專利名稱：：用于檢測呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲及羊梨形蟲檢測膜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種動物疾病檢測用試紙，確切講是一種用于檢測呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲檢測膜及其制備和使用方法。
背景技術(shù)：
：羊泰勒蟲病是由羊泰勒蟲(J7^7eha/^d)引起綿羊和山羊的-種蜱傳性血液原蟲病，寄生于牛、羊和其它動物上皮細胞、淋巴細胞和紅細胞內(nèi)。1914年最先發(fā)現(xiàn)于埃及，隨后在非洲、歐洲、亞洲的許多國家都發(fā)現(xiàn)該病原。我國羊泰勒蟲病f、楊輔國等在1957年首先發(fā)現(xiàn)于四川省甘孜藏族自治州乾寧縣。在我國，經(jīng)研^證實羊的泰勒蟲病病原并不是以上任何一種，而是新種，初步定名為呂氏泰勒蟲(r/mvem/mw')和尤氏泰勒蟲(rw7e"6ergz')，這兩種蟲體的傳播媒介均為青海血蜱。為我國的特有病原。一般而言，泰勒蟲的診斷主要包括三種方法(l)通過血涂片的方法和臨床癥狀，例如AkinboadeOA,Dipeolu00.ComparisonofbloodsmearandindirectfluorescentantibodytechniquesindetectionofhaemoparasiteinfectionsintradecattleinNigeria[J].VetParasitol.1984,14(2):95-104;DarghouthME,BouattourA,BenMiledL,SassiL.DiagnosisofTheileriaannulatainfectionofcattleinTunisia:comparisonofserologyandbloodsmears[J].VetRes.1996;27(6):613-21.(2)應(yīng)用一些血清學(xué)方法，這種方法是補體結(jié)合試驗(CFT)和間接熒光抗體試驗(IFAT)檢測，但這些方法很難排除不同種之間的交叉反應(yīng)，而且常會出現(xiàn)假陽性和漏f金參見BruningA.Equinepiroplasmosisanupdateondiagnosis[J].BrVetJ,1996，152:139151，或者PapadopoulosB,BrossardM,PerieNM(1996)PiroplasmsofdomesticanimalsintheMacedoniaregionofGreece.3.Piroplasmsofsmallruminants.VetParasitol63:67-74。(3)PCR技術(shù)，是目前檢測泰勒蟲最常用的分子診斷方法，與常規(guī)的方法相比具有敏感性高、特異性強、檢出率高等優(yōu)點，參見AlhassanA，P畫idonmkigW,OkamuraM,HiritaH,BattsetsegB,FujisaldF,YokoyamaN,IgarashiI(2005)Developmentofasingle-roundandmultiplexPCRmethodforthesimultaneousdetectionofBabesiacaballiandBabesiaequiinhorseblood.VetParasitol129:43—49;AltayK,DumanliN,HolmanPJ,AktasM(2005)Detectionof7%e//en'aovisinfectedsheepbynestedPCR.VetParasitol127:99—104。但PCR方法通常不能同時檢測出混合感染的發(fā)生。我國的病原呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲，具有極強的致病性和致死性。