已報(bào)道的黑麥特異寡核苷酸探針相似度低于60％的區(qū)段，設(shè)計(jì)新寡核苷酸探針。(3)采用物種間序列轉(zhuǎn)移方法，以小麥-簇毛麥雜交后代植株為材料，用nd-fish方法驗(yàn)證開發(fā)的寡核苷酸探針是否能鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體。分析已報(bào)到的少數(shù)簇毛麥特異的重復(fù)序列堿基的特點(diǎn)，以及微衛(wèi)星序列在植物染色體上的分布特點(diǎn)，以二核苷酸gt為重復(fù)單位，設(shè)計(jì)不同重復(fù)次數(shù)的寡核苷酸探針。具體設(shè)計(jì)方法是，以7為最小重復(fù)單位，按7的2倍、3倍和4倍重復(fù)次數(shù)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的gt寡核苷酸探針，最長(zhǎng)不超過60個(gè)堿基。設(shè)計(jì)的探針為(gt)7、(gt)14、(gt)21、(gt)28。然后用nd-fish方法進(jìn)行驗(yàn)證，找出只與簇毛麥染色體雜交而不與小麥染色體雜交的探針。獲得了能起作用的寡核苷酸序列。oligo-ku:gatcgagacttctagcaataggcaaaaatagtaatggtatccgggttcg(seqidno.1)(gt)7:gtgtgtgtgtgtgt(seqidno.2)將兩種探針混合，用nd-fish的方法鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體。本發(fā)明提供了用于區(qū)分小麥-簇毛麥遠(yuǎn)緣雜交后代中的小麥染色體和簇毛麥染色體的寡核苷酸探針，其核苷酸序列如seqidno.1所示。寡核苷酸探針oligo-ku能用于nd-fish，分析小麥-簇毛麥遠(yuǎn)緣雜交后代植株染色體，只在簇毛麥染色體上全覆蓋式產(chǎn)生雜交信號(hào)，不在小麥染色體上產(chǎn)生雜交信號(hào)，能代替以簇毛麥基因組為探針的gish技術(shù)，明確地區(qū)分小麥-簇毛麥遠(yuǎn)緣雜交后代植株中的小麥染色體和簇毛麥染色體。本發(fā)明提供了用于鑒別簇毛麥各染色體的寡核苷酸探針，其核苷酸序列如seqidno.2所示。寡核苷酸探針(gt)7也只在簇毛麥染色體上產(chǎn)生雜交信號(hào)，而不在小麥染色體上產(chǎn)生雜交信號(hào)。(gt)7的信號(hào)模式與oligo-ku的不同，oligo-ku的信號(hào)是簇毛麥染色體全覆蓋式的，(gt)7在簇毛麥各染色體特定位置產(chǎn)生雜交信號(hào)，能將簇毛麥各條染色體區(qū)分開。本發(fā)明提供了一種寡核苷酸探針組合，含有2條寡核苷酸探針，其核苷酸序列分別如seqidno.1-2所示。本發(fā)明提供了上述寡核苷酸探針組合在鑒定小麥背景中是否存在簇毛麥染色體的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述寡核苷酸探針組合在檢測(cè)小麥和簇毛麥易位染色體中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述寡核苷酸探針或權(quán)利要求3所述的寡核苷酸探針組合在區(qū)分簇毛麥各條染色體中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了上述寡核苷酸探針在小麥種質(zhì)資源改良或育種中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種檢測(cè)小麥背景中簇毛麥染色體的方法，利用本發(fā)明的寡核苷酸探針組合(含有核苷酸序列分別如seqidno.1-2所示的寡核苷酸探針)對(duì)待測(cè)小麥材料進(jìn)行nd-fish方法檢測(cè)。本發(fā)明提供一種檢測(cè)小麥和簇毛麥易位染色體的方法，利用本發(fā)明的寡核苷酸探針組合(含有核苷酸序列分別如seqidno.1-2所示的寡核苷酸探針)對(duì)待測(cè)小麥材料進(jìn)行nd-fish方法檢測(cè)。含有seqidno.1或2所示寡核苷酸探針的檢測(cè)試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有seqidno.1-2所示的寡核苷酸探針組合的檢測(cè)試劑盒屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明基于nd-fish的原理，開發(fā)新型寡核苷酸探針。其目的是尋找到合適的寡核苷酸探針，結(jié)合nd-fish技術(shù)，鑒定小麥-簇毛麥雜交后代中的簇毛麥染色體，能清楚地區(qū)分小麥染色體和簇毛麥染色體的同時(shí)，準(zhǔn)確識(shí)別7條簇毛麥染色體，從而建立一種新快速準(zhǔn)確鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體的方法。本發(fā)明方法具有以下特點(diǎn)：(1)oligo-ku和(gt)7相結(jié)合，能夠檢測(cè)小麥和簇毛麥的易位染色體，克服分子標(biāo)記不能確定小麥和簇毛麥的染色體是否發(fā)生了易位的缺點(diǎn)。