技術領域：
本發(fā)明總體涉及參與肺癌的蛋白質和基因(例如，人肺癌)，以及肺癌的檢測、診斷和治療。
背景技術：
：許多癌癥的特征在于導致細胞過程(包括生長和增殖)的控制異常的細胞信號傳遞途徑的破壞。這些破壞經常是由于特定的信號傳遞蛋白諸如激酶的活性改變引起的。蛋白激酶蛋白的異常表達可以是癌癥的病原因素(和驅動因素)。異常表達可以由蛋白(或其激酶部分)與第二種蛋白(或其部分)的融合、蛋白的截短部分的表達或者由全長蛋白的表達的異常調節(jié)所引起。已知導致產生具有異常信號傳遞活性的激酶融合蛋白的基因易位可以直接導致某些癌癥(參見例如，Mitelman等人，NatureReviewsCancer7:233–245,2007,Futreal等人，NatRevCancer4(3):177–183(2004),和Falini等人，Blood99(2):409-426(2002)。例如，BCR-ABL癌蛋白，一種酪氨酸激酶融合蛋白，是病原因素且驅動人慢性髓性白血病(CML)。在至少90-95％的CML病例中發(fā)現的BCR-ABL癌蛋白是通過9號染色體上的c-ABL蛋白酪氨酸激酶的基因序列易位到22號染色體上的BCR序列上產生的，產生所謂的Philadelphia染色體。參見例如Kurzock等人，N.Engl.J.Med.319:990-998(1988)。在急性淋巴性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)病例中也能發(fā)現易位。這些發(fā)現促使FDA批準甲磺酸伊馬替尼(由Novartis以商標Gleevec?銷售)和dasatinig(由Bristol-MysersSquibb以商標Sprycel?銷售)(ABL激酶的小分子抑制劑)用于治療CML和ALL。這些藥物是設計用來對驅動腫瘤細胞生長的信號傳遞通路進行干擾的藥物實例。這些藥物的開發(fā)相對于CML和ALL的常規(guī)療法(化療和放射)而言代表一種顯著的進步，其中常規(guī)療法受到眾所周知的副作用的煩擾并且經常具有有限的效果，因為它們不能特異性地靶向癌癥的根本原因。因此，鑒定驅動癌癥的蛋白以便在癌癥更可能對治療響應的早期檢測癌癥將是有用的。額外地，此類蛋白的鑒定將尤其期望產生新方法來選擇用于靶向治療的患者，以及用于篩選和開發(fā)能抑制此類蛋白且因此治療癌癥的新藥物。受體酪氨酸激酶(RTKs)的致癌作用已牽涉在許多類型的實體瘤(包括肺癌)中。肺癌(其具有幾種亞型，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌)是全世界男性和女性中由癌癥導致的死亡的最常見原因。根據美國國家癌癥研究所的數據，在美國每14名男性和女性中接近一名將在其人生的某個點被診斷出肺癌。肺癌的兩種特別致命的形式是小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌。不幸的是，肺癌經常無法在早期被診斷，并且它經常完全不能對手術響應，甚至當與化療或放療組合時。例如，在美國，NSCLC是癌癥死亡的主要原因，并且占所有肺癌的約87％。在美國每年有約151,000個NSCLC新病例，并且據估計僅在美國每年超過120,000位患者將死于該疾病。參見“CancerFactsandFigures2005,”AmericanCancerSociety。包括三種不同亞型的NSCLC經常僅在它已經轉移以后被檢測到，因此在診斷的兩年內死亡率是75％。因此，發(fā)現在早期鑒定肺癌的新方法和治療肺癌的新方法(和新試劑)將是有用的。技術實現要素：本發(fā)明基于發(fā)現癌癥、特別是肺癌中異常ROS表達和/或活性。哺乳動物肺癌中ROS的異常表達可能是由于，例如，哺乳動物肺癌中全長ROS激酶的表達，因為健康、正常肺組織和細胞不表達ROS激酶蛋白或ROS激酶活性。哺乳動物肺癌中ROS的異常表達也可能是由于截短ROS(例如，包含ROS激酶的一部分，包括激酶結構域)或本文公開的ROS融合蛋白之一的存在。肺癌中所有公開的ROS的表達導致ROS激酶結構域的表達；因此，所有公開的ROS融合多肽具有活性ROS激酶活性。因此，在第一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。該方法包括以下步驟：獲得來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品；并且利用至少一種特異性結合具有ROS激酶活性的所述多肽的試劑來確定所述多肽是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在所述多肽。在另一個實施方案中，所述試劑是抗體。在一些實施方案中，所述試劑(例如抗體)是可檢測地標記的。在另一個實施方案中，所述試劑特異性結合全長ROS多肽。在另一個實施方案中，所述試劑特異性結合ROS激酶結構域。在另一個實施方案中，所述試劑特異性結合ROS融合多肽(例如，特異性結合CD74-ROS融合多肽、SLC34A2-ROS(S)多肽、SLC34A2-ROS(L)多肽、SLC34A2-ROS(VS)多肽、FIG-ROS(L)多肽、FIG-ROS(S)多肽、或FIG-ROS(VL)多肽。在本發(fā)明方法的各個實施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是全長ROS多肽。在另一個實施方案中，所述多肽是ROS融合多肽。在另一個實施方案中，所述ROS融合多肽選自CD74-ROS融合多肽、SLC34A2-ROS(S)多肽、SLC34A2-ROS(L)多肽、SLC34A2-ROS(VS)多肽、FIG-ROS(L)多肽、FIG-ROS(S)多肽、和FIG-ROS(VL)多肽。