而且，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病原分布廣泛，直接威脅著我國養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。所以，制定有效的檢測預(yù)報系統(tǒng)對該病的防治十分迫切和必要。中國發(fā)明專利申請200810018313.4公開了一種檢測羊泰勒蟲病的ELISA診斷試劑盒及其制備方法，該方法，包括可與待測樣品結(jié)合的固體支持物；包被于可與待測樣品結(jié)合的固體支持物上的羊泰勒蟲裂殖子抗原，每孔0.1ug;作為二抗的用酶標記的兔抗羊IgG;標準羊泰勒蟲陽性血清；標準羊泰勒蟲陰性血清；明膠；底物稀釋液；30%H2O2;無色底物；終止液；磷酸鹽緩沖液。經(jīng)包被抗原、洗滌、封閉、洗滌、風(fēng)千后密封4'C保存等工藝制備而成。本發(fā)明具有蟲體抗原特有的高特異性；該ELISA診斷試劑盒實現(xiàn)了本病檢測的標準化、自動化、且適合羊泰勒蟲病的早期診斷和大規(guī)模的野外血清流行病學(xué)調(diào)査。能早期診斷本病，一般在感染后5天就能檢出特異性抗體，檢測出血清抗體的最早時間比比傳統(tǒng)顯微鏡檢測出的時間提前5-10天。但該專利申請的方法卻無法區(qū)分患病羊感染的究竟是何種泰勒蟲，這會影響患病羊只的治療及預(yù)防工作。另一方面該專利的檢測方法用時較長，影響到這一方法的推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜及這種檢測膜的制備方法和使用方法。本發(fā)明用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜是在BiodyneC薄膜上固定有呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸。本發(fā)明的用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜，在BiodyneC薄膜上還固定有巴貝斯蟲特異性寡核苷酸和泰勒蟲通用特異性寡核苷酸。本發(fā)明用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜，在BiodyneC薄膜上固定的呂氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為atottctttttgatgagttg，固定的尤氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為tgcattttccgagtgttact，固定的羊梨形蟲特異性寡核苷酸序列為ctgtcagaggtgaaattct,固定的巴貝斯蟲特異性寡核苷酸序列為ccttggtaatggttaataggaa，固定的羊巴貝斯蟲未定種特異性寡核苷酸序列為cgggtttcgtctacttcgc，固定的莫氏巴貝斯蟲特異性寡核苷酸序列為gaatgatgccgacttaaaccct。本發(fā)明用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜的制備方法是分別人工合成出呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸，將所得到的各寡核苷酸5'端用氨基團修飾，再將其分別共價結(jié)合到帶有負電荷的BiodyneC薄膜上；或者是分別人工合成出巴貝斯蟲特異性寡核苷酸、泰勒蟲通用特異性寡核苷酸呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸，將所得到的各寡核苷酸5'端用氨基團修飾，再將其分別共價結(jié)合到帶有負電荷的BiodyneC薄膜上。