專利名稱：弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑，尤其是涉及一種采用膠體金免疫層析技術(immimochromatography)進行的弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條。
背景技術：
弓形蟲病(Toxoplasmosis)是剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種嚴重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病，其病原體弓形蟲可寄生在人及多種動物的有核細胞內，人群及動物普遍易感。該病廣泛分布于世界各地，據(jù)統(tǒng)計全球約有10億人被弓形蟲感染([1]奚琳琳，李威.弓形蟲致病機理，毒力及基因型研究進展[J].中國病原生物學雜志，2009,4(11) :859-861.)。弓形蟲病在我國分布很廣泛，全國各省、市、自治區(qū)均有弓形蟲感染的報道，我國正常人群平均感染率在4% 9%左右([2]劉敏，陳曉光.中國人群弓形蟲病的流行特征分析[J].寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報，2010，17(3) :131-134)，特殊人群如腫瘤患者、精神病患者、先天缺陷嬰幼兒、免疫抑制、免疫缺陷患者感染率更高。所幸的是極大多數(shù)免疫功能正常的成人或兒童被弓形蟲感染后常無癥狀或僅有輕微癥狀，且多能自愈并獲永久免疫力。但先天感染的胎兒、兒童以及免疫缺陷者被感染后，則預后極為嚴重。是造成艾滋病患者死亡的一個重要并發(fā)病。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者約有20% 80% 合并弓形蟲感染，更重要的是它也是造成人類先天畸形、缺陷、智力低下、死胎、早產的重要病原體之一。弓形蟲病的的診斷方法包括直接從臟器、血液、腦脊液等組織分離弓形蟲進行病原學診斷，需要幾天甚至幾周時間，費時費力，在實際應用中價值不大。臨床上常規(guī)檢測主要是應用各種血清學方法，檢測其特異IgG和IgM ([3]周彬，張玨，王柯，等.弓形蟲IgG和 IgM抗體雙標記時間分辨熒光免疫分析的建立及其初步臨床應用[J].中華檢驗醫(yī)學雜志， 2010,33(010) :957-959.),血清學方法可以診斷先天性、急性和慢性弓形蟲病，但由于大多數(shù)免疫缺陷的人或動物其抗弓形蟲的IgG滴度不會上升或不會出現(xiàn)高的IgM滴度，所以不能有效地用血清學方法對患有免疫缺陷的人或動物診斷弓形蟲病。另外，在抗原消失相當長時間后血清抗體滴度才會逐步下降，所以也不能應用于治療效果評價。目前檢測IgG抗體存在較高的假陽性，而IgM抗體檢測普遍靈敏度差等問題([4]韓靖云，劉倩，郭健.弓形蟲感染實驗室診斷的技術進展[J].檢驗醫(yī)學，2009，M (5) :393-395.)。因此，對疾病的早期診斷幫助不大，急需建立一種具有高度敏感性，且價廉、快速、操作簡單、不需特殊設備， 更適合于臨床的早期診斷方法。弓形蟲病的診斷與流行病學調查主要依賴于血清學試驗，正常人體感染弓形蟲多為隱性感染，當機體免疫力下降時，蟲體大量繁殖，侵入除紅細胞外的各組織細胞內寄生，造成各種組織的廣泛炎癥，從而出現(xiàn)臨床癥狀。人類感染弓形蟲后能誘導產生特異性抗體。感染早期IgM抗體增高，IgM在感染4個月后逐漸消失，在感染1個月后出現(xiàn)高濃度 IgG 抗體([5]KASPER D C, PRUSA A R, HAYDE Μ, et al. Evaluation of the vitroseciq immunodiagnostic system for detection of anti-toxoplasma immunoglobulin g and immunoglobulin m antibodies for confirmatory testing for acute toxoplasma gondii infection in pregnant women[J]. Journal of clinical microbiology,2009, 47(1) :164-168.)。因此，弓形蟲IgG抗體是弓形蟲病診斷和流行病學調查的一項重要指標。早期的血清學方法使用弓形蟲循環(huán)抗原。研究和診斷用的弓形蟲循環(huán)抗原是以弓形蟲感染小鼠腹腔獲得，這種方法花費大、獲得的抗原量少且不純(常混有宿主蛋白)， 因此假陽性也時有發(fā)生。隨著分子生物學技術的普及及弓形蟲抗原的相繼克隆，將重組抗原應用于弓形蟲實驗已經越來越多。目前研究比較多的弓形蟲的表面抗原(SAG1(P30)、 SAG2(P22)、SAG3(P43)、SAG4(P18))、蟲體棒狀體抗原(R0P1、R0P2)、致密顆粒蛋白(GRA1、 GRA7)等([6]熊美華，王秀珍，劉露霞，等.弓形蟲速殖子抗原的提取及蛋白分析[J].中國寄生蟲病防治雜志，2001，14(3) :237-238.)。采用重組DNA技術制備的重組抗原可以克服完整弓形蟲抗原的缺點，能快速、經濟地制備無限量特異重組弓形蟲抗原。弓形蟲抗體檢測方法包括ELISA、Western-blot等，其特異性均較高。然而，面對嚴峻的防制形式，不但需要特異準確的檢測手段，還需要一種更簡便快捷的試劑來篩查，以便為臨床和疾病防控提供對策。