現(xiàn)有技術(shù)一根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，然后用pcr和凝膠電泳的方法進(jìn)行檢測(cè)。這一方法只能證明小麥背景中有簇毛麥dna存在，但不清楚具體存在的方式。而本發(fā)明能明確檢測(cè)簇毛麥染色體在小麥背景中的存在方式，即，是否發(fā)生易位。(2)成本低，操作簡(jiǎn)便，能夠識(shí)別7條簇毛麥染色體，克服gish技術(shù)過程繁瑣、成本高和不能識(shí)別具體簇毛麥染色體的缺點(diǎn)；gish技術(shù)需要先提取簇毛麥基因dna，然后進(jìn)行標(biāo)記，再讓探針和染色體變性，最后雜交。而本發(fā)明不需要這些過程，只需合成短的探針序列，雜交時(shí)染色體和探針都不需要變性。本發(fā)明方法克服c-帶技術(shù)流程長(zhǎng)、過程繁雜、不能一目了然的缺點(diǎn)；c-帶技術(shù)在對(duì)染色體進(jìn)行染色之前，需要染色體前處理，過程繁雜，而且不能做到一目了然地區(qū)分小麥染色體和簇毛麥染色體。而本發(fā)明不需要復(fù)雜的染色體前處理，能夠一目了然地區(qū)分小麥染色體和簇毛麥染色體。常規(guī)fish技術(shù)需要獲得大量的用于探針標(biāo)記的序列，得到大量序列后再進(jìn)行探針標(biāo)記，雜交之前也需要對(duì)探針和染色體進(jìn)行變性。本發(fā)明不需要這些過程，只需合成短的探針序列，雜交時(shí)染色體和探針都不需要變性。克服常規(guī)fish技術(shù)探針制備繁瑣、成本高的缺點(diǎn)；(3)本發(fā)明所用方法不僅能全覆蓋式在簇毛麥染色體上產(chǎn)生信號(hào)，還能同時(shí)區(qū)分各條簇毛麥染色體?？朔F(xiàn)有nd-fish技術(shù)中，寡核苷酸探針信號(hào)不能完全覆蓋整條簇毛麥染色體的缺點(diǎn)；gish技術(shù)雖然能全覆蓋式在簇毛麥染色體上產(chǎn)生雜交信號(hào)，但體現(xiàn)不出各條簇毛麥染色體的特點(diǎn)，不能區(qū)分各條簇毛麥染色體。(4)能清楚地區(qū)分小麥染色體和簇毛麥染色體的同時(shí)，準(zhǔn)確識(shí)別7條簇毛麥染色體，克服現(xiàn)有的技術(shù)中利用寡核苷酸探針和nd-fish技術(shù)代替基因組gish技術(shù)鑒定小麥背景中的外源染色體的方法中，不能同時(shí)區(qū)分各條外源染色體的缺點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖1為用nd-fish方法分析小麥-簇毛麥雙二倍體的根尖染色體的效果圖，以寡合苷酸序列探針oligo-ku(紅色)和(gt)7(綠色)為探針，oligo-ku(紅色)和(gt)7(綠色)能將簇毛麥染色體與小麥染色體分辨出來(lái)，同時(shí)也將各條簇毛麥染色體識(shí)別出來(lái)。圖2為以oligo-ku(紅色)和(gt)7(綠色)為探針，用nd-fish方法分析小麥-簇毛麥6vs.6al易位系小麥品種綿麥37的根尖染色體，oligo-ku(紅色)和(gt)7能將簇毛麥6vs染色體臂與小麥染色體分辨出來(lái)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所使用的驗(yàn)證探針的小麥材料包括小麥-簇毛麥雙二倍體和小麥-簇毛麥6vs.6al易位系小麥品種綿麥37。小麥-簇毛麥雙二倍體由電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的楊足君教授提供，該材料已經(jīng)通過論文報(bào)道(lietal.2016)。小麥品種綿麥37是四川省綿陽(yáng)農(nóng)科院培育的優(yōu)良品種，已經(jīng)通過四川省審定，已是公眾可以獲得的材料。本發(fā)明所使用生化試劑均為市售。實(shí)施例1小麥-簇毛麥重復(fù)序列分析及寡核苷酸探針序列的確定依據(jù)轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列在植物基因組中呈散步方式分布的特點(diǎn)，從分析轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列入手，尋找寡核苷酸探針。基于從簇毛麥基因組中分離克隆的轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列相對(duì)較少的情況，依據(jù)麥類作物各物種之間具有一定親緣關(guān)系的原理，考慮采用物種間序列轉(zhuǎn)移方法，開發(fā)合適的寡核苷酸探針。1、寡核苷酸探針核苷酸序列的確定與探針設(shè)計(jì)(1)收集所有已報(bào)道的從黑麥基因組中分離克隆的轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列和已報(bào)道的黑麥特異寡核苷酸探針序列。從ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中，下載所有已公布的、從黑麥基因組中分離的轉(zhuǎn)座類重復(fù)序列，這些序列的genbank號(hào)為:ab304276.1、ab124640.1、ab646252.1、ab124641.1、ab124639.1、ab124642.1、ab124643.1、gu226015–gu226029、gu318156–gu318170、gu318066–gu318080、gu317976–gu317990、gu226000–gu226014、gu318141–gu318155等。另外還包括申請(qǐng)人已經(jīng)報(bào)道的寡核苷酸探針oligo-1162、oligo-psc200和oligo-psc250序列(fuetal.2015)。(2)利用perl語(yǔ)言編程對(duì)收集的所有序列進(jìn)行比對(duì)，分析序列特點(diǎn)，找到保守性強(qiáng)、但與已報(bào)道的黑麥特異寡核苷酸探針相似度低于60％的區(qū)段，設(shè)計(jì)新寡核苷酸探針。通過編程，對(duì)獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)以gu編號(hào)的序列在600-683bp處具有較高保守性。因此，從中選取序列g(shù)u318080.1，以此序列設(shè)計(jì)探針。設(shè)計(jì)探針前，將其與oligo-1162、oligo-psc200和oligo-psc250序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)這3條寡核苷酸序列與gu318080.1的600-683bp處的相似度低于60％。再截取gu318080.1的600-683bp區(qū)段的序列，與編號(hào)為ab的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)gu318080.1的633-681bp區(qū)段與這些序列達(dá)95％以上相似。因此，以gu318080.1的633-681bp區(qū)段設(shè)計(jì)出探針oligo-ku。(3)采用物種間序列轉(zhuǎn)移方法，以小麥-簇毛麥雜交后代植株為材料，用nd-fish方法驗(yàn)證開發(fā)的寡核苷酸探針是否能鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體。該步驟在于將黑麥來(lái)源的序列應(yīng)用于簇毛麥。分析已報(bào)到的少數(shù)簇毛麥特異的重復(fù)序列堿基的特點(diǎn)，以及微衛(wèi)星序列在植物染色體上的分布特點(diǎn)，以二核苷酸gt為重復(fù)單位，設(shè)計(jì)不同重復(fù)次數(shù)的寡核苷酸探針。具體設(shè)計(jì)方法是，以7為最小重復(fù)單位，按7的2倍、3倍和4倍重復(fù)次數(shù)設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的gt寡核苷酸探針，最長(zhǎng)不超過60個(gè)堿基。設(shè)計(jì)的探針為(gt)7、(gt)14、(gt)21、(gt)28，其核苷酸序列分別如seqidno.2-5所示。然后用nd-fish方法進(jìn)行驗(yàn)證，找出只與簇毛麥染色體雜交而不與小麥染色體雜交的探針。獲得了能起作用的寡核苷酸序列。oligo-ku:gatcgagacttctagcaataggcaaaaatagtaatggtatccgggttcg(seqidno.1)(gt)7:gtgtgtgtgtgtgt(seqidno.2)實(shí)施例2小麥背景中簇毛麥染色體鑒定方法的建立將實(shí)施例1確定的兩種寡核苷酸探針(oligo-ku和(gt)7)混合，用nd-fish的方法鑒定小麥背景中的簇毛麥染色體。小麥-簇毛麥雙二倍體和小麥品種綿麥37的根尖中期染色體制備參照(hanetal.2006)所描述的方法，nd-fish分析過程參照(fuetal.2015)描述的方法。具體如下：(1)根尖中期染色體制備將根尖用笑氣處理2小時(shí)，用95％醋酸固定10分鐘，然后用雙蒸水洗掉醋酸，切下根尖分生組織區(qū)，置于2％纖維素酶和1％果膠酶混合液中，37℃水浴處理50分鐘，用70％酒精將酶清洗干凈，在70％酒精中搗碎根尖，離心去掉酒精，加醋酸制成根尖細(xì)胞懸液，取懸液滴在干凈的載玻片上(每張載玻片8-10ul懸液)，待醋酸揮發(fā)完后鏡檢片子，選分裂相好的片子進(jìn)行nd-fish實(shí)驗(yàn)。(2)nd-fish實(shí)驗(yàn)將合成的寡核苷酸探針oligo-ku、(gt)7、(gt)14、(gt)21和(gt)28用ph7.0的1×te稀釋到工作夜?jié)舛?，oligo-ku的工作液濃度為26.4ng/ul，(gt)7、(gt)14、(gt)21和(gt)28的工作液濃度為29.1ng/ul，然后從(gt)7、(gt)14、(gt)21和(gt)28的工作液中各取0.4ul，分別與0.4ul的oligo-ku工作液混合到10ul雜交緩沖液中(雜交緩沖液由1mm/ltris-hcl,0.1mm/ledta,17.5g/lnacl,8.8g/l檸檬酸三鈉組成)，配置成雜交液。