本發(fā)明的檢測膜檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲及羊梨形蟲的方法是以待檢測羊血提取的DNA模板，在泰勒蟲和巴貝斯蟲18SrRNA基因序列V4高變區(qū)兩端的保守區(qū)域設(shè)計一對擴增出的片段大小為480bp-491bp的引物，其中一條引物用生物素標記，再進行PCR擴增，獲得生物素標記的PCR產(chǎn)物，生物素標記的PCR產(chǎn)物和固定在BiodyneC膜上的泰勒蟲和巴貝斯蟲的寡核苷酸進行雜交，再經(jīng)增強化學(xué)發(fā)光孵育后將雜交后的膜放置曝光儲片夾內(nèi)，在薄膜上放X光膠片進行曝光，再對膠片進行顯影和定影處理，根據(jù)膠片上產(chǎn)生的強度信號確定被檢羊是否有患有相應(yīng)的疾病。本發(fā)明有如下優(yōu)點采用本發(fā)明的檢測膜可以很方便地檢測并區(qū)分出呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲，同時由于本發(fā)明的檢測膜上還固定有羊梨形蟲的特異性寡核苷酸，因此本發(fā)明可以同時檢測多個蟲種的存在，同時可以檢測被檢動物感染有一種還是多種梨形蟲，這對于羊群疾病的控制及預(yù)防治療有積極的意義。本發(fā)明的方法最大優(yōu)點是可以同時檢測出泰勒蟲和巴貝斯蟲時，而且只需要作一次PCR，如果有擴增產(chǎn)物，說明動物肯定是感染了巴貝斯蟲或泰勒蟲的某一種或幾個種。另外，PCR產(chǎn)物與探針雜交后，還能說明被檢動物所感染的蟲體的種類，這對于疾病的控制及預(yù)防有更為積極的意義。第三，本發(fā)明的敏感性要高于PCR，且能同時區(qū)分病原的屬和種，這一特性在流行病學(xué)調(diào)査上具有重要意義。由于與探針雜交的PCR產(chǎn)物可以除去，因此雜交膜可以反復(fù)使用，據(jù)報道這種膜至少可以使用20次以上，另外，在一張膜上，可以固化45個探針，同時檢測45個PCR產(chǎn)物，其成本相對低廉。采用本發(fā)明的檢測膜進行檢測的方法非常的簡單，而且檢測用時較少，其檢測成本相對也比較低，而且漏檢率要遠遠小于現(xiàn)有技術(shù)。圖l為部分患病羊的標準陽性樣品檢測結(jié)果圖。具體實施例方式一.含有泰勒蟲和巴貝斯蟲特異寡核苷酸的檢測膜制備根據(jù)已確定的18SrRNA基因序列的V4高變區(qū)域設(shè)計針對莫氏巴貝斯蟲、巴貝斯蟲喀什株未定種、呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲不同蟲種的四個特異性寡核苷酸探針的基因序列設(shè)計，并命名為B.m，B.spXJ，T.l和T.u，另外，針對所有梨形蟲的通用探針catch-all和泰勒蟲通用探針，巴貝斯蟲通用探針Tall,Ball也分別被設(shè)計合成。所有的寡核苷酸探針N-(trifluoroacetamidohexyl-cyanoethyl,N,N-diisopropylphosphoramidite[TFA])-C6氨基團連接修飾，將合成的探針0-800pmol/150ul500mMNaHCO3(pH8.4)，尋找最佳濃度用于雜交。有的寡核苷酸5'端被氨基團修飾后合成。它們能夠共價結(jié)合到帶有負電荷的BiodyneC薄膜上。具體的做法如下(1)特異性寡核苷酸的制備寡核苷酸探針由專業(yè)公司按我們的設(shè)計要求合成，我們在可變區(qū)設(shè)計好后，將探針的序列發(fā)給專業(yè)公司，由他們合成的，本發(fā)明是由蘭州寶生物公司合成寡核苷酸探針。其中采用的泰勒蟲和巴貝斯蟲寡核苷酸探針序列和最佳濃度范圍見表l。表l泰勒蟲和巴貝斯蟲寡核苷酸探針序列和最佳濃度寡核苷酸序列J3佳濃度(Oligonucleotides)(Sequence5，-3》(Optimisedconcentrations)梨形蟲通用探針ctgtcagaggtgaaattct(Cat-all)(ca841-859)100200pmol巴貝斯蟲通用探針ccttggtaatggttaataggaa100200pmol("11)(B-all745-766)泰勒蟲通用探針taccaaagtaatggttaatagg1050pmol(r醫(yī)all)(T陽all811-832)莫氏巴貝斯蟲探針gaatgatgccgactt犯accct100200p陽l("oto/)(B.m466~487)羊巴貝斯蟲未定種探針cgggtttcgtctacttcgc600800pmolspXJ)(B.spKashi637-655)呂氏泰勒蟲探針atcttctttttgatgagttg300400pmol(7:/諸冊/7,-)(T-l628-647)尤氏尜勒蟲探針tgcattttccgagtgttact600800pmol(r.w//e"6，.)