本發(fā)明涉及一種人體精子的檢測(cè)研究領(lǐng)域，特別涉及人體無(wú)精癥和嚴(yán)重少精癥檢測(cè)方法的研究及應(yīng)用該方法的試劑盒。

背景技術(shù)：

據(jù)統(tǒng)計(jì)，育齡夫婦一年內(nèi)不能懷孕者占25％以上，其中男方因素引起的不育約50％，然而，男性不育病因復(fù)雜，30％以上由遺傳缺陷導(dǎo)致生精障礙引起，其表現(xiàn)為無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥。男性生精障礙的病因正日益受到重視，但由于生精過(guò)程的復(fù)雜性，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)精子發(fā)生的病理生理認(rèn)識(shí)不足，導(dǎo)致這部分患者診療及預(yù)后判斷上的困難。

目前，臨床大部分無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者生精障礙的病因未明，給臨床治療帶來(lái)了極大的困惑，因此，有必要對(duì)不明原因生精障礙的機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)研究，篩選無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥特異性標(biāo)志物，研究相關(guān)檢測(cè)技術(shù)，為男性不育患者臨床快速準(zhǔn)確分型和個(gè)性化治療提供依據(jù)，減少無(wú)效或不必要的檢查與治療。

現(xiàn)有技術(shù)對(duì)無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥的臨床檢測(cè)方法主要有染色體核型分析和AZF微缺失檢測(cè)，但這兩項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、效率低且僅能解釋少數(shù)患者(5％-15％)生精障礙的原因。

因此，有必要對(duì)能快速檢測(cè)人體無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥的方法進(jìn)行研究及其提供一種應(yīng)用此方法的試劑盒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種研究能快速檢測(cè)人體無(wú)精子和嚴(yán)重少精子癥的方法。

本發(fā)明另一目的在于提供用于該方法的試劑盒。

本發(fā)明的目的及解決其技術(shù)問(wèn)題是采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提出的一種研究人體無(wú)精癥和嚴(yán)重少精癥快速測(cè)試的方法，其步驟包括：

a)提取相同等份嚴(yán)重少精癥/無(wú)精癥患者和正常男性的血液、精漿、尿液樣本，及提取所述相同等份嚴(yán)重少精癥/無(wú)精癥患者和正常男性睪丸中的睪丸組織和液氮，進(jìn)行保存；提取相同等份嚴(yán)重少精癥/無(wú)精癥患者和正常男性的血液、精漿、尿液樣本，及提取所述相同等份嚴(yán)重少精癥/無(wú)精癥患者和正常男性睪丸中的睪丸組織和液氮，進(jìn)行保存；

b)樣品處理，包括：精漿處理、尿液處理和睪丸組織處理，其中，

所述精漿處理是指首先將精液進(jìn)行離心處理、收集上清，提取精漿中總蛋白，再用蛋白組學(xué)方法獲取不同類型群體精漿的差異蛋白，最后用western blotting方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證；

所述尿液處理是指首先將收集到的尿液進(jìn)行離心處理，去除雜質(zhì)，再用代謝組學(xué)方法檢測(cè)不同類型群體尿液代謝產(chǎn)物差異；

所述睪丸組織處理是指采集的睪丸組織從RNA保護(hù)液中取出，再用提取RNAs，然后利用miRCURY LNA expression array方法進(jìn)行差異microRNA的鑒定。最后用real-time PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證差異microRNA的表達(dá)。

c)根據(jù)差異基因的表達(dá)，利用real-timePCR平臺(tái)診斷及利用所述精漿中差異蛋白或所述尿液中的差異代謝產(chǎn)物的結(jié)果進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

進(jìn)一步地，還包括有蛋白標(biāo)記，是指所述蛋白相對(duì)表達(dá)量用掃描積分光密度值表示，差異點(diǎn)標(biāo)記為兩組間量升高或者降低2倍者，且每個(gè)樣品均重復(fù)5次，選取凝膠上分析的差異蛋白點(diǎn)，同時(shí)選一空白膠作為對(duì)照，將切下的膠點(diǎn)放入具有微量水的離心管中，進(jìn)行HDMS鑒定。