發(fā)明內容本實用新型的目的是提供一種弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條。本實用新型設有第1試劑條和第2試劑條；所述第1試劑條設有第1載體板、第1加樣墊、第1膠體金墊、第1硝酸纖維膜(NC 膜)、弓形蟲IgM抗體檢測線、第1對照線和第1吸收墊；第1加樣墊、第1膠體金墊、第1硝酸纖維膜和第1吸收墊依次粘貼在第1載體板上表面，第1加樣墊的一端設在第1膠體金墊的一端上，第1膠體金墊的另一端設在第1硝酸纖維膜的一端上，第1吸收墊的一端設在第1硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgM抗體檢測線和第1對照線依次設在第1硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在第1對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2和GRA7的IgG抗體；所述第2試劑條設有第2載體板、第2加樣墊、第2膠體金墊、第2硝酸纖維膜(NC 膜)、總抗體檢測線、第2對照線和第2吸收墊；第2加樣墊、第2膠體金墊、第2硝酸纖維膜和第2吸收墊依次粘貼在第2載體板上表面，第2加樣墊的一端設在第2膠體金墊的一端上，第2膠體金墊的另一端設在第2硝酸纖維膜的一端上，第2吸收墊的一端設在第2硝酸纖維膜的另一端上，總抗體檢測線和第2對照線依次設在第2硝酸纖維膜上；在總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在第2對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (P22)、 R0P2和GRA7的IgG抗體。所述第1試劑條的第1加樣墊與第2試劑條的第2加樣墊之間可用玻璃纖維膜連接，再放入試劑盒中(稱單孔加樣)，也可以不經玻璃纖維膜連接或搭橋(稱雙孔加樣)。所述第1載體板和第2載體板可采用PVC板。以下給出本實用新型的制備方法1)制備弓形蟲重組抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7
4[0015]采用基因克隆技術，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7 ；2)硝酸纖維素膜的點樣在弓形蟲IgM抗體檢測線上包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在第1試劑條和第2試劑條的對照線處分別包被羊抗弓形蟲抗原 SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體，晾干；3)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)膠體金與 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 的標記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)的標記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調至 pH5. 4，加 100 μ g SAG1(P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1ml，得膠體金標記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記方法與步驟(1)相同， 分別得膠體金標記的SAG2(P2》、R0P2和GRA7抗原；所述抗人Ig單克隆抗體的濃度可為 1 ％ig/mL，抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度可為1 ％ig/mL，羊抗弓形蟲抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體由抗 SAGl (P30)抗體、抗 SAG2 (P22)抗體、抗R0P2抗體和GRA7抗體按體積比1 :1:1: 1混合，其終濃度為1 ％ig/mL ；三者點樣量為1 μ L/cm。(3)將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的 R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；所述檸檬酸三鈉的百分比濃度為2%。所述將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合，最適膠體金標記的膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合體積比為1 (0. 2 5) (0. 2 5) (0. 2 5)混合；所述烘干的溫度可為37°C。5)制備免疫層析檢測條第1試劑條設有第1載體板、第1加樣墊、第1膠體金墊、第1硝酸纖維膜(NC膜)、 弓形蟲IgM抗體檢測線、第1對照線和第1吸收墊 ’第1加樣墊、第1膠體金墊、第1硝酸纖維膜和第1吸收墊依次粘貼在第1載體板上表面，第1加樣墊的一端設在第1膠體金墊的一端上，第1膠體金墊的另一端設在第1硝酸纖維膜的一端上，第1吸收墊的一端設在第1 硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgM抗體檢測線和第1對照線依次設在第1硝酸纖維膜上； 在弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在第1對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條的第1試劑條；將第2試劑條設有第2載體板、第2加樣墊、第2膠體金墊、第2硝酸纖維膜(NC膜)、總抗體檢測線、第2對照線和第2吸收墊 ’第2加樣墊、第2膠體金墊、第2硝酸纖維膜和第2吸收墊依次粘貼在第2載體板上表面，第2加樣墊的一端設在第2膠體金墊的一端上，第2膠體金墊的另一端設在第2硝酸纖維膜的一端上，第2吸收墊的一端設在第2硝酸纖維膜的另一端上，總抗體檢測線和第2對照線依次設在第2硝酸纖維膜上；在總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在第2對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、 R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條的第2試劑條。