(T-u678-697)用500mM，pH為8,4的NaHC03149ul稀釋泰勒蟲和巴貝斯蟲的特異性寡核苷酸待用。(2)膜的制備將BiodyneC膜剪成14.5cmX14.5cm大小，用記號筆標記薄膜以便能在以后的操作中辨別方向。用去離子水配制新鮮的16%(w/v)l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(簡稱為EDAC)，力口10mlEDAC，孵育10分鐘活化BiodyneC膜，室溫下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。將薄膜放在塑料容器中用去離子水搖洗兩分鐘，然后放入潔凈的印跡儀中。旋緊手柄。通過抽吸除去孔里殘留的液體。將150ul稀釋的寡核苷酸溶液加入印跡儀的孔槽，其中第一個和最后一個孔不加寡核苷酸。將墨水用2xSSPE緩沖液按適合的比例(本發(fā)明中采用1:100的比例)稀釋，加入第一個孔和最后一個孔。所有的樣品都加入以后，室溫下孵育2分鐘。通過抽吸除去每個孔槽內(nèi)的寡核苷酸溶液及第-一和最后-個孔槽的墨水稀釋液。用鑷子從印跡儀中除去膜，然后用新鮮配制的100mMNaOH250ml在塑料容器中孵育10分鐘，不斷搖動容器使膜鈍化。用去離子水漂洗薄膜。在塑料容器中用250ml2xSSPE/質(zhì)量比0.1%的SDS60°C漂洗5分鐘，漂洗期間輕微搖動溶液瓶。用20mM，pH為8.0的EDTA100ml在塑料容器中漂洗薄膜，室溫下輕輕搖動15分鐘，即得到本發(fā)明的檢測膜。將其在4。C保存薄膜直到使用(用塑料制品密封或者用包裝膜包裝避免薄膜脫水)。二、檢測膜的檢測對比實驗1、羊梨形蟲裂殖子的制備選試驗除脾羊4只，用液氮保存的含有呂氏泰勒蟲，尤氏泰勒蟲，莫氏巴貝斯蟲和喀什株巴貝斯蟲未定種的血液紅細胞頸靜脈接種，感染除脾羊。在感染羊后，每天肌肉注射地塞米松，首次4支/羊，以后2支/羊，每天注射一次，直至染蟲率升高為止。從感染之日起，每天早晨測量羊的體溫，從體溫開始上升之日起，每天從耳緣靜脈涂制血片，甲醇固定兩次，姬母薩染色后，用顯微鏡檢査紅細胞染蟲率。當(dāng)紅細胞染蟲率達到10.0%以上時，頸動脈放血，20.0%枸櫞酸鈉抗凝，得到待檢測的血樣。蟲體的分離與提純(1)力卩300ul血液于盛有900ulBRCCellLysisSolution的1.5ml的離心管中，室溫孵育10分鐘，孵育過程中顛倒離心管數(shù)次，直到液體澄清透明。(2)13000rpm離心1分鐘，棄上清，保留下面的可見的沉淀和大約1020^1液體，用渦旋儀渦旋20秒，使沉淀物懸浮。(3)每管中加入300ulCellLysisSolution,吹打混勻使所有細胞裂解。(4)加入lOOulProteinPreciptationSolution到細胞裂解液中。(5)渦旋20秒，至出現(xiàn)棕褐色沉淀顆粒。(6)13000rpm離心5分鐘。(7)將上清液移至新標記的離心管中，加入300jil異丙醇，顛倒50次。(8)13000rpm離心5分鐘。(9)棄上清，在干凈的紙巾上倒置，將剩余的液體吸干。(10)加入300(il70。/。乙醇，顛倒離心管數(shù)次以洗脫DNA小團塊。(11)13000rpm離心3分鐘，小心除去乙醇，在吸水紙上吸干剩余液體。(12)用真空干燥儀進行真空干燥。(13)加入100(^1DNAHydrationSolution。(14)4。C過夜或60。C溫育1小時，得到待測的DNA。(15)—2(TC保存?zhèn)溆谩?、引物的設(shè)計在泰勒蟲和巴貝斯蟲18SrRNA基因序列V4高變區(qū)兩端的保守區(qū)域設(shè)計一對擴增出的片段大小為480bp-491bp的引物，如下上游引物RLB-F(5-gaggtagtgacaagaaataacaate-3)下游引物RLB-R(biotin-5-tcttcgatcccctaactttc-3)。