專利名稱：鑒別診斷牛環(huán)形泰勒蟲的試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種動物寄生蟲的檢測鑒別技術，確切講本發(fā)明提供一種快速鑒別診 斷被檢牛只是否感染環(huán)形泰勒蟲的檢測試劑盒，以及這種試劑盒的制備方法和使用方法。
背景技術：
環(huán)形泰勒蟲(Theileria annulata)是頂復門(Apicomplexa)、梨形蟲綱 (Piroplasmea)中的泰勒科(Theileriidae)、泰勒蟲屬的一個重要成員，經節(jié)肢動物-蜱傳 播后寄生于牛的巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞內，引起以高熱、貧血、出血、消瘦和體表淋巴 結腫脹為特征的一類血液原蟲疾病，即泰勒蟲病。據(jù)估計，世界每年約有2. 5X IO8頭牛受 至丨Ji亥病的威脅(Williamson S, Tait A, Brown D, et al. Theileria annul ata sporoziote surface Antigen express in Escherichia coli elicits neuralizing antibody[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1989,86 (12) :4639_4643。國際獸疫局(Office International Des Epizooties, 0ΙΕ)將其列為B類疫病，我國將其列為二類疫病。該病最早發(fā)生在北非和歐 洲南部，接著迅速蔓延到中東和印度，由俄羅斯南部進入中國(Aktas M，Altay K，Dumanli N. A molecular survey of bovine Theileria parasites among apparently healthy cattle and with a note on the distribution of ticks in eastern Turkey[J]. Vet Parasitol, 2006,138 :179_185)。在我國，內蒙古畜牧獸醫(yī)研究所和馬素芳等于1960年同 時在內蒙古首次發(fā)現(xiàn)環(huán)形泰勒蟲病以來，吉林、內蒙古、河北、天津、山西、陜西、寧夏、甘肅、 新疆、四川、重慶、湖北、河南、山東、浙江、湖南、福建、廣州和云南等19個省區(qū)也相繼報道 了該病，其主要傳播媒介是璃眼蜱屬的蜱包括小亞璃眼蜱、殘緣璃眼蜱和盾糙璃眼蜱等 (沈杰等，中國家畜家禽寄生蟲名錄[M]北京中國農業(yè)出版社，2004:24-25)。本病的季 節(jié)流行性很強，多呈急性經過，發(fā)病率和死亡率均很高，尤其對外來牛、純種牛以及雜交牛 的危害更大，是制約發(fā)展中國家養(yǎng)牛業(yè)生產和發(fā)展的主要疾病之一。牛環(huán)形泰勒蟲病的診斷現(xiàn)在主要有下列幾種手段(1)血涂片檢測、淋巴結穿刺、 體外培養(yǎng)、臨床癥狀和動物接種。(2)血清學方法，如補體結合試驗(CFT)、間接熒光抗 體試驗(IFAT)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等，但這些方法很難排除不同種之間的交 叉反應，而且常會出現(xiàn)假陽性或漏檢，參見Manuja A et al.，Comparison of cellular schizont,soluble schizont and soluble piroplasm antigens in ELISA for detecting antibodies against Theileria annulata.Veterinary Parasitology,2000,87(2-3) 93-101。(3)分子檢測技術，如DNA探針、巢氏PCR技術和反向線狀印跡雜交技術(RLB)， 與常規(guī)的方法相比具有敏感性高、特異性強、檢出率高等優(yōu)點，參見=Leonhard Schnittger et al. ， Simultaneous detection and differentiation of Theileria and Babesia parasites infecting small ruminants by reverse line blotting. Parasitol Res 2004,92:189-196;簡子健等，.牛環(huán)形泰勒蟲巢式PCR診斷方法的建立.新疆農業(yè)大學學 報2008，31 (6) :59 62。但是這些方法都具有同一個不可避免的缺點——需要先進的儀 器和專業(yè)培訓的技術人員，而且檢測中耗時較多。