在第1加樣墊和第2加樣墊上可用連接膜(可采用玻璃纖維膜)將第1試劑條和第2試劑條連接(稱單孔加樣)，也可以不經連接膜連接或搭橋(稱雙孔加樣)，可將弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條放入盒內，做成檢測卡，與干燥劑一起裝入鋁箔袋中， 機器封口，密封保存。本實用新型提供了一種采用膠體金免疫層析技術建立弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合快速檢測試劑，可用于全血、血清、血漿及腦脊液等標本中弓形蟲IgM抗體和總抗體的檢測。檢測時所需的標本量極小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。

圖1為本實用新型實施例的結構組成示意圖。在圖1中，A為第1試劑條，B為第 2試劑條，1為連接膜(可采玻璃纖維膜)。圖2為本實用新型實施例的單孔加樣組裝示意圖。在圖2中，A為第1試劑條，B 為第2試劑條。圖3為本實用新型實施例的雙孔加樣組裝示意圖。在圖3中，A為第1試劑條，B 為第2試劑條。圖4為實驗結果模式示意圖。在圖3中，(1)為使用前的示意圖，(2) (4)為無效試驗(產品質量問題)，(5)為弓形蟲總抗體，IgM抗體陽性，(6)為弓形蟲總抗體陽性， IgM抗體陰性；A為第1試劑條，B為第2試劑條；T為檢測線，C為對照線。
具體實施方式
以下實施例將結合附圖對本實用新型作進一步的說明。參見圖1 3，本實用新型實施例設有第1試劑條A和第2試劑條B ；第1試劑條A設有第1載體板Al、第1加樣墊A2、第1膠體金墊A3、第1硝酸纖維膜(NC膜)A4、弓形蟲IgM抗體檢測線A6、第1對照線A7和第1吸收墊A8 ；第1加樣墊A2、 第1膠體金墊A3、第1硝酸纖維膜A4和第1吸收墊A8依次粘貼在第1載體板Al上表面， 第1加樣墊A2的一端設在第1膠體金墊A3的一端上，第1膠體金墊A3的另一端設在第1 硝酸纖維膜A4的一端上，第1吸收墊A8的一端設在第1硝酸纖維膜A4的另一端上，弓形蟲IgM抗體檢測線A6和第1對照線A7依次設在第1硝酸纖維膜A4上；在弓形蟲IgM抗體檢測線A6處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在第1對照線Α7處包被羊抗弓形蟲抗原 SAGl (Ρ30)、SAG2 (Ρ22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體。第2試劑條B設有第2載體板Bi、第2加樣墊Β2、第2膠體金墊Β3、第2硝酸纖維膜(NC膜)B4、總抗體檢測線B6、第2對照線B7和第2吸收墊B8 ；第2加樣墊B2、第2膠體金墊B3、第2硝酸纖維膜B4和第2吸收墊B8依次粘貼在第2載體板Bl上表面，第2加樣墊B2的一端設在第2膠體金墊B3的一端上，第2膠體金墊B3的另一端設在第2硝酸纖維膜B4的一端上，第2吸收墊B8的一端設在第2硝酸纖維膜B4的另一端上，總抗體檢測線B6和第2對照線B7依次設在第2硝酸纖維膜B4上；在總抗體檢測線B6處包被抗人Ig 單克隆抗體，在第2對照線B7處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7 的IgG抗體。第1試劑條A的第1加樣墊A2與第2試劑條B的第2加樣墊B2之間可用連接膜 (可采用玻璃纖維膜)連接，再放入試劑盒中(稱單孔加樣)，也可以不經連接膜連接或搭橋(稱雙孔加樣)。所述第1載體板Al和第2載體板Bl可采用PVC板。以下給出本實用新型的制備方法1)制備弓形蟲重組抗原 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7采用基因克隆技術，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7。2)硝酸纖維素膜的點樣在弓形蟲IgM抗體檢測線上包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，晾干，所述抗人Ig單克隆抗體的濃度可為1 ^ig/mL， 抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度可為1 -g/mL，羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 的 IgG 抗體由抗 SAGl (P30)抗體、抗 SAG2 (P22)抗體、抗 R0P2 抗體和GRA7抗體按體積比1 :1:1: 1混合，其終濃度為l ^ig/mL;三者點樣量為IyL/ cm03)制備膠體金采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1 %氯金酸ImL加入到IOOmL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01%，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入檸檬酸三鈉水溶液2. OmL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4°C冰箱保存?zhèn)溆茫鰴幟仕崛c的濃度可為2%。