配制好的雜交液和中期細(xì)胞染色體都不經(jīng)任何變性處理，在室溫25-28℃條件下，直接取9ul配制好的雜交液，滴到有中期細(xì)胞染色體的載玻片上，蓋上蓋玻片，放置于濕潤(rùn)的普通飯盒中，于42℃放置1個(gè)小時(shí)，用42℃預(yù)熱的2×ssc緩沖液進(jìn)行洗脫，并使用洗耳球?qū)⑵哟蹈桑繌埰蛹雍琩api的抗褪色劑10ul，蓋上蓋玻片，2分鐘后在olympusbx51熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察照相，檢測(cè)探針的雜交效果，結(jié)果表明oligo-ku和(gt)7只與簇毛麥染色體雜交，不與小麥染色體雜交。而(gt)14、(gt)21和(gt)28不具簇毛麥特異性。從圖1中可以看出，簇毛麥的14條染色體帶有明顯的探針oligo-ku的紅色信號(hào)，而且oligo-ku的紅色信號(hào)是簇毛麥染色體全覆蓋式的，具有以簇毛麥基因組dna為探針的gish的效果，能清楚地將簇毛麥染色體與小麥染色體分開。(gt)7的綠色信號(hào)也只在簇毛麥染色體上體現(xiàn)，與oligo-ku的紅色信號(hào)不同的是，(gt)7的綠色信號(hào)在簇毛麥染色體的特定區(qū)域分布，這就形成了簇毛麥各染色體特有的(gt)7的信號(hào)模式，從而將各條簇毛麥染色體區(qū)分開。亦即：短小的1v染色體的一條臂的端部帶有較強(qiáng)的信號(hào)，另一條臂端部帶較弱但明顯的信號(hào)；2v染色體只有著絲粒區(qū)域有一弱信號(hào)；3v染色體的兩條臂的端部都帶有極強(qiáng)的信號(hào)，著絲粒區(qū)域帶有較弱但明顯的信號(hào)；4v染色體的1條臂端部帶有極強(qiáng)的信號(hào)，著絲粒區(qū)域和另一條臂的亞端部帶有較強(qiáng)的信號(hào)；5v染色體在著絲粒區(qū)域和一條臂的亞端部帶有較強(qiáng)的信號(hào)，在另一條臂的端部帶有較弱但明顯的信號(hào)；6v染色體在一條臂的端部帶有極強(qiáng)的信號(hào)，在著絲粒區(qū)域帶有很弱的信號(hào)；7v染色體在一條臂的端部帶有較強(qiáng)的信號(hào)，在著絲粒區(qū)域帶有弱而明顯的信號(hào)，在另一條臂上不具信號(hào)。從圖2中可以看出，oligo-ku和(gt)7能鑒定出小麥品種綿麥37中的簇毛麥-小麥易位染色體6vs.6al。同樣，oligo-ku和(gt)7只與簇毛麥染色體雜交，而不與小麥染色體雜交。oligo-ku的紅色信號(hào)覆蓋了整個(gè)6v染色體臂，而(gt)7也在這條6v染色體臂的端部產(chǎn)生極強(qiáng)的綠色信號(hào)。本申請(qǐng)所提及的參考文獻(xiàn)：1、ligr,gaod,zhanghg,lijb,wanghj,lajw,majw,yangzj.molecularcytogeneticcharacterizationofdasypyrumbreviaristatumchromosomesinwheatbackgroundrevealingthegenomicdivergencebetweendasypyrumspecies.mol.cytogenet.2016,9:6.2、fusl,chenl,wangyy,lim,yangzj,qiul,yanbj,renzl,tangzx.oligonucleotideprobefornd-fishanalysistoidentifyryeandwheatchromosomes.scientificreports,2015,5:10552.3、hanfp,lambjc,birchlerja.highfrequencyofcentromereinactivationresultinginstabledicentricchromosomesofmaize.pronatlacadsciusa.2006,103:3238-3243.雖然，上文已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之做出一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。sequencelisting<110>四川農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種快速鑒定小麥背景中簇毛麥染色體的方法<130>khp171111839.2<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>49<212>dna<213>人工序列<400>1gatcgagacttctagcaataggcaaaaatagtaatggtatccgggttcg49<210>2<211>14<212>dna<213>人工序列<400>2gtgtgtgtgtgtgt14<210>3<211>28<212>dna<213>人工序列<400>3gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt28<210>4<211>42<212>dna<213>人工序列<400>4gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt42<210>5<211>56<212>dna<213>人工序列<400>5gtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgt56當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12