本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用基因的單核苷酸多態(tài)性來判定奶牛泰勒蟲病感染率，并用于降低奶牛泰勒蟲病輔助選擇的分子標(biāo)記及其檢測方法。

背景技術(shù)：

牛瑟氏泰勒蟲(Theilefia sergenti)是經(jīng)過蜱傳播的寄生于紅細胞和淋巴細胞內(nèi)的血液原蟲^[1]。牛瑟氏泰勒蟲的子孢子(Sporozoite)隨蜱的唾液腺進入牛體內(nèi),在巨唾細胞和淋巴細胞內(nèi)進行裂殖生殖后,再進入紅細胞內(nèi)反復(fù)分裂后發(fā)育成血液型蟲體^[2]。雖然這個過程歷時非常短暫,但是在紅細胞內(nèi)的梨漿蟲階段可能是致病的。

泰勒蟲在牛體寄生階段，寄生于紅細胞內(nèi)時，會影響牛體相應(yīng)的血液型及免疫學(xué)指標(biāo)的變化，因此可通過監(jiān)測這些指標(biāo)的變化來初步鑒定該蟲體或者監(jiān)測患病?？祻?fù)狀態(tài)^[3-4]。據(jù)報道，感染環(huán)形泰勒蟲的奶牛與正常奶牛相比，各項生理生化指標(biāo)差異極顯著，表現(xiàn)為體溫升高，心率、呼吸次數(shù)、白細胞總數(shù)、血清膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶增加；血紅蛋白、紅細胞及其壓積隨染蟲率的上升不斷下降，血清總蛋白、白蛋白、膽固醇和甘油脂均明顯減少^[5-8]。臨床上常用紅細胞C3b受體花環(huán)率及紅細胞免疫復(fù)合物花環(huán)率，作為評價動物紅細胞免疫功能的主要指標(biāo)，以T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低來反映機體細胞免疫水平。李明禎等于2012年首次通過以上指標(biāo)的變化探討環(huán)形泰勒蟲對奶牛免疫水平的影響，結(jié)果顯示患病牛的紅細胞免疫功能及細胞免疫能力下降，說明環(huán)形泰勒蟲侵入機體后，可通過損傷免疫器官來引發(fā)免疫抑制，造成活化的T淋巴細胞數(shù)量減少，機體的細胞免疫紊亂，免疫水平低下，最終導(dǎo)致機體抵抗力下降^[9]。

牛泰勒蟲病具有明顯的地區(qū)性和季節(jié)性。外地牛、純種牛和改良雜種牛對該病的易感性明顯高于當(dāng)?shù)嘏?，即使紅細感染蟲率很低，亦出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，在不加任何治療時其發(fā)病率和致死率均可達90％以上。長期以來，瑟氏泰勒蟲免疫學(xué)診斷因抗原不足而技術(shù)的發(fā)展受到制約，因此許多學(xué)者力求尋找出一種方法適合瑟氏泰勒蟲體外培養(yǎng),以排除某些不利的因素。該病主要呈地方性流行，發(fā)病率高達36％～100％，死亡率高達17.8％～75.4％。該病危害嚴(yán)重，可引起犢牛和外地引進牛大量死亡，Tsuji等^[10]、Hagiwara等^[11]、張守發(fā)等^[12]先后應(yīng)用嚴(yán)重免疫缺陷(SCID)鼠成功建立瑟氏泰勒蟲動物模型，這些方法的建立對瑟氏泰勒蟲免疫學(xué)技術(shù)進一步發(fā)展。Takahashi等^[13]于1957年在日本牛紅細胞內(nèi)提取瑟氏泰勒蟲特異性蛋白,第一個在世界上建立了瑟氏泰勒蟲病IFA診斷技術(shù)。Matsuba等^[14]于1993年以含有P32基因的cDNA為探針，通過Southern雜交分析得出至少有三種基因不同的種群可以共存，并且處于優(yōu)勢種群的寄生蟲轉(zhuǎn)換可能發(fā)生在宿主持續(xù)感染期間,從而可能逃避宿主的免疫應(yīng)答。

雖然牛泰勒蟲的檢測技術(shù)國內(nèi)外取了一些進展，但生產(chǎn)中很少有人使用，也沒有對牛泰勒蟲抗性進行系統(tǒng)的選育。目前，我國奶牛群體泰勒蟲感染率仍維持較高水平，平均為25％左右^[15]。因此，急需一種能用于奶牛泰勒蟲病輔助選擇的分子標(biāo)記及其檢測方法，并結(jié)合傳統(tǒng)的奶牛育種、人工授精等技術(shù)，從而降低我國奶牛泰勒蟲病的感染率，提高奶牛養(yǎng)殖的終生產(chǎn)值和牛場的經(jīng)濟效益。

硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearoy1CoA desaturease，SCD)是合成單不飽和脂肪酸(MUFA)的限速酶，催化飽和脂肪酸(SFA)的脂酰輔酶A脫氫，其首選底物是軟脂酰和硬脂酰輔酶A，分別在C9-C10脫氫轉(zhuǎn)化生成棕櫚油酸(palmitoleate)(△916:1)與油酸(Oleate)(△918:1)，兩者是合成膜磷脂、膽固醇酯和三酰甘油的底物^[16-17]，對牛脂肪組織中脂肪酸的組成以及肌肉間脂肪沉積有著重要影響。研究^[18]表明，大理石花紋評分性狀在三種基因型(CC、CT和TT)間表現(xiàn)出一定的差異性：參照評分標(biāo)準(zhǔn)，CC型個體評分值分別高于CT和TT型個體0.03和0.06個評分值，說明CC型個體肌間脂肪含量相對較高。另外，研究^[19]還表明，SCD1基因C878T位點突變對中國荷斯坦奶牛脂肪相關(guān)性狀有較大的遺傳效應(yīng)。

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能用于降低奶牛泰勒蟲病的輔助選擇的分子標(biāo)記及其檢測方法，并結(jié)合傳統(tǒng)的奶牛育種、人工授精等技術(shù)，對種牛進行選種選配，從而降低我國奶牛泰勒蟲病的感染率，提高奶牛養(yǎng)殖的終生產(chǎn)值和牛場的經(jīng)濟效益。

本發(fā)明的基本思路是：基于現(xiàn)有技術(shù)狀況，如：1)奶牛泰勒蟲病的主要傳播動物為蜱蟲，蜱蟲會選擇奶牛皮膚較薄的位置寄生，從而傳播泰勒氏蟲病，因此，奶牛脂肪沉積與皮下脂肪厚度對蜱蟲的傳播有一定的影響；2)前期研究表明，SCD對牛脂肪組織中脂肪酸的組成以及脂肪沉積有著重要影響?；谝陨霞夹g(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明著重研究了SCD1不同基因型與奶牛泰勒蟲病的感染率的關(guān)聯(lián)。通過以866頭奶牛個體為研究對象，采用PCR-SSCP、直接測序和飛行質(zhì)譜法分析SCD1基因遺傳多態(tài)性，結(jié)合其泰勒蟲病感染與淘汰等信息，經(jīng)Logstic分析，最終發(fā)現(xiàn)了與奶牛泰勒蟲病感染顯著相關(guān)的SCD1基因上的SNP突變，即SCD1基因C878T SNP位點。SCD1基因878位點SNP對奶牛泰勒蟲感染的影響達到顯著水平(P＝0.011)，TT型奶牛感染泰勒蟲的概率僅為CC型個體的39％(詳見表2)；并以此發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，建立了奶牛輔助育種選擇分子遺傳標(biāo)記及其檢測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種用于降低奶牛泰勒蟲病輔助選擇的分子標(biāo)記，其特征在于，硬脂酰輔酶A去飽和酶SCD1基因(NC_007327)在8586bp的一個堿基C→T的SNP突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鏈中878位氨基酸-丙氨酸(alanine)突變?yōu)槔i氨酸(valine)。

本發(fā)明還提供了一種用于降低奶牛泰勒蟲病輔助選擇的分子標(biāo)記的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)以從樣品中提取的DNA為樣本，使用用于降低奶牛泰勒蟲病輔助選擇的分子標(biāo)記引物進行PCR擴增；

2)檢測步驟1)中的PCR產(chǎn)物的序列，根據(jù)分子標(biāo)記，即：SCD1基因(NC_007327)在8586bp的SNP突變，判定其樣品的基因型為CC，CT或者TT型，對降低奶牛泰勒蟲病進行輔助選擇，其中CC型感染率最高，TT型感染率最低。

