本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于子宮內(nèi)膜異位癥診斷的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,ems)，簡稱內(nèi)異癥，是一種常見的婦科疾病。該病在育齡婦女中的發(fā)病率約為10％，而在不育婦女中發(fā)病率則高達30-60％。其基本特征是在子宮被覆內(nèi)膜及子宮肌層之外的其它部位出現(xiàn)具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))，臨床上主要表現(xiàn)為慢性盆腔疼痛，性交痛和不孕¹。子宮內(nèi)膜異位雖然是一種良性婦科疾病，但具有增生，浸潤，轉(zhuǎn)移等惡性行為，惡變率為0.7-1％。異位內(nèi)膜組織主要位于盆腔(如宮骶韌帶、子宮直腸凹陷),其中卵巢是最常見的侵犯部位。

子宮內(nèi)膜異位癥目前存在有效的治療方案，但缺乏簡便高效的診斷方法。腹腔鏡是子宮內(nèi)膜異位癥診斷的金標準，而目前我國婦科醫(yī)學(xué)界尚未有統(tǒng)一、規(guī)范性的腹腔鏡診治標準出臺。一般來說，鏡下觀察到典型的子宮內(nèi)膜異位癥病灶時，即可確診。但研究表明，不同內(nèi)異癥成分參差不齊，形態(tài)多種多樣，進展程度各不相同，同時也有其他病變導(dǎo)致的類似腹膜改變被誤診。據(jù)統(tǒng)計，腹腔鏡檢測的異位病灶僅半數(shù)得到病理學(xué)證實。同時因為是微創(chuàng)手術(shù)，臨床醫(yī)師和患者需要面對麻醉，手術(shù)，并發(fā)癥以及費用等一系列問題。循環(huán)系統(tǒng)生物標志物的檢測有創(chuàng)傷小，經(jīng)濟，簡便快速等優(yōu)勢，是未來子宮內(nèi)膜異位檢測的一個發(fā)展方向。尋找高靈敏度，高特異性的子宮內(nèi)膜異位癥生物標志物，可以準確診斷病情并加以治療，又可用于治療后的進一步病情監(jiān)控。這將有效改善目前子宮內(nèi)膜異位癥的診療現(xiàn)狀，提高治療效果，有著經(jīng)濟和社會雙重效益。

循環(huán)系統(tǒng)中mirna是一個豐富而有診斷潛力的生物標志物來源，也是目前子宮內(nèi)膜異位癥及其他疾病生物標記物研究的熱點。基于基因芯片技術(shù)，對子宮內(nèi)膜異位癥患者血清中765個mirna進行表達譜檢測。研究發(fā)現(xiàn)，mir-200家族能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲，其主要機制是通過對zeb蛋白的抑制作用，間接促進了該蛋白負調(diào)控的靶基因e-cadherin蛋白的表達^2,3。e-cadherin蛋白與β-catenin組成復(fù)合物，介導(dǎo)鈣依賴的胞間連接作用。這種胞間連接使上皮細胞間相互黏附，難以發(fā)生運動和遷移。上述研究表明mir-200家族與細胞的黏附作用過程密切相關(guān)。

目前臨床開始嘗試通過熒光定量pcr方法，測定外周血相關(guān)生物標志物，以早期檢測子宮內(nèi)膜異位癥。這種定量檢測的方法較其他方法有更高的敏感性和特異性。但目該方法檢測過程中使用的檢測試劑和擴增引物具有很大的隨意性，造成檢測效率和可靠性參差不齊。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題就是，提供一種從受試者血液中提取總rna，并檢測mirna-141和u6基因的方法。通過測定mirna-141和u6基因的ct值的差值，計算mirna-141評分，以達到早期診斷子宮內(nèi)膜異位癥，減少子宮內(nèi)膜異位癥腹腔鏡手術(shù)，提高診斷的準確率的目的。

首先，本發(fā)明提供了一種用于子宮內(nèi)膜異位癥診斷的試劑盒，包含：

1)收集外周血的edta-k2抗凝管；

2)預(yù)裝trizol的凍存管；

3)外周血中總rna提取試劑；

4)檢測mirna-141和u6基因表達的試劑；

5)血液中mirna-141評分的計算公式：mirna-141分數(shù)＝mirna-141ct值–u6ct值。

其中，步驟4)檢測mirna-141和u6基因表達的試劑中mirna-141和和u6基因的反轉(zhuǎn)錄引物和熒光定量pcr擴增引物，具體如下：

mirna-141反轉(zhuǎn)錄引物：如seqidno:1所示；

用于擴增mirna-141的pcr引物如下：

正向引物：如seqidno:2所示；

反向引物：如seqidno:3所示；

u6的反轉(zhuǎn)錄引物：如seqidno:5所示；

用于擴增u6的pcr引物如下：

正向引物：如seqidno:4所示；

反向引物：如seqidno:5所示。

進一步地，本發(fā)明提供了所述試劑盒的檢測方法，該方法包括步驟：血液采集、保存、總rna提取、mirna-141熒光定量pcr反應(yīng)和結(jié)果分析。使用所述方法對人類血液總rna進行特異性反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量pcr反應(yīng)，通過反應(yīng)ct值測定mirna-141和u6基因的表達水平。