在各個實施方案中，具有ROS激酶活性的多肽包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:61、SEQIDNO:58、SEQIDNO:56、SEQIDNO:60、SEQIDNO:28、SEQIDNO:7、SEQIDNO:5或SEQIDNO:22的氨基酸序列。在一些實施方案中，以選自流式細胞術測定、體外激酶測定、免疫組織化學(IHC)測定、免疫熒光(IF)測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和Western印跡分析測定的形式實施所述方法。在一個實施方案中，檢測到所述多肽的激酶活性。在另一個實施方案中，所述試劑是重同位素標記(AQUA)肽。在另一個實施方案中，所述重同位素標記(AQUA)肽包含含有ROS融合多肽的融合連接的氨基酸序列。在另一個實施方案中，使用質譜分析法實施所述方法。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測編碼生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。該方法包括以下步驟：(a)獲得來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品并且(b)利用特異性結合編碼具有ROS激酶活性的所述多肽的所述多核苷酸的試劑來確定所述多核苷酸是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在編碼具有ROS激酶活性的所述多肽的所述多核苷酸。在一些實施方案中，多核苷酸包含選自SEQIDNO:2、6、8、23、29、55、57和59的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述試劑是核酸探針。在一些實施方案中，所述試劑是可檢測地標記的。在另一個實施方案中，核酸探針是熒光原位雜交(FISH)探針且用FISH測定實施所述方法。在另一個實施方案中，核酸探針是聚合酶鏈式反應(PCR)探針且用PCR測定實施所述方法。在進一步的實施方案中，所述試劑是可檢測地標記的。在本發(fā)明方法的各個實施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是全長ROS多肽。在另一個實施方案中，多肽是ROS融合多肽。在另一個實施方案中，所述ROS融合多肽選自CD74-ROS融合多肽、SLC34A2-ROS(S)多肽、SLC34A2-ROS(L)多肽、SLC34A2-ROS(VS)多肽、FIG-ROS(L)多肽、FIG-ROS(S)多肽、和FIG-ROS(VL)多肽。在各個實施方案中，具有ROS激酶活性的多肽包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:61、SEQIDNO:58、SEQIDNO:56、SEQIDNO:60、SEQIDNO:28、SEQIDNO:7、SEQIDNO:5或SEQIDNO:22的氨基酸序列。在本發(fā)明方法的各個實施方案中，肺癌是人肺癌(例如，非小細胞肺癌或小細胞肺癌)。在進一步的實施方案中，生物樣品選自肺活檢樣品、支氣管肺泡灌洗物、腫瘤切除樣品、細針穿刺物、胸膜滲出液和循環(huán)腫瘤細胞。在本發(fā)明方法的各個實施方案中，哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌是非小細胞肺癌。在各個實施方案中，哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌來自人。在本發(fā)明方法的各個實施方案中，生物樣品被診斷為來自由ROS激酶活性驅動的哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。在一些實施方案中，哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌可能對ROS抑制性治療劑響應。在各個實施方案中，由其獲得所述生物樣品(其中所述試劑特異性結合所述生物樣品)的患者被診斷為患有由ROS激酶活性驅動的哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。在一些實施方案中，患者被診斷為可能對ROS抑制性治療劑響應。ROS抑制性治療劑的一個非限制性實例為克里唑替尼(也稱為PF-02341066)。ROS抑制性治療劑的額外的非限制性實例包括NVTTAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CH5424802、CEP11988、WHI-P131和WHI-P154。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于抑制表達具有ROS激酶活性的多肽的哺乳動物癌癥或疑似哺乳動物癌癥進展的方法，所述方法包括在所述哺乳動物癌癥或疑似哺乳動物癌癥中抑制所述多肽的表達和/或活性的步驟。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于抑制包括編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的哺乳動物癌癥或疑似哺乳動物癌癥進展的方法，所述方法包括在所述哺乳動物癌癥或疑似哺乳動物癌癥中抑制所述多核苷酸的表達的步驟。在各個實施方案中，肺癌或疑似肺癌來自人。在一些實施方案中，所述多肽或多核苷酸的表達和/或活性被ROS抑制性治療劑所抑制，所述ROS抑制性治療劑選自PF-02341066、NVTTAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、CH5424802、WHI-P131和WHI-P154。