4)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記(1)膠體金與弓形蟲抗原SAGl (P30)的標記取膠體金10ml，用0. lmol/L NaOH調至 pH5. 4，加 100 μ g SAG1(P30)，混勻，放置 5min，加入 5% BSA Iml 混勻，4°C、10000r/min 離心lh，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4°C、10000r/min離心lh，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1ml，得膠體金標記的SAGl (P30)抗原；(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的標記方法與步驟(1)相同， 分別得膠體金標記的SAG2 (P22)、R0P2和GRA7抗原；(3)將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的 R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；所述將膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2(P2》、膠體金標記的R0P2 抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合，最適膠體金標記的膠體金標記的SAGl (P30)抗原、膠體金標記的SAG2 (P22)、膠體金標記的R0P2抗原和膠體金標記的GRA7抗原混合體積比為1 (0. 2 5) (0. 2 5) (0. 2 5)混合；所述烘干的溫度可為37°C。5)制備免疫層析檢測條第1試劑條設有第1載體板、第1加樣墊、第1膠體金墊、第1硝酸纖維膜(NC膜)、 弓形蟲IgM抗體檢測線、第1對照線和第1吸收墊 ’第1加樣墊、第1膠體金墊、第1硝酸纖維膜和第1吸收墊依次粘貼在第1載體板上表面，第1加樣墊的一端設在第1膠體金墊的一端上，第1膠體金墊的另一端設在第1硝酸纖維膜的一端上，第1吸收墊的一端設在第1 硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgM抗體檢測線和第1對照線依次設在第1硝酸纖維膜上； 在弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在第1對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條的第1試劑條；將第2試劑條設有第2載體板、第2加樣墊、第2膠體金墊、第2硝酸纖維膜(NC 膜)、總抗體檢測線、第2對照線和第2吸收墊；第2加樣墊、第2膠體金墊、第2硝酸纖維膜和第2吸收墊依次粘貼在第2載體板上表面，第2加樣墊的一端設在第2膠體金墊的一端上，第2膠體金墊的另一端設在第2硝酸纖維膜的一端上，第2吸收墊的一端設在第2硝酸纖維膜的另一端上，總抗體檢測線和第2對照線依次設在第2硝酸纖維膜上；在總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在第2對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、 R0P2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條的第2試劑條。再用連接膜(可采用玻璃纖維膜)在第1加樣墊和第2加樣墊處將第1試劑條和第2試劑條連接(稱單孔加樣)，也可以不經連接膜連接或搭橋(稱雙孔加樣)，可將弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條放入盒內，做成檢測卡，與干燥劑一起裝入鋁箔袋中， 機器封口，密封保存。以下給出免疫層析法檢測患者的臨床標本取稀釋待檢標本(全血、血清、血漿、腦脊液)120 μ L，加樣于免疫層析檢測條樣品處(單孔加樣)，靜置20min觀察結果；或各取稀釋待檢標本(全血、血清、血漿、腦脊液)60 μ L，加樣于弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條樣品處，靜置20min觀察結果。 只在兩條弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條對照區(qū)各有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在兩弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條的檢測區(qū)T及對照區(qū)C均有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)和對照區(qū)均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無效結果 (見圖4)。其中，待檢標本(全血、血清、血漿、腦脊液)稀釋液采用生理鹽水，稀釋倍數(shù)0 50倍。以下給出弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條性能檢定1)外觀檢查白色包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標本符合率用弓形蟲IgM和弓形蟲總抗體陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用采用弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條檢定，計算陽性符合率。陽性參比血清為采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比血清檢定，計算陰性符合率。弓形蟲IgM和弓形蟲總抗體的陰性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。[0060]4)靈敏度檢測用衛(wèi)生部室內質控血清檢測，最低檢出限度應小于或等于4NCU/