3、PCR擴增基因片段PCR擴增的反應(yīng)體系及程序H2056単>40個循環(huán)1Oxbuffer*7.2(il注本發(fā)明所用的緩沖液為200mM的Tris-HCl(pH8.55),160mM(NH4)2S04禾B20mMMgCl210mMdNTPl牟lOOuM上游引物(RLBF)3.6^1lOOuM下游引物(RLBR)3.6^1由步驟1所得DNAlulTaq酶0.36|xl所有的樣品混合后12000rpm離心10秒，置于PCR擴增儀中按照如下循環(huán)進行擴增94°C3min94°Clmin30sec55。Clmin30sec72°Clmin30sec72。C3min4°C保存取PCR產(chǎn)物1.5ul在1.0。/。的瓊脂糖凝膠(含0.5。/。ug/ml溴化乙錠)，在75伏的電壓下進行電泳分析，觀察擴增結(jié)果。4、檢測生物素標記的PCR產(chǎn)物和固定在BiodyneC膜上的泰勒蟲和巴貝斯蟲的寡核苷酸進行雜交。如果存在泰勒蟲或巴貝斯蟲，則和寡核苷酸特異性作用后用streptavidin-peroxidase和ECL-detection(增強化學(xué)發(fā)光)孵育后在黑色的方格里面的膠片上可以看到顯影，操作步驟如下(1)準備下面的緩沖液，用無離子水稀釋，所有的緩沖液使用前要預(yù)熱。(按一張膜的量)250ml2xSSPE/0.1%SDS,60。C，500ml2xSSPE/0.5%SDS,60°C，500ml2xSSPE/0.5%SDS,42。C.500ml2xSSPE,室溫.(2)力Q20^的PCR產(chǎn)物到130^2xSSPE/0.1%SDS中。(3)稀釋后的PCR產(chǎn)物99°C熱激10分鐘然后立即在冰中冷卻。(4)用250ml2xSSPE/0.1%SDS60。C漂洗膜5分鐘。(5)在印跡儀中按照與寡核苷酸成垂直的方向放入薄膜和支持氣墊。(6)通過抽吸的方法除去印跡儀中殘留的液體。(7)用稀釋后的PCR產(chǎn)物填充孔槽，在水平面上60°C雜交10分鐘。(8)通過抽吸除掉印跡儀中的樣品，然后用鑷子將膜取出。(9)用250ml2xSSPE/0.5。/oSDS60。C,10分鐘，漂洗膜兩次。(10)放置膜在旋轉(zhuǎn)瓶中使其冷卻，以免下一步因過氧化物酶作用而失活。(11)加入2.5ul鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶(500U/ml)結(jié)合到10ml2xSSPE/0.5%SDS中，將此溶液加入旋轉(zhuǎn)瓶中42°C孵化薄膜45-60分鐘。(12)用250ml的2xSSPE/0.5%SDS溶液42。C10分鐘漂洗兩次。(13)用250ml的2xSSPE在室溫下5分鐘漂洗膜兩次。(14)加lml免疫印跡發(fā)光氨試劑A于一個5ml試管中，隨后加入lml的試劑B，混合均勻。(15)將薄膜放置在塑料布或者包裝膜內(nèi)，滴加A、B混合液在膜上含有寡核苷酸和PCR產(chǎn)物雜交的區(qū)域，用塑料層覆蓋膜，塑料薄膜封閉器封閉薄膜。(16)放置封閉好的薄膜于曝光儲片夾內(nèi)，放一張X光膠片在薄膜上(在膠片的左側(cè)角打折為了以后辨認方向)，曝光30分鐘。(17)取出X光膠片放入顯影液中顯影5分鐘，然后用無離子水漂洗2分鐘，隨后轉(zhuǎn)入定影液中定影5分鐘，再用無離子水漂洗，充分洗去定影液后觀察結(jié)果。(18)如果膠片上的信號太弱或太強，可延長或縮短曝光時間將薄膜直接曝光于另一張膠片。雜交過的PCR產(chǎn)物可以從膜上除去。一張膜可以重復(fù)利用大約15次。結(jié)果判定通過PCR擴增表1中列出的所有蟲株的18SrRNA基因V4高變區(qū)域，產(chǎn)生的DNA片段和固定在薄膜上的寡核苷酸探針進行核酸雜交，寡核苷酸探針經(jīng)光學(xué)發(fā)光作用，在膠片上產(chǎn)生一定強度的信號，所有的探針僅與它們各自的靶序列進行結(jié)合，不同的種、屬和株之間沒有交叉反應(yīng)，很清楚的與相應(yīng)的蟲種或者株產(chǎn)生雜交信號。