更優(yōu)地，所述樣品的數(shù)量最好為300個(gè)。

本發(fā)明還提出了一種應(yīng)用上述方法得到的試劑盒，所述試劑盒包括所述睪丸組織處理后提取的RNAS或組織的代謝物。

本發(fā)明提供的研究人體無(wú)精癥和嚴(yán)重少精癥快速測(cè)試的方法，結(jié)合了microRNA技術(shù)，利用無(wú)精癥和嚴(yán)重少精癥特異性標(biāo)志物，如精漿、尿液等進(jìn)行檢測(cè)，相對(duì)現(xiàn)有臨床檢測(cè)方法(如染色體核型分析和AZF微缺失分析檢測(cè))而言，具有快速，效率高等特點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提出的是一種研究人體無(wú)精癥和嚴(yán)重少精癥快速測(cè)試的方法，步驟包括：1，樣本收集：提取相同等份嚴(yán)重少精癥/無(wú)精癥患者和正常男性的血液、精漿、尿液樣本，及提取所述相同等份嚴(yán)重少精癥/無(wú)精癥患者和正常男性睪丸中的睪丸組織和液氮，進(jìn)行保存，在本實(shí)施例中，睪丸組織的采集通過(guò)采用行睪丸穿針術(shù)來(lái)采集的；2，樣品進(jìn)行處理，包括：精漿處理、尿液處理、睪丸組織處理；其中精漿處理是指首先將精液進(jìn)行離心處理、收集上清、提取精漿的差異蛋白，最后用western blotting方法對(duì)差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，在一些實(shí)施例中，蛋白標(biāo)記是指，蛋白的相對(duì)表達(dá)量用掃描積分光密度值表示，差異點(diǎn)標(biāo)記為兩組間量升高或降低者，且每個(gè)樣品均重復(fù)5次，選取凝膠上分析的差異蛋白點(diǎn)，同時(shí)選一空白膠作為對(duì)照，將切下的膠點(diǎn)放入具有微量水的離心管中，進(jìn)行HDMS鑒定。尿液處理是指首先將收集到的尿液進(jìn)行離心處理，去除雜質(zhì)，再用代謝學(xué)方法檢測(cè)不同類型群體尿液代謝差異。睪丸組織處理是指采用的睪丸組織從RNA保護(hù)液中取出，再用提取RNAs，然后利用miRCURY LNA expression array方法進(jìn)行差異microRNA的鑒定，最后用real-time PCR方法進(jìn)一步驗(yàn)證差異microRNA的表達(dá)。3，根據(jù)差異基因的表達(dá)，利用real-time PCR平臺(tái)診斷及利用所述精漿中差異蛋白或所述尿液中的差異代謝產(chǎn)物的結(jié)果進(jìn)行ELISA檢測(cè)。本實(shí)施例中所說(shuō)的差異蛋白是利用蛋白組學(xué)方法尋找正常男性和不育男性也就是說(shuō)嚴(yán)重少精癥和無(wú)精癥患者的精漿中差異標(biāo)記的蛋白，同樣，差異代謝物也是說(shuō)利用代謝組學(xué)，篩選正常男性和不育男性的尿液中代謝產(chǎn)物的差異，而差異microRNA表達(dá)是通過(guò)芯片方法篩選正常男性和不育男性睪丸組織中的差異microRNA的表達(dá)，本實(shí)施例的芯片方法主要是指利用miRCURY LNA expression array方法進(jìn)行差異microRNA的鑒定。

在其他的實(shí)施例中可以用到其他相同功能的差異尋找方法或芯片方法來(lái)得到差異蛋白、差異代謝物及差異microRNA的表達(dá)。

最優(yōu)的實(shí)施方式中，樣品的數(shù)量選擇為嚴(yán)重少精癥、無(wú)精癥皇者和正常男性各300例，且檢測(cè)血尿常規(guī)、精液常規(guī)及血激素水平無(wú)異常，收集其樣品。

同時(shí)，本實(shí)施例還提供了一種應(yīng)用以上研究人體無(wú)精癥和嚴(yán)重少精癥快速檢測(cè)的方法的試劑盒，該試劑盒中具有以上方法提取的RNAs或者組織代謝物，其他實(shí)施方式中可以有從樣本中提取的其他特一定物質(zhì)。

通過(guò)本發(fā)明提供的這種研究方法，可以幫助人體無(wú)精癥和嚴(yán)重少精癥患者快速檢測(cè)及診斷。本發(fā)明提供應(yīng)用該方法的試劑盒同樣也能起到幫助患者快速檢測(cè)及診斷，及時(shí)查明病因。

綜上所述，盡管為說(shuō)明目的已經(jīng)公開了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，然而，本發(fā)明不只局限于如上所述的實(shí)施例，在不超出本發(fā)明基本技術(shù)思想的范疇內(nèi)，相關(guān)行業(yè)的技術(shù)人員可對(duì)其進(jìn)行多種變形及應(yīng)用。