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鑒別診斷牛環(huán)形泰勒蟲病在臨床與研究中有著特殊意義，但現(xiàn)階段尚無一種簡單 有效的手段。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術不足的，鑒別診斷牛環(huán)形泰勒蟲的檢測試劑盒， 同時提供這種試劑盒的使用方法。本發(fā)明的鑒別診斷牛環(huán)形泰勒蟲的試劑盒內至少有兩對牛環(huán)形泰勒蟲特異引物， 兩對特異引物分別為TaF3 :atgggaatttaaacctattccTaB3 :agcactctaattttctcaaagtTaFIP :acgctattggagctggaattacttttgagtatcaattggagggcaagTaBIP :agctcgtagttgaatttctgctgttttacaaagaaactccgtccg0本發(fā)明的鑒別診斷牛環(huán)形泰勒蟲的LAMP試劑盒，其特征是試劑盒內還有a) LAMP反應緩沖液；b) DNA 聚合酶；c)由40pmol的TaFIP和TaBIP，5pmol的TaF3和TaB3組成的牛環(huán)形泰勒蟲特異 引物混合物。本發(fā)明試劑盒的使用方法是從待檢牛只靜脈采血，提取血樣的基因組DNA，將此 基因組DNA與DNA聚合酶、反應緩沖液、滅菌超純水以及環(huán)形泰勒蟲特異引物混合物按比例 混合均勻，進行LAMP擴增，經擴增后立刻滅活，在擴增產物中加入1μ 1 SYBR Green I熒光 染料，若是陽性，則反應產物變?yōu)榫G色，否則為橙色，因此根據(jù)LAMP反應管中所發(fā)生顏色的 變化判斷被檢牛只是否感染有牛環(huán)形泰勒蟲。本發(fā)明實際上是一種利用環(huán)介導的恒溫擴增技術(LAMP)進行牛環(huán)形泰勒蟲檢測 的方法，這種方法是日本科學家Notomi T.等于2000年發(fā)明的、具有較高敏感性的DNA擴增 技術，參見Loop_mediated isotheral amplification method,LAMP Notomi,Τ. ,Okayama, H. , Masubuchi, H. , Yonekawa, Τ. , Watanabe, K. , Amino, N. , Hase, Τ. , 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. NucleicAcids Research 28，E63。本發(fā)明的試劑盒制 備方法簡單，而采用本發(fā)明的方法進行鑒別診斷牛環(huán)形泰勒蟲時，不需要復雜的儀器設備， 只需要常規(guī)的水浴鍋就可以完成檢測，而且可在普通的實驗室進行，經相關的試驗表明，本 發(fā)明提供的特異性引物具有極高的敏感性，其檢測過程快速，結果可靠，誤檢率低。


圖1為用本發(fā)明的試劑盒擴增后所得產物的電泳圖片，其中M泳道為標準 DNA (2000 :1)，1泳道為牛環(huán)形泰勒蟲，2泳道為牛瑟氏泰勒蟲，3泳道為牛中華泰勒蟲，4泳 道為牛巴貝斯蟲，5泳道為牛卵形巴貝斯蟲，6泳道為牛雙芽巴貝斯蟲，7泳道為牛大巴貝斯 蟲，8泳道為牛巴貝斯蟲未定種，9泳道為牛邊蟲陽性基因組DNA，10泳道為牛基因組DNA，11 泳道為滅菌超純水。
具體實施例方式以下提供本發(fā)明的一個具體實施方式
。(一 )感染牛環(huán)形泰勒蟲血液的獲得用液氮中保存的含蟲血液分別接種實驗動物，當染蟲率達到5%以上時，以20% 枸櫞酸鈉為抗凝劑，靜脈采血，將所采血液4°C條件下2500rpm離心10分鐘，棄去上清，盡量 將白細胞吸棄。用2%枸櫞酸鈉洗滌三次(同上2500rpm離心10分鐘)，最后將上清去掉， 紅細胞分裝入1. 5ml離心管中，-20°C保存。( 二 )泰勒蟲陰性牛血的獲得采集經血涂片檢查和PCR檢測陰性的牛的靜脈血，同上處理。(三)從血液中提取基因組的方法a)加 900 μ 1 BRC Cell Lysis Solution 于盛 300 μ 1 血液的 1. 5ml 離心管中，顛