可選地，步驟2)中的檢測方法可以是普通測序法，此時步驟1)中使用的用于降低奶牛泰勒蟲病輔助選擇的分子標(biāo)記引物的核苷酸序列為：

F1：5’-ACCTGGCTGGTGAATAGTGC-3’；

R1：5’-TGACATATGGAGAGGGGTCA-3’。

可選地，步驟2)中的檢測方法也可以采用飛行時間質(zhì)譜法。此時使用的用于降低奶牛泰勒蟲病輔助選擇的分子標(biāo)記引物的核苷酸序列為：

F2：5’-ACGTTGGATGACCCCCGAGAGAATATTCTG-3’；

R2:5’-ACGTTGGATGTAAGCAGCAGACCACTAGAC-3’；

U:5’-ggGGTTTCCCTGGGAGCTG。

本發(fā)明還提供了如上所述的用于降低奶牛泰勒蟲病輔助選擇的分子標(biāo)記以及檢測方法在與降低奶牛泰勒蟲病相關(guān)的判定或者檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案達到了如下的有益效果：

1)本發(fā)明中所使用的分子標(biāo)記SCD1基因878位點SNP對奶牛泰勒蟲感染的影響達到顯著水平(P＝0.011)(見表2)，驗證了該SNP突變標(biāo)記點與奶牛泰勒蟲病的感染顯著相關(guān)，使得分子標(biāo)記具有更高的準(zhǔn)確性和可信度；

2)此外，該分子標(biāo)記在輔助育種中的應(yīng)用，使得對種牛在奶牛泰勒蟲易感性方面的選擇更有效和更具針對性，從而達到降低牛場泰勒蟲病的發(fā)病率和感染率，減少該病對奶牛生產(chǎn)的影響，同時可減少因淘汰奶牛而購買其他奶牛所產(chǎn)生的費用，提高奶牛生產(chǎn)效率和經(jīng)濟價值。

附圖說明

圖1是SCD1基因878位點PCR擴增圖。

圖2是中國荷斯坦奶牛SCD1基因的PCR-SSCP結(jié)果。

圖3是中國荷斯坦奶牛SCD1不同基因型測序圖。

圖4是SCD1-878位點飛行時間質(zhì)譜檢測圖。

具體實施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實施方式對本發(fā)明做進一步的介紹。

實施例1

(1)樣品采集：從奶牛靜脈采抗凝血10mL，用常規(guī)方法提供其DNA；

(2)引物設(shè)計：根據(jù)GenBank公布的牛的SCD1基因DNA序列(NC_007327)，用Primer5.0設(shè)計如下引物，用于擴增外顯子5部分片段引物序列：

F1：ACCTGGCTGGTGAATAGTGC

R1：TGACATATGGAGAGGGGTCA

(3)PCR擴增：

PCR反應(yīng)體系如下：總體積20μL，10x buffer 2.0μL，25mmol·L^-1Mg²⁺1.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U·μL^-1)0.3μL，上下游引物各(10pmol·μL^-1)1.0μL，模板DNA(100ng·μL^-1)1.0μL，ddH₂O 12.7μL。

PCR循環(huán)參數(shù)如下：

擴增片段大小為212bp(見圖1)。

(4)對步驟(3)中獲得的PCR產(chǎn)物，進行測序：

直接用ABI 9700型測序儀進行測序。對測序所得結(jié)果，用DNAMAN和Chromas軟件，與參考序列(登錄號：NC_007327)進行比對，并判定其基因型，結(jié)果見圖2。

利用本專利設(shè)計的引物,經(jīng)SSCP檢測，SCD1基因在隨機樣品中表現(xiàn)出3種基因型(圖2)，分別命名為CC、CT和TT基因型，然后分別對不同基因型個體測序(圖3)。在SCD1基因(NC_007327)在8586bp處發(fā)現(xiàn)一個堿基C→T的突變(C878T),導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鏈中878位氨基酸-丙氨酸(alanine)突變?yōu)槔i氨酸(valine)。根據(jù)PCR-SSCP結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果，以866頭中國荷斯坦母牛為基礎(chǔ)進行統(tǒng)計分析，CC、CT和TT的基因型頻率分別為0.50、0.41和0.09，等位基因C和T的頻率分別為0.703和0.297(見表1)。

表1中國荷斯坦牛SCD1 878位點基因基因頻率和基因型頻率分布：

實施例2

采用飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF System)對以上SNP進行檢測。也可采用飛行質(zhì)譜方法進行快速大批量檢測，且價格便宜。