在又另一個方面，本發(fā)明提供了將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者的方法，所述方法包括：將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合具有ROS激酶活性的多肽的試劑接觸，檢測所述試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑒定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者。在又另一個方面，本發(fā)明提供了治療患有肺癌的患者的方法，所述方法包括：檢測生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在，所述生物樣品來自患有或疑似患有肺癌的患者的肺；并且給患者施用治療有效量的ROS抑制性治療劑，從而治療受試者的肺癌。在又另一個方面，本發(fā)明提供了治療患有肺癌的患者的方法，所述方法包括：檢測來自患有或疑似患有肺癌的患者的肺的生物樣品中多肽的存在，所述多肽選自具有ROS激酶活性的多肽和具有ALK激酶活性的多肽；并且給患者施用治療有效量的ALK/ROS抑制性治療劑，從而治療受試者的肺癌。在一個進一步方面，本發(fā)明提供了用于將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者的方法，所述方法包括：將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合具有ROS激酶活性的多肽的第一試劑和特異性結合具有ALK激酶活性的多肽的第二試劑接觸，并且檢測所述第一試劑或所述第二試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述第一試劑或所述第二試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑒定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者。在一個進一步方面，本發(fā)明提供了用于將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對ALK-抑制性治療劑響應的患者的方法，所述方法包括：將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合具有ROS激酶活性的多肽的第一試劑和特異性結合具有ALK激酶活性的多肽的第二試劑接觸，并且檢測所述第一試劑或所述第二試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述第一試劑或所述第二試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑒定為可能對ALK-抑制性治療劑響應的患者。在各個實施方案中，所述第一試劑特異性結合全長ROS激酶蛋白。在各個實施方案中，所述第二試劑特異性結合全長ALK激酶蛋白。在各個實施方案中，所述第一試劑特異性結合ROS激酶蛋白的激酶結構域。在各個實施方案中，所述第二試劑特異性結合ALK激酶蛋白的激酶結構域。在一些實施方案中，所述第一試劑是抗體。在一些實施方案中，所述第二試劑是抗體。在本發(fā)明所有方面的各個實施方案中，患者是人患者且肺癌(或疑似肺癌)來自人。在一些實施方案中，肺癌是NSCLC或SCLC。在一些實施方案中，ROS抑制性治療劑或ALK抑制性治療劑是PF-02341066、NVTTAE-684或AP26113。在一些實施方案中，ROS抑制性治療劑或ALK抑制性治療劑是AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、CH5424802、WHI-P131和WHI-P154。在各個實施方案中，生物樣品選自肺活檢樣品、支氣管肺泡灌洗物、循環(huán)腫瘤細胞、腫瘤切除樣品、細針穿刺物和胸膜滲出液。在進一步方面，本發(fā)明提供了用于確定化合物是否抑制特征在于具有ROS活性的多肽的表達的哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的進展的方法，所述方法包括確定所述化合物是否抑制所述多肽在所述癌癥中的表達的步驟。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于抑制特征在于具有ROS活性的多肽的表達的哺乳動物癌癥或疑似哺乳動物癌癥的進展的方法，所述方法包括抑制所述多肽在所述哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌中的表達和/或活性的步驟。在一些實施方案中，癌癥來自人。附圖說明圖1-是人NSCLC細胞系(HCC78)提取物的Western印跡分析，該圖表示了具有比全長/野生型ROS低很多的分子量的ROS型的表達。圖2-顯示在人NSCLC細胞系中siRNA對突變ROS激酶的抑制作用：小圖A顯示在轉染siRNA后細胞抑制圖，小圖B是顯示ROS的特異性敲低(knock-down)和增加凋亡(在突變ROS驅動的細胞系中)的免疫印跡，且小圖C是顯示ROS下游的信號傳遞分子活性降低的免疫印跡。圖3A-3B-顯示SLC34A2基因和ROS基因分別在染色體4p和6q上的位置(圖3A)，和全長SLC34A2和ROS蛋白的結構域位置(圖3B)。圖3C-是顯示長SCL34A2-ROS變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1-4與ROS的外顯子32-43相組合。