優(yōu)選的，該方法具體包括如下步驟：

1)采集外周靜脈血于edta-k2抗凝管中；

2)分裝于凍存管中，加入trizol試劑；

3)用氯仿，異丙醇方法提取外周血總rna，經(jīng)乙醇洗滌，棄上清后干燥、溶解并測定濃度；

4)反轉(zhuǎn)錄所述的mirna-141和u6基因，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cdna；

5)熒光定量pcr反應(yīng)，測定mirna-141和u6的ct值，利用公式mirna-141分數(shù)＝mirna-141ct值–u6ct值，來判斷子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病情況。

更進一步地，本發(fā)明提供了一種檢測mirna-141和u6基因的特異性引物在子宮內(nèi)膜異位癥診斷制劑中的應(yīng)用，所述引物包括反轉(zhuǎn)錄引物和pcr引物，具體如下：

mirna-141反轉(zhuǎn)錄引物：5’-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtat

tcgcactggatacgaggtaga-3’如seqidno:1所示；

用于擴增mirna-141的核苷酸擴增引物如下：

正向引物：5’-gcgcggattgtgacagaccatt-3’，如seqidno:2所示；

反向引物：5’-tgcagggtccgaggtat-3’，如seqidno:3所示；

u6的反轉(zhuǎn)錄引物：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’，如seqidno:5所示；

用于擴增u6的pcr引物如下：

正向引物：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’，如seqidno:4所示；

反向引物：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’，如seqidno:5所示。

優(yōu)選的，所述診斷制劑包括基因水平的診斷制劑和蛋白水平的診斷制劑。

再進一步地，本發(fā)明提供了一種診斷子宮內(nèi)膜異位癥的生物標記物，所述生物標記物為mirna-141基因的部分序列：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaggtagaaatggtctgtcacaatggcgcg如seqidno:6所示。

優(yōu)選的，所述生物標記物在子宮內(nèi)膜異位癥檢測、預(yù)后或聯(lián)合診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明提供的試劑盒有較高的重復(fù)穩(wěn)定性，不需重復(fù)實驗。利用本發(fā)明提供的mirna-141和u6擴增核酸序列，構(gòu)建測定血液mirna評分的診斷試劑盒，可達到無創(chuàng)診斷子宮內(nèi)膜異位癥的目的，將大大減少腹腔鏡檢測給病人帶來的損傷，有利于子宮內(nèi)膜異位癥的早期治療。

具體實施方式

下文中將對本發(fā)明的實施例進行詳細說明。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。

實施例1：

一種人類血液中mirna-141基因檢測方法：

1.血液標本的采集和處理

首先通過抽取外周靜脈血2ml到含edta-k2抗凝管中，30min內(nèi)分裝200μl到預(yù)裝trizol的凍存管，混勻后-80度保存。

2.總rna提取

1)加入1mltrizol，充分裂解細胞。

2)加入氯仿200μl，劇烈震蕩15s，在室溫放置3min后，于4℃12000r/min離心15分鐘。

3)吸取上層水相至另一離心管中，加入1.5倍體積異丙醇混勻，室溫放置10min后，于4℃12000r/min離心10min。

4)棄去上清，加入600μl75％的乙醇，混勻。于4℃12000r/min離心5分鐘。

5)棄去上清，加入800μl無水乙醇，混勻。于4℃12000r/min離心5分鐘。

6)棄去上清，自然干燥，加入depc水完全溶解rna沉淀。取4μl稀釋50倍，紫外分光光度計測定a260、a280吸光值，rna樣品a260/a280應(yīng)在1.8–2.0之間。

7)計算rna含量，稀釋rna到0.5ug/μl，取2ug總rna逆轉(zhuǎn)錄，其余樣品－80℃保存。

3.逆轉(zhuǎn)錄(mrna至cdna)

(1)反應(yīng)體系(10μl)：

(2)共10μl體系，反應(yīng)參數(shù)：37℃15min，85℃5sec。所得cdna于-20℃保存。

4.實時定量pcr

反應(yīng)體系(20μl)：

mirna-141熒光定量pcr擴增引物如下：

正向引物：5’-gcgcggattgtgacagaccatt-3’(seqidno:2)

反向引物：5’-tgcagggtccgaggtat-3’(seqidno:3)

u6基因熒光定量pcr擴增引物如下：

正向引物：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’(seqidno:4)

反向引物：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’(seqidno:5)

