本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因，還涉及該基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：影響豬毛色性狀的色素主要是黑色素，黑色素可分為真黑色素和褐黑色素兩種。真/褐黑色素在不同品種豬被毛中的含量和分布造就了不同的毛色類型。黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin1Receptor,MC1R)基因在控制動物黑色素合成的過程中發(fā)揮著重要作用，并被證實為控制動物毛色的主效基因。KijasJM等(KijasJM,MollerM,PlastowG,etal.AframeshiftmutationinMC1Randahighfrequencyofsomaticreversionscauseblackspottinginpigs.[J].Genetics,2001,158(2):779-85.)發(fā)現(xiàn)在塔姆沃思和赫里福德(TamworthandHereford)豬種的MC1R編碼區(qū)第67-68位點處有CC插入的突變，這種移碼突變可能引起的隱性紅毛色。頓桂玲等(頓桂玲,李祥龍,曹洪戰(zhàn),等.3個豬品種黑素皮質(zhì)素受體1(MC1R)基因變異研究[J].JournalofGeneticsandGenomics,2007,34(9):777-782.)研究發(fā)現(xiàn)所有長白、大白豬個體在894位點均存在CC插入，并推測該突變可能與長白、大白豬白毛色存在相關(guān)性，但未經(jīng)過群體驗證。而師科榮等(師科榮,王愛國,李寧,等.中國地方豬種黑素皮質(zhì)激素受體1基因(MC1R)的單核苷酸多態(tài)性[J].中國科學(xué),2004,34(2):144-149.)對中國地方豬種MC1R基因單核苷酸多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，民豬、金華豬、榮昌豬、五指山豬、梅山豬等11個中國地方豬種的MC1R基因存在3個突變G284A，T309C和T364C，未檢測出編碼區(qū)67-68bp處有CC插入的突變，且認為MC1R基因?qū)τ谥袊胤截i種之間毛色的差異沒有起到關(guān)鍵的影響作用。印崇等(印崇,高峰,李傲楠,等.豬毛色基因黑色素受體1的基因型分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2014,41(11):44-49.)通過對豬MC1R基因型分析發(fā)現(xiàn)，西藏小型豬在nt894insCC位點表現(xiàn)出其他基因型，而非CC插入突變基因型。迄今為止，豬MC1R基因突變的研究中，尚未發(fā)現(xiàn)能引起巴馬香豬白化的相關(guān)報道。而白化巴馬香豬具有如下多種用途：一、在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用：廣西巴馬小型豬作為國內(nèi)小型豬主要品種之一，具有遺傳性穩(wěn)定、多產(chǎn)、體重較小等特征，組織器官及生化指標與人類相似，已越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。醫(yī)用疾病動物模型中常用白毛色動物為理想模型，普通巴馬香豬毛色中間部分為白色，兩頭為黑色，對于實驗觀察存在不利之處。因此，體表全覆蓋白毛的白化巴馬香豬與普通巴馬香豬相比更具有作為醫(yī)用實驗動物模型的價值。二、作為寵物用豬:目前市面上國內(nèi)的寵物豬品種以香豬為主，其中主要為巴馬香豬。由于巴馬香豬是一個具有穩(wěn)定的遺傳基因、品質(zhì)優(yōu)良、珍貴稀有的地方小型豬種，且其體型矮小短圓，外形俊秀，聰明溫順，很受一些寵物愛好者的歡迎。目前，市面上的寵物用巴馬香豬毛色品系主要為兩頭烏，全白毛色的巴馬香豬寵物尚未出現(xiàn)，因此白化隱性巴馬香豬品系開發(fā)成寵物豬具有一定的市場。三、巴馬香豬毛色對遺傳育種中的作用：毛色可以作為一種遺傳標記，應(yīng)用于評判品種的純度、遺傳穩(wěn)定性、親緣關(guān)系及在配套系培育中確定親本的雜交組合類型。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因及其應(yīng)用，可引起巴馬香豬白化并呈隱性遺傳，能夠用于制備白化醫(yī)用動物模型、制備白化寵物用豬和遺傳育種用途的遺傳標記。