mLo5)批內差異同一批次弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。6)批間差異不同批次弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。7)干擾試驗檢測結果不受標本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。血清(或血漿)來自本申請人臨床標本。8)交叉反應采用弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(n = 30)、類風濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測，未發(fā)現(xiàn)交叉反應。自身免疫系統(tǒng)疾病的血清來自本申請人臨床確診患者。9)穩(wěn)定性檢測應用Arrhenius法則，將弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個月。以下給出具體實施例。實施例1第1試劑條A在硝酸纖維素膜(NC膜)IgM檢測線上包被抗人IgM特異性片段μ 鏈單克隆抗體，第2試劑條B的總抗體檢測線上包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處C包被羊抗弓形蟲抗原SAGl (Ρ30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7的抗體，室溫晾干，密封室溫保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?，抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體、抗人Ig單克隆抗體的濃度為lmg/mL，羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7) IgG抗體由羊抗弓形蟲抗原(SAG1 (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7) IgG 抗體由抗 SAGl (P30) -IgG 抗體、抗 SAG2 (P22) -IgG 抗體、抗 R0P2-IgG抗體和抗GRA7-IgG抗體按體積比1 :1:1: 1混合，其終濃度為lmg/mL ；三者點樣量為1 μ L/cm。將已純化的金標記的弓形蟲重組抗原SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2和GRA7以體積比1 1 1 1混合后，均勻地涂于玻璃纖維紙上，在37°c烘干，制備成金膠體墊，密封備用。將固相化的纖維膜與膠體金結合的玻璃纖維、吸水紙等按一定順序，通過PVC不干膠底板組合在一起，用切條機切成一定寬度檢測條。再用玻璃纖維紙在加樣墊處將第1試劑條和第2試劑條連接?；驅⒌?試劑條和第2試劑條放入相應規(guī)格的塑料盒內，做成檢測卡。 把弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條或檢測試劑盒與干燥劑一起裝入鋁箔袋中，機器封口，密封保存。取1 10稀釋的待檢標本血清120yL，加樣于弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條加樣區(qū)，靜置20min觀察結果。只在弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條對照區(qū)有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陰性；在檢測區(qū)及對照區(qū)均有一紫紅色條帶出現(xiàn)，則判為陽性；加樣檢測后，檢測區(qū)T和對照區(qū)C均不出現(xiàn)紫紅色條帶，為無效結果。(參見圖4)實施例2與實施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊、弓形蟲總抗體檢測線僅由SAGl (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 組成，不含有 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7。結果判斷與實施例1相同。[0073]實施例3與實施例1相似，區(qū)別在于金膠體墊、弓形蟲總抗體檢測線僅由SAGl (P30)、 SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7 組成，不含有 SAGl (P30)、SAG2 (P22)、R0P2 和 GRA7。結果判斷與實施例1相同。實施例4與實施例1相似，區(qū)別在于待檢標本為腦脊液標本，結果判斷與實施例1相同。