此時使用分子標(biāo)記引物的核苷酸序列為：

F2：ACGTTGGATGACCCCCGAGAGAATATTCTG

R2：ACGTTGGATGTAAGCAGCAGACCACTAGAC

U：ggGGTTTCCCTGGGAGCTG

PCR擴增體系及PCR擴增程序如下：

其中，所有需要分型的DNA樣本都稀釋到5ng/μl，取1μl DNA樣本，將其與0.95μl水、0.625μl PCR緩沖液(含15mM MgCl₂)、1μl 2.5mM dNTP、0.325μl的25mM MgCl₂、1μl PCR引物以及0.1μl HotStar Taq酶(Qiagen)混合在一起。PCR擴增的反應(yīng)條件為：94℃15分鐘；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分鐘，共45個循環(huán)；最終72℃3分鐘。

采用飛行質(zhì)譜方法檢測以上步驟中所獲得的PCR產(chǎn)物，方法如下：

PCR擴增后，剩余的dNTP將被去磷酸消化掉，反應(yīng)體系包括1.53μl水、0.17μl SAP緩沖液、0.3單位堿性磷酸酶(Sequenom)。該反應(yīng)在37℃進行40分鐘，然后85℃5分鐘使酶失活。堿性磷酸酶處理后，針對SNP的單堿基延伸引物在下列反應(yīng)體系中進行：0.755μl水、0.2μl 10X iPLEX緩沖液、0.2μl終止混合物、0.041μl iPLEX酶(Sequenom)，0.804μl 10μM的延伸引物。

單堿基延伸反應(yīng)在下列條件下進行：94℃30秒；94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒5個循環(huán)，共40個循環(huán)；最后72℃3分鐘。在終止反應(yīng)物中加入6mg陽離子交換樹脂(Sequenom)脫鹽，混合后加入25μl水懸浮。使用MassARRAY Nanodispenser(Sequenom)將最終的分型產(chǎn)物點樣到一塊384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行分析。最終結(jié)果由MassARRAY RT軟件系統(tǒng)(版本號3.0.0.4)實時讀取，并由MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號3.4)完成基因分型分析(見圖4)。圖3中，橫座標(biāo)為質(zhì)譜分子量單位(道爾頓)，縱座標(biāo)為不同等位基因光強度值。SCD1-878位點檢測范圍在6000-6300道爾頓間，其中C基因檢測分子量為6050左右，T基因檢測分子量為6250左右。如在相應(yīng)檢測分子量處有較高的光強度值，則表示該個體具有該等位基因。如在這2個分子量處有雙峰，則該個體為雜合子。如上3張圖分別表示SCD1-878位點3種不同的基因型(CC、CT和TT)。

結(jié)合其泰勒蟲易感性及淘汰等信息，進行Logstic回歸，發(fā)現(xiàn)SCD1基因?qū)δ膛Ｌ├障x病的易感性的影響達到極顯著水平。

在全國各種公牛站進行常規(guī)奶牛育種工作中，增加本研究發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)記SCD1基因C878T SNP檢測，篩選其中TT型個體公牛，并與母牛進行配種，可增加其后代母牛SCD1基因C878T TT和CT型個體比例，逐漸淘汰CC型母牛個體，從而提高奶牛對泰勒蟲病的抵抗性，減少該病對奶牛生產(chǎn)的影響，提高奶牛生產(chǎn)效率和經(jīng)濟價值。

通過logistic回歸分析不同SCD1-878位點基因型與奶牛泰勒氏蟲感染率的關(guān)系，結(jié)果如表2所示：

表2奶牛SCD1-878位點不同基因型泰勒蟲感染情況對照表：

通過本研究結(jié)果可以看出：SCD1基因878位點SNP對奶牛泰勒蟲感染的影響達到顯著水平(P＝0.011)，CC為優(yōu)勢等位基因型，基因型頻率為0.50；C為優(yōu)勢等位基因，等位基因頻率計算為0.703。同時，TT型奶牛感染泰勒蟲的概率僅為CC型個體的39％。

本發(fā)明首次披露了SCD1基因C878T的SNP突變位點的基因型在對奶牛泰勒蟲病進行輔助選擇方面的應(yīng)用。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明設(shè)計分子標(biāo)記引物時使用的SCD1基因與奶牛生產(chǎn)性能、免疫等性狀密切相關(guān)，其SNP突變標(biāo)記點與奶牛泰勒蟲病的感染顯著相關(guān)，具有更高的準(zhǔn)確性和可信度，因而可以有效地針對奶牛泰勒蟲病的易感性對種牛進行輔助選擇，以降低后代奶牛的發(fā)病率，并間接提高產(chǎn)值。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。