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：一種引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因，MC1R基因的第894位之后新插入CC兩個堿基，該突變可引起巴馬香豬白化并呈現(xiàn)隱性遺傳。一種利用所述的引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因在制備醫(yī)用動物模型中的應(yīng)用。一種利用所述的引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因在制備白化寵物用豬的應(yīng)用。一種利用所述的引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因在制備一種遺傳標記，作為評判品種的純度、遺傳穩(wěn)定性、親緣關(guān)系及在遺傳育種配套系培育中確定親本的雜交組合類型中的應(yīng)用。一種檢測巴馬香豬隱性白化位點的基因型的方法，是以檢測巴馬香豬MC1R基因第894位脫氧核糖核酸是否有CC插入，即第889位脫氧核糖核酸為起始的六個連續(xù)C是否突變?yōu)榘藗€連續(xù)C，確定待測巴馬香豬的基因型是--/--、CC/--或者CC/CC，其中CC/CC基因型的巴馬香豬的毛色呈現(xiàn)全白，而--/--和CC/--基因型的巴馬香豬的毛色呈現(xiàn)兩頭烏黑中間白；所述--/--基因型的個體為巴馬香豬MC1R基因的自5’末端第894位脫氧核糖核酸無CC插入的純合體；所述CC/CC基因型的個體為巴馬香豬MC1R基因的自5’末端第894位脫氧核糖核酸有CC插入的純合體；所述CC/--基因型的個體則為兩個等位基因中僅有一個基因有CC插入的雜合體。確定待測巴馬香豬MC1R基因第894位脫氧核糖核苷酸后是否插入CC的方法可采用測序分析方法。測序分析包括PCR擴增和對PCR擴增產(chǎn)物進行測序；所述PCR擴增用的引物對設(shè)計：以巴馬香豬基因組DNA為模板進行PCR擴增的產(chǎn)物含有巴馬香豬MC1R基因的第889位至第896位脫氧核糖核苷酸；PCR擴增得到的DNA片段為序列1所示的核苷酸序列或序列2所示的核苷酸序列。測序方法中，設(shè)計引物如下：正向引物F：5’-GGAGAGGAGGCTGCTGG-3’反向引物R：5’-TGGACACCTCCAGGCACT-3’用上述引物對在巴馬香豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqUnicornPremix12.5μl，DNA(1/100)1.0μl，PrimerF2(10μM)0.5μl，PrimerR2(10μM)0.5μl，AddH2OTo25.0μl；PCR反應(yīng)程序：94℃4min；94℃20sec，57℃20sec，72℃20sec，20cycles；72℃3min；10℃。本發(fā)明的有益技術(shù)效果有：本發(fā)明的突變基因可引起巴馬香豬白化并呈現(xiàn)隱性遺傳，可用于選育白化巴馬香豬品系，與普通巴馬香豬品系兩頭黑、中間白相比，體表全覆蓋純白毛發(fā)的白化巴馬香豬品系更適宜作為醫(yī)用實驗動物模型。同時，巴馬香豬作為主要的寵物用豬，白化品系的培育可滿足部分寵物豬愛好者對全白毛色的偏愛。此外，全白毛色還可以作為一種遺傳標記，應(yīng)用于評判品種的純度、遺傳穩(wěn)定性、親緣關(guān)系及在配套系培育中確定親本的雜交組合類型。附圖說明圖1為正常巴馬香豬外觀；圖2為白化突變巴馬香豬外觀；圖3為基因型檢測測序峰圖；具體實施方式實施例1：白化巴馬香豬遺傳家系的建立以我國巴馬香豬為模式動物，在進行近交建系的過程中意外獲得了呈高度穩(wěn)定隱性遺傳的、白化巴馬香豬遺傳家系。具體過程如下：第一階段：以1頭F1建系公豬與野生型巴馬香豬進行交配獲得F2群體，選留F2母豬和F1公豬回交產(chǎn)生F3代；在F3代意外發(fā)現(xiàn)白化個體，為檢測其遺傳性，增加F2母豬和F1公豬回交以出生足夠數(shù)量的F3代，結(jié)果共出生F3代125頭，其中白化個體29頭，正常個體96頭；第二階段(進展中)：利用F3代白化巴馬香豬公豬與F3代白化巴馬香豬母豬交配產(chǎn)生F4代白化巴馬香豬，擴大白化巴馬香豬遺傳家系豬只數(shù)量。該家系目前共包括148頭個體，包括攜帶隱性遺傳基因的F1公豬1頭，攜帶隱性遺傳基因的F2母豬3頭，F(xiàn)3代豬125頭，及參與家系配種的野生型豬19頭。將所有的白化家系產(chǎn)生的F3代進行隱性遺傳卡方合適度檢驗，如表1所示。