專利名稱:一種奶牛乳腺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法,具體地說(shuō),本發(fā)明涉及一種奶牛乳腺細(xì) 胞體外分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù):
乳腺是復(fù)管泡狀皮膚腺,乳腺上皮具有特殊的乳汁分泌功能,乳汁的許多成 分只有乳腺上皮細(xì)胞才能夠合成,因此進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)是研究乳腺 功能及其調(diào)控的重要手段之一。乳腺細(xì)胞培養(yǎng)已有半個(gè)世紀(jì)的歷史,自 Lasfargues (1957)利用膠原酶消化法將乳腺細(xì)胞從乳腺組織中分離出來(lái),眾多 科學(xué)家開(kāi)展了廣泛研究。
體外細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)是使細(xì)胞生命活動(dòng)的主要方面在體外得以再現(xiàn)的一 種基本方法,自創(chuàng)立以來(lái)幾乎被應(yīng)用到生物和醫(yī)學(xué)等研究的各個(gè)領(lǐng)域。目前的細(xì) 胞培養(yǎng)方法主要是利用成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶敏感性的不同及貼壁 時(shí)間的差異,可將其純化,最終能夠得到相應(yīng)的細(xì)胞系。其不足之處是不同動(dòng)物 種類的乳腺細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶敏感性不同,因此確定最佳胰蛋白酶濃度分離培養(yǎng)奶 牛乳腺上皮細(xì)胞是改進(jìn)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn),提供一種分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞 時(shí)最佳胰蛋白酶濃度,且較好地將奶牛乳腺纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分離,并得到奶 牛乳腺細(xì)胞系的一種奶牛乳腺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。
一種奶牛乳腺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法,可采取自當(dāng)?shù)赝涝讖S當(dāng)日屠宰的奶牛
乳腺組織,利用成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶敏感性的不同及貼壁時(shí)間的差
異,采用組織塊培養(yǎng)法和胰蛋白酶分級(jí)消化法相結(jié)合,使用0.05 0.07%胰蛋
白酶/EDTA分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞,將奶牛乳腺細(xì)胞純化,經(jīng)角蛋白18鑒
定后,最終得到相應(yīng)的奶牛乳腺細(xì)胞系。
所述聘蛋白酶最佳濃度為使用0. 06X胰蛋白酶/EDTA分離培養(yǎng)奶牛乳腺上 皮細(xì)胞。
本發(fā)明的有益效果是提供了一種分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞時(shí)最佳胰蛋白 酶濃度,且較好地將奶牛乳腺纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分離,并得到奶牛乳腺細(xì)胞系。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式
的實(shí)際操作步驟對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。
(1) 奶牛乳腺組織原代培養(yǎng)
取本地當(dāng)日屠宰的健康黑白花奶牛乳腺組織,置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。乳腺 組織經(jīng)75%酒精浸泡消毒,在超凈工作臺(tái)中將乳腺組織塊移入加有細(xì)胞培養(yǎng)液的 平皿中,剪成直徑約3mm的小塊,用吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)洗滌,用眼科剪和眼科 鑷盡量分離結(jié)締組織和脂肪組織,然后剪成直徑約lmm的小塊,接入培養(yǎng)皿內(nèi), 每小塊間距0.5cm左右。為防止組織塊干燥,培養(yǎng)皿中央加入2滴細(xì)胞生長(zhǎng)液。將 培養(yǎng)皿置于37。C, 5%(302飽和濕度培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)4h后取出,輕輕加入3mL細(xì)胞 培養(yǎng)液,置于37'C, 5XC02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2d換液l次培養(yǎng)液。
(2) 細(xì)胞傳代及上皮細(xì)胞的純化
待細(xì)胞生長(zhǎng)至80% 90%匯合時(shí),剔除組織塊,使用0.06X胰蛋白酶/EDTA 和37t!條件下消化,倒置顯微鏡下觀察,在成纖維細(xì)胞變圓后即中止消化,輕輕 吹吸幾次后,吸出消化液,離心再用PBS洗3遍,然后在培養(yǎng)物中加入O. 15%胰蛋 白酶/EDTA, 37。C條件下繼續(xù)消化,在倒置顯微鏡下觀察,待上皮細(xì)胞變圓脫壁 后,終止消化,輕輕吹打,制成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)、稀釋、接種于其它平皿中繼續(xù) 培養(yǎng),每2d換液一次。
(3) 奶牛乳腺上皮細(xì)胞凍存和解凍復(fù)蘇培養(yǎng)
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,經(jīng)O. 15X胰蛋白酶/EDTA, 37'C條件下消化制成細(xì)胞懸液, 1000rpm離心5min,收集細(xì)胞;用冷凍保護(hù)液(20%FBS、 10XDMSO的DMEM/F12 培養(yǎng)液)調(diào)整細(xì)胞數(shù)至lXl()6細(xì)胞lmL,每個(gè)冷凍管中分裝lmL,室溫平衡5min, 4°C40min, _20°(:冰箱過(guò)夜,然后放入液氮罐中長(zhǎng)期保存。從液氮罐中取出凍存 管,在37。C的水浴中保溫l 2min,使其完全融化。加入5mL培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞, 1000rpm離心5min,收集細(xì)胞;再加入5mL培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,將其接種于細(xì)胞培養(yǎng) 皿中,于37。C和5XC02,在飽和濕度條件下培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至約70% 80%匯 合度,傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1、一種奶牛乳腺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法,其特征在于直接采取自當(dāng)?shù)赝涝讖S當(dāng)日屠宰的奶牛乳腺組織,采用組織塊培養(yǎng)法和胰蛋白酶分級(jí)消化法相結(jié)合,使用0.05~0.07%胰蛋白酶/EDTA分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述奶牛乳腺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法,其特征在于使 用0. 06X胰蛋白酶/EDTA分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種奶牛乳腺細(xì)胞體外分離培養(yǎng)方法,它涉及細(xì)胞體外分離培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域,它解決了分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞時(shí)不能將奶牛乳腺纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞很好分離的問(wèn)題。通過(guò)直接采取自當(dāng)?shù)赝涝讖S當(dāng)日屠宰的奶牛乳腺組織,利用成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶敏感性的不同及貼壁時(shí)間的差異,采用組織塊培養(yǎng)法和胰蛋白酶分級(jí)消化法分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞,將奶牛乳腺細(xì)胞純化,經(jīng)角蛋白18鑒定后,最終得到相應(yīng)的細(xì)胞系。本發(fā)明提供了一種分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞時(shí)最佳胰蛋白酶濃度,且較好地將奶牛乳腺纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分離。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101302494SQ20081005085
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者劉春龍, 孫海霞, 李忠秋, 李長(zhǎng)勝 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所