實施例4性能驗證試驗按實施例1的方案制備弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合快速檢測試劑條，然后進行性能驗證。1)外觀檢查白色包被反應膜平整、干凈無污染斑點、無裂縫，膠帶無開膠，弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合快速檢測試劑條寬度在3士0. 1mm，無切斜現(xiàn)象。2)陽性標本符合率用弓形蟲IgM和弓形蟲總抗體陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份采用采用弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條檢定，計算陽性符合率。陽性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比血清檢定，計算陽性符合率。弓形蟲IgM和弓形蟲總抗體的陰性參比血清的確定采用ELISA(進口試劑)法確定的臨床標本。4)靈敏度檢測用衛(wèi)生部室內質控血清檢測，最低檢出限度應小于或等于4NCU/
mLo5)批內差異同一批次弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。6)批間差異不同批次弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，用特征性血清檢測，要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。7)干擾試驗檢測結果不受標本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的干擾。血清(或血漿)來自本申請人臨床標本。8)交叉反應采用弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，進行系統(tǒng)性紅斑狼瘡(n = 30)、類風濕病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統(tǒng)疾病的檢測，未發(fā)現(xiàn)交叉反應。自身免疫系統(tǒng)疾病的血清來自本申請人臨床確診患者。9)穩(wěn)定性檢測應用Arrhenius法則，將弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條放置37°C 20天后檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫干燥條件下保存，有效期為18個月。
權利要求1.弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，其特征在于設有第1試劑條和第2試劑條；第1試劑條設有第1載體板、第1加樣墊、第1膠體金墊、第1硝酸纖維膜、弓形蟲IgM 抗體檢測線、第1對照線和第1吸收墊；第1加樣墊、第1膠體金墊、第1硝酸纖維膜和第1 吸收墊依次粘貼在第1載體板上表面，第1加樣墊的一端設在第1膠體金墊的一端上，第1 膠體金墊的另一端設在第1硝酸纖維膜的一端上，第1吸收墊的一端設在第1硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgM抗體檢測線和第1對照線依次設在第1硝酸纖維膜上；第2試劑條設有第2載體板、第2加樣墊、第2膠體金墊、第2硝酸纖維膜、總抗體檢測線、第2對照線和第2吸收墊；第2加樣墊、第2膠體金墊、第2硝酸纖維膜和第2吸收墊依次粘貼在第2載體板上表面，第2加樣墊的一端設在第2膠體金墊的一端上，第2膠體金墊的另一端設在第2硝酸纖維膜的一端上，第2吸收墊的一端設在第2硝酸纖維膜的另一端上，總抗體檢測線和第2對照線依次設在第2硝酸纖維膜上。
2.如權利要求1所述的弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，其特征在于第1試劑條的第1加樣墊與第2試劑條的第2加樣墊之間用玻璃纖維膜連接。
3.如權利要求1所述的弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，其特征在于所述第 1載體板和第2載體板為PVC板。
專利摘要弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑條，涉及弓形蟲IgM抗體與總抗體聯(lián)合檢測試劑。設2條試劑條，2條試劑條均設載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、對照線和吸收墊；2條試劑條設弓形蟲IgM抗體檢測線和總抗體檢測線。制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；硝酸纖維素膜的點樣；制備膠體金；膠體金與SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的標記；制備免疫層析檢測條。用于全血、血清、血漿及腦脊液標本中弓形蟲IgM抗體和總抗體的檢測。檢測時標本量極小，不需特殊儀器，肉眼直接判讀，簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。
文檔編號G01N33/577GK202256347SQ201120352360
公開日2012年5月30日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權日2011年9月19日
發(fā)明者劉莉莉, 張忠英, 張長弓, 楊天賜, 林麗蓉 申請人:廈門大學附屬中山醫(yī)院