表1白化家系F3代產(chǎn)仔記錄正常白化總數(shù)觀察次數(shù)O9629125理論次數(shù)T93.7531.25125|O-T|-0.51.751.75(|O-T|-0.5)23.06253.0625(|O-T|-0.5)2/T0.03270.0981、假設(shè)H0：正常和白化的分離比符合理論比3：1，H1：不符合。2、顯著水平：α＝0.053、計算χ2值：由于自由度df＝k-1＝1，所以χ2需要連續(xù)矯正。χ2＝0.0327+0.098＝0.13074、推斷：從卡方分布表中查得χ20.05(1)＝3.841，實得χ2<χ20.05(1)，結(jié)論是接受H0，即正常與白化的分離比符合理論比3：1。同時，該性狀在不同性別間無差異分布。表明該家系白化性狀遺傳模式符合常染色體單基因隱性遺傳的孟德爾遺傳定律，故可確定該巴馬香豬家系是一個呈單基因隱性遺傳的遺傳性白化家系。目前，已經(jīng)建立了遺傳關(guān)系清楚、連續(xù)傳代2代共148頭個體，白化表型符合孟德爾隱性遺傳模式的遺傳大家系。實施例2：家系特征分析正常巴馬香豬外貌顏色特征主要表現(xiàn)為兩頭黑、中間白(如圖1所示)，部分個體背腰部稍帶黑斑，額頭有白線或倒三角型白斑，俗稱“兩頭烏”、“芭蕉豬”。突變巴馬香豬外貌顏色特征表現(xiàn)為全身覆蓋白毛色(如圖2所示)。實施例3：家系基因定位眾多文獻表明，黑素皮質(zhì)素受體1(Melanocortin1Receptor,MC1R)基因在控制動物黑色素合成的過程中發(fā)揮著重要作用，并被證實為控制動物毛色的主效基因。因此，本研究對此白化巴馬香豬遺傳家系的MC1R候選基因外顯子測序，共檢測家系內(nèi)58個體頭，其中29頭白化個體、25頭正常個體、4頭表型正常的攜帶隱性遺傳基因個體，測序發(fā)現(xiàn)：29頭白化個體MC1R基因第894堿基處插入了兩個CC，且為純合突變，命名為--/--基因型；4頭表型正常的攜帶隱性遺傳基因個體也發(fā)現(xiàn)MC1R基因第894堿基處插入兩個CC，但為雜合突變，命名為--/CC基因型；25頭正常個體MC1R基因未發(fā)現(xiàn)突變，命名為CC/CC基因型。具體的檢測巴馬香豬隱性白化位點基因型測序方法如下：設(shè)計引物如下：正向引物F：5’-GGAGAGGAGGCTGCTGG-3’反向引物R：5’-TGGACACCTCCAGGCACT-3’用上述引物對在巴馬香豬基因組DNA中進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqUnicornPremix12.5μl，DNA(1/100)1.0μl，PrimerF2(10μM)0.5μl，PrimerR2(10μM)0.5μl，AddH2OTo25.0μl。PCR反應(yīng)程序：94℃4min；94℃20sec，57℃20sec，72℃20sec，20cycles；72℃3min；10℃。PCR產(chǎn)物純化、測序所得--/--基因型序列和CC/CC基因型序列分別如序列表中序列1和序列2所示；--/--基因型序列、--/CC和CC/CC基因型突變位點的測序峰圖如圖3所示(圖中由上至下分別對應(yīng)突變體純合、突變體雜合、以及野生型純合)。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的/優(yōu)選的實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其還可以對這些已描述的實施例做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。序列表<110>深圳市金成實驗動物科技有限公司<120>引起白化的巴馬香豬MC1R突變基因及其應(yīng)用<130>16A100348JYC<160>2<210>1<211>110<212>DNA<213>人工序列<400>1ggagaggaggctgctggcttccctcagctccgcgcccccagccgccccccgcctcgggct60ggccgccaaccagaccaaccagacgggcccccagtgcctggaggtgtcca110<210>2<211>112<212>DNA<213>人工序列<400>2ggagaggaggctgctggcttccctcagctccgcgcccccagccgccccccccgcctcggg60ctggccgccaaccagaccaaccagacgggcccccagtgcctggaggtgtcca112當(dāng)前第1頁1 2 3