按檢測人份數(shù)配置各個樣品mirna-141的檢測體系pcr反應(yīng)液各xμl，每人份18μl分裝：

x＝18μl反應(yīng)液x(n份標本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)

n為檢測標本數(shù)。

將4μl步驟(3)中獲得的cdna加入到檢測體系pcr反應(yīng)液中；對陽性對照實驗而言，直接加4μl陽性對照品；對陰性對照實驗而言，直接加4μl陰性對照品；對空白對照實驗而言，加4μl生理鹽水。

mirna-141和u6擴增反應(yīng)條件：每個基因擴增3個反應(yīng)；95℃預(yù)變性30秒，pcr循環(huán)：95℃預(yù)變性5秒，60℃31秒，共40個循環(huán)，檢測熒光信號；4℃保存。

判斷結(jié)果：

反應(yīng)結(jié)束后計算機顯示樣品擴增曲線，根據(jù)每個基因3個反應(yīng)的ct值計算每個樣品的mirna-141和u6基因擴增平均ct值，然后根據(jù)公式計算mirna-141分數(shù)＝mirna-141ct值–u6ct值。

本方法診斷子宮內(nèi)膜異位癥的閾值為8.3，當mirna-141評分高于或等于8.3時，結(jié)果判斷為陽性，患者為子宮內(nèi)膜異位癥患者；當mirna-141評分低于8.3時，結(jié)果判斷為陰性，不支持患者為子宮內(nèi)膜異位癥患者。

另外，將mirna-141熒光定量pcr引物擴增產(chǎn)物，送去測序，其序列如如seqidno:6所示。

實施例2：

用于子宮內(nèi)膜異位癥診斷的試劑盒，包含：

(1)收集保存外周血試劑盒，包括：edta抗凝管、凍存管、trizol試劑；

(2)血液中總rna提取試劑盒，包括：氯仿、異丙醇、75％的乙醇、無水乙醇、depc水；

(3)檢測mirna-141和u6基因表達的試劑盒，包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、熒光pcr反應(yīng)液。其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括10×逆轉(zhuǎn)錄buffer、逆轉(zhuǎn)錄酶、dntp、如seqidno:1,5所示的引物和depc水；熒光pcr反應(yīng)液包括premixextaqtmii(2×)、如seqidno:2-5所示的引物和depc水；

(4)樣品中血mirna-141分數(shù)的計算公式：mirna-141分數(shù)＝mirna-141ct值–u6ct值。

當mirna-141評分高于或等于8.3時，結(jié)果判斷為陽性，患者為子宮內(nèi)膜異位癥患者；當mirna-141評分低于8.3時，結(jié)果判斷為陰性，不支持患者為子宮內(nèi)膜異位癥患者。

實施例3：

利用實施例2的試劑盒檢測臨床樣本：

取送檢婦科女性患者外周血樣本，總計65例子宮內(nèi)膜異位癥患者，年齡22-49歲，平均為33.7歲；以18例無子宮內(nèi)膜異位癥的輸卵管堵塞的患者作正常對照，年齡30-43歲，平均36.3歲。

按實施例1所述方法提取血液總rna，并用熒光pcr方法檢測血mirna-141評分。每份樣品重復(fù)3次，并同時做陽性，陰性，空白對照。根據(jù)評分結(jié)果進行判斷。

子宮內(nèi)膜異位癥組mirna-141評分為10.5±0.93、正常對照組為4.89±1.25。mirna-141評分在2組之間有顯著性差異，p＜0.01。

本試劑盒以mirna-141評分8.3作為診斷子宮內(nèi)膜異位癥的臨界值，65例子宮內(nèi)膜異位癥患者有56例陽性，9例陰性；18例非子宮內(nèi)膜異位癥患者有3例陽性，15例陰性。本試劑盒敏感性和特異性分別為86.1％和83.3％，本結(jié)果證明本試劑盒所檢測mirna-141評分可作為子宮內(nèi)膜異位癥的早期篩查指標。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

【參考文獻】

1.giudice,l.c.&kao,l.c.endometriosis.lancet364,1789-99(2004).

2.park,s.m.,gaur,a.b.,lengyel,e.&peter,m.e.themir-200familydeterminestheepithelialphenotypeofcancercellsbytargetingthee-cadherinrepressorszeb1andzeb2.genesdev22,894-907(2008).

3.korpal,m.,lee,e.s.,hu,g.&kang,y.themir-200familyinhibitsepithelial-mesenchymaltransitionandcancercellmigrationbydirecttargetingofe-cadherintranscriptionalrepressorszeb1andzeb2.jbiolchem283,14910-4(2008).

序列表

<110>上海潤達榕嘉生物科技有限公司

<120>一種用于子宮內(nèi)膜異位癥診斷的試劑盒及其檢測方法

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>49

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaggtaga49

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcgcggattgtgacagaccatt22

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgcagggtccgaggtat17

<210>4

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctcgcttcggcagcaca17

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

aacgcttcacgaatttgcgt20

<210>6

<211>71

<212>dna

<213>mirna-141

<400>6

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgaggtagaaatggtctgtc60

acaatggcgcg71