同時，為了檢測設(shè)探針的特異性，選用了牛的東方泰勒蟲和羊的基因組以及水分別做陰性和空白對照，結(jié)果顯示，東方泰勒蟲僅與梨形蟲通用探針和泰勒蟲通用探針進行了雜交，和其他的探針沒有交叉反應(yīng)的產(chǎn)生。每個泰勒蟲種可以被三個核苷酸探針識別梨形蟲通用探針(ca841-859)，泰勒蟲通用探針(T-all811-832),和呂氏泰勒蟲探針(T-1628-647)或尤氏泰勒蟲探針(T-u678-697)。每個巴貝斯蟲也可被三個探針識別梨形蟲通用探針(ca841-859)、巴貝斯通用探針(B-all745-766)，和莫氏巴貝斯蟲探針(B.m466一87)或巴貝斯蟲未定種探針(及sp.Kashi637-655)。具體的檢測結(jié)果參見圖l，圖中Ca為梨形蟲通用探針(catchall);1_6道分別為泰勒蟲通用探針，巴貝斯蟲通用探針，莫氏巴貝斯蟲探針，巴貝斯蟲未定種探針，呂氏泰勒蟲探針，尤氏泰勒蟲探針；其中1-13排分別是莫氏巴貝斯(承德株)、莫氏巴貝斯蟲(臨潭株)、莫氏巴貝斯蟲(寧縣株)、莫氏巴貝斯蟲(天祝株)、巴貝斯蟲未定種(喀什株)、呂氏泰勒蟲(渭源株)、呂氏泰勒蟲(麻當(dāng)株)、呂氏泰勒蟲(寧縣株)、尤氏泰勒蟲(張家川株)、尤氏泰勒蟲(隆德株)、東方泰勒蟲(盧氏株)、羊基因組對照、水對照。根據(jù)建立的標準陽性試驗，經(jīng)過對部分患病羊的檢測結(jié)果顯示雜交反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)，所有感染有泰勒蟲或者巴貝斯蟲的樣品均可看到一個或者多個種的雜交信號產(chǎn)生。同時，梨形蟲通用的寡核苷酸探針(catch-all)可以表明，如果PCR產(chǎn)物與通用的探針發(fā)生雜交信號，而沒有種特異性的探針產(chǎn)生雜交信號，則可以判斷為一個新種或新的基因型的發(fā)現(xiàn)，同樣，設(shè)計的泰勒蟲屬特異性探針(T-all)可以檢測出樣品所感染的所有的泰勒蟲的存在，包括羊泰勒蟲及不同的種，設(shè)計的巴貝斯蟲屬特異性探針(B-all)可檢測出樣品所感染的所有羊巴貝斯蟲種的存在。同時，設(shè)計的四個種特異性探針(S.moto化5.spKashi;7:/wwera/z麗/;rw7e"^w/:)更加詳盡的診斷動物所感染的蟲種類別或者蟲株，研究表明，本發(fā)明能夠檢測出目前已存在的所有羊梨形蟲蟲種。本發(fā)明表明，根據(jù)已報道的梨形蟲18SrRNA基因序列設(shè)計梨形蟲的通用性引物對和羊梨形蟲種特異性寡核苷酸探針固定于BiodyneC薄膜上，將PCR方法和RLB方法相結(jié)合建立了一種特異，敏感的診斷方法，可以識別相應(yīng)的梨形蟲株，種或則屬；其敏感性明顯高于PCR方法和ELISA方法。通過對117份采集的六個不同地區(qū)的野外樣品進行檢測，并特異性引物擴增的PCR方法和ELISA方法進行比較，RLB的檢出率明顯高于其他兩種方法，該方法可以檢測出梨形蟲的種類和混合感染的情況，為梨形蟲病的檢測、蟲種鑒定和流行病學(xué)調(diào)查提供了工具。采用本發(fā)明對部分野外放養(yǎng)羊采集的血樣檢測，其結(jié)果見表2經(jīng)對采用本發(fā)明方法檢測為陽性的樣品進行DNA序列測定，證明了其結(jié)果的正確性。從表2可見本發(fā)明的檢出率明顯高于現(xiàn)有的兩種技術(shù)。另外，取樣地區(qū)的疫情與檢測結(jié)果是相關(guān)，這進一步證明了本發(fā)明可靠性。_陽性樣品數(shù)_陽性率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表2.部分野外樣品檢測結(jié)果權(quán)利要求1、一種用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜，其特征是在BiodyneC薄膜上固定有呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜，其特征是在BiodyneC薄膜上還固定有巴貝斯蟲特異性寡核苷酸和泰勒蟲通用特異性寡核苷酸。