倒10次，在室溫下放置到液體澄清透明。b)3000g離心3分鐘，棄上清，保留下面的可見的白色沉淀和大約10 20μ 1液 體，渦旋20秒。C)每管中加入 300μ1 Cell Lysis Solution，吹打混勻。d)力口入 100 μ 1 Protein Preciptation Solution。e)蝸旋20秒，至出現(xiàn)棕褐色沉淀顆粒。13000g離心3分鐘。將上清液移至新標 記的離心管中，加入300 μ 1異丙醇，顛倒50次·f) 13000g離心5分鐘。棄上清，在干凈的紙巾上放置，將剩余的液體吸干。g)加入300 μ 1 70%乙醇。13000g離心3分鐘，小心除去乙醇，在吸水紙上吸干剩 余液體。h)在 Speedcac 真空干燥。i)加入 100 μ 1 DNA Hydration Solution。j)4°C過夜或60°C溫育1小時。k)_20°C 保存?zhèn)溆谩?四)引入特異性引物，制備LAMP反應緩沖溶液1)特異引物牛環(huán)形泰勒蟲TaF3 :atgggaatttaaacctattccTaB3 :agcactctaattttctcaaagtTaFIP :acgctattggagctggaattacttttgagtatcaattggagggcaagTaBIP :agctcgtagttgaatttctgctgttttacaaagaaactccgtccg2)牛環(huán)形泰勒蟲特異性引物反應混合物(40pmol的TaFIP和TaBIP，5pmol的TaF3 和 TaB3)。3) 2 X LAMP 反應緩沖液(40mM Tris-HCl (pH 8. 8), 20mM KCl, 16mMMgS04, 20mM(NH4)2S04,0. 2% Tween 20，1· 6M betaine 和 2. 5mM dNTP)。4) Bst DNA 聚合酶(M0275L，BioLabs)。5)滅菌超純水6) SYBR Green I 熒光染料(Lot :738477，invitrogen)。
其具體的操作方法如下首先應用滅菌的超純水按照如下表比例配制無dNTP的2 X反應緩沖液儲存液。所 配制的儲存液可在4°C保存3個月，-20°C長期保存。
權利要求
一種鑒別診斷牛環(huán)形泰勒蟲的試劑盒，其特征是試劑盒內至少有兩對牛環(huán)形泰勒蟲特異引物，兩對特異引物分別為TaF3atgggaatttaaacctattccTaB3agcactctaattttctcaaagtTaFIPacgctattggagctggaattacttttgagtatcaattggagggcaagTaBIPagctcgtagttgaatttctgctgttttacaaagaaactccgtccg。
2.根據(jù)權利要求1所述的鑒別診斷牛環(huán)形泰勒蟲的試劑盒，其特征是試劑盒內還有a)LAMP反應緩沖液；b)DNA聚合酶；c)由40pmol的TaFIP和TaBIP，5pmol的TaF3和TaB3組成的牛環(huán)形泰勒蟲特異引物 混合物。d)SYBR Green I 熒光染料。
3.權利要求1或2所述的任一試劑盒的使用方法，其特征是從待檢牛只靜脈采血，提取 血樣的基因組DNA，將此基因組DNA與DNA聚合酶、反應緩沖液、滅菌超純水以及環(huán)形泰勒蟲 特異引物混合物按比例混合均勻，進行LAMP擴增，經擴增后立刻滅活，在擴增產物中加入 1 μ 1 SYBR Green I熒光染料，因此根據(jù)LAMP反應管中所發(fā)生顏色的變化判斷被檢牛只是 否感染有牛環(huán)形泰勒蟲。
全文摘要
本發(fā)明公開一種快速鑒別診斷被檢牛只是否感染環(huán)形泰勒蟲的檢測試劑盒，以及這種試劑盒的制備方法和使用方法。本發(fā)明的試劑盒內由至少兩對牛環(huán)形泰勒蟲特異引物構成，其使用方法是對提取血樣的基因組DNA與DNA聚合酶、反應緩沖液、滅菌超純水以及環(huán)形泰勒蟲特異引物混合物按比例混合均勻，進行LAMP擴增，經擴增后滅活，在擴增產物中加入熒光染料，根據(jù)LAMP反應管中所發(fā)生顏色的變化判斷被檢牛只是否感染有牛環(huán)形泰勒蟲。
文檔編號C12Q1/68GK101974639SQ201010542130
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月3日 優(yōu)先權日2010年11月3日
發(fā)明者關貴全, 劉軍龍, 劉志杰, 劉愛紅, 李有全, 殷宏, 牛慶麗, 羅建勛, 馬米玲 申請人:中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所