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜，其特征在于在BiodyneC薄膜上固定的呂氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為atcttctttttgatgagttg，固定的尤氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為tgcattttccgagtgttact，固定的羊梨形蟲特異性寡核苷酸序列為ctgtcagaggtgaaattct，固定的巴貝斯蟲特異性寡核苷酸序列為ccttggtaatggttaataggaa，固定的羊巴貝斯蟲未定種特異性寡核苷酸序列為cgggtttcgtctacttcgc，固定的莫氏巴貝斯蟲特異性寡核苷酸序歹U為gaatgatgccgacttaaaccct。4、權(quán)利要求1所述的用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜的制備方法，其特征是分別人工合成出呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸，將所得到的各寡核苷酸5'端用氨基團修飾，再將其分別共價結(jié)合到帶有負電荷的BiodyneC薄膜上。5、權(quán)利要求2或3所述的用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜的制備方法，其特征是分別人工合成出巴貝斯蟲特異性寡核苷酸、泰勒蟲通用特異性寡核苷酸及呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸，將所得到的各寡核苷酸5'端用氨基團修飾，再將其分別共價結(jié)合到帶有負電荷的BiodyneC薄膜上。6、采用權(quán)利要求1至3所述的任一檢測膜檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的方法，其特征是以待檢測羊血提取的DNA模板，在泰勒蟲和巴貝斯蟲18SrRNA基因序列V4高變區(qū)兩端的保守區(qū)域設(shè)計一對擴增出的片段大小為480bp-491bp的引物，其中一條引物用生物素標記，然后進行PCR擴增，獲得生物素標記的PCR產(chǎn)物，生物素標記的PCR產(chǎn)物和固定在BiodyneC膜上的泰勒蟲和巴貝斯蟲的寡核苷酸進行雜交，再經(jīng)增強化學(xué)發(fā)光孵育后將雜交后的膜放置曝光儲片夾內(nèi)，在薄膜上放X光膠片進行曝光，再對膠片進行顯影和定影處理，根據(jù)膠片上產(chǎn)生的強度信號確定被檢羊是否有患有相應(yīng)的疾病。全文摘要本發(fā)明公開一種動物疾病檢測用試紙，確切講是一種用于檢測呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲檢測膜及其制備與使用方法。本發(fā)明用于檢測呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和羊梨形蟲的DNA檢測膜是在BiodyneC薄膜上固定有呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸。文檔編號C12Q1/68GK101550446SQ20091000148公開日2009年10月7日申請日期2009年1月7日優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日發(fā)明者任巧云,黨志勝,關(guān)貴全,劉軍龍,劉志杰,劉愛紅,李有全,宏殷,牛慶麗,羅建勛,馬米玲,高金亮申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所