融合連接發(fā)生在ROS的跨膜結構域上游的殘基1750，并且融合連接側翼的核苷酸和氨基酸殘基(分別為SEQIDNO:12和SEQIDNO:13)顯示于圖3C的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和氨基酸殘基為常規(guī)字體，來自ROS的核苷酸和氨基酸殘基為粗體文本)。圖3D-是顯示短SCL34A2-ROS變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1-4與ROS的外顯子32-43相組合。融合連接發(fā)生在僅ROS的跨膜結構域上游的殘基1853，并且融合連接側翼的核苷酸和氨基酸殘基(分別為SEQIDNO:14和SEQIDNO:15)顯示于圖3D的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和氨基酸殘基為常規(guī)字體，來自ROS的核苷酸和氨基酸殘基為粗體文本)。圖3E-是顯示預測的非常短SCL34A2-ROS變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1-4與ROS的外顯子35-43相組合。預測融合連接發(fā)生在ROS的跨膜結構域的N-末端邊界處的ROS的殘基1882，并且融合連接側翼的核苷酸和氨基酸殘基(分別為SEQIDNO:16和SEQIDNO:17)顯示于圖3E的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和氨基酸殘基為常規(guī)字體，來自ROS的核苷酸和氨基酸殘基為粗體文本)。圖4A-是人SLC34A2-ROS融合蛋白的長變體的氨基酸序列(1字母代碼)(SEQIDNO:5)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQIDNO:6)(下小圖)；SLC34A2部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結構域的殘基為粗體。圖4B-是人SLC34A2-ROS融合蛋白的短變體的氨基酸序列(1字母代碼)(SEQIDNO:7)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQIDNO:8)(下小圖)；SLC34A2部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結構域的殘基為粗體。圖5-是人SLC34A2蛋白的氨基酸序列(1字母代碼)(SEQIDNO：3)(SwissProt登錄號095436)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQIDNO：4)(GeneBank登錄號NM_006424)(下小圖)；參與易位的殘基用下劃線表示。圖6A-是人ROS激酶的氨基酸序列(1字母代碼)(SEQIDNO:1)(SwissProt登錄號P08922)；參與SLC34A2-ROS(長)變體易位的殘基用下劃線表示，用下劃線表示的粗體殘基是參與(短)變體易位的殘基，并且用下劃線表示的粗體紅色殘基是參與預測的(非常短)變體易位的殘基。圖6B-是人ROS激酶的編碼DNA序列(SEQIDNO:2)(GeneBank登錄號NM_002944)；參與第一SLC34A2-ROS(長)變體易位的殘基用下劃線表示，用下劃線表示的粗體殘基是參與第二(短)變體易位的殘基，并且用下劃線表示的粗體大寫殘基是參與(非常短)變體易位的殘基。圖7-是顯示與對照(泳道1和2)相比SLC34A2-ROS融合蛋白(第一(長)變體)在轉染的293細胞(人胚胎腎細胞)中表達的凝膠圖。圖8-顯示CD74基因和ROS基因分別在染色體5q和6q上的位置(小圖A)，并且全長CD74和ROS蛋白的結構域位置以及在CD74-ROS融合蛋白中的位置(小圖B和C(其中SEQIDNO:30顯示在下面的小圖C中))。融合連接發(fā)生在ROS的跨膜結構域上游的殘基1853。圖9-是人CD74-ROS融合蛋白的氨基酸序列(1字母代碼)(SEQIDNO:22)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQIDNO:23)(下小圖)；CD74部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結構域的殘基為粗體。圖10-是人CD74蛋白的氨基酸序列(1字母代碼)(SEQIDNO:24)(SwissProt登錄號P04233)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQIDNO:25)(GeneBank登錄號NM_001025159)(下小圖)；參與易位的殘基用下劃線表示。圖11A-是人ROS激酶的氨基酸序列(1字母代碼)(SEQIDNO:1)(SwissProt登錄號P08922)；參與CD74-ROS易位的殘基用下劃線表示。圖11B-是人ROS激酶的編碼的DNA序列(SEQIDNO:2)(GeneBank登錄號NM_002944)；參與CD74-ROS易位的殘基用下劃線表示。圖12-是描繪通過RT-PCR檢測CD74和ROS易位形成的融合基因的凝膠圖；其中顯示了針對CD74-F1(頂部)和ROS-GSP3(底部)的引物序列(分別為SEQIDNOs:26和27)。圖13A-13F-是顯示非小細胞肺癌(NSCLC)FFPE腫瘤組織中ROS蛋白和ROS核酸的免疫組織化學和FISH的照片。ROS蛋白定位的變化顯示如下：(A)彌漫性胞質，其中插圖(A)中的黃色箭頭說明通過FISH對c-ros基因座的平衡易位。(B)腺癌中ROS的強點狀定位，其中插圖放大(即放大圖像)。(C)大細胞癌中ROS染色的胞質定位和小圖E中相應的蘇木精和伊紅染色。(D)具有獨特胞質染色和膜定位的腺癌，其中顯示膜染色的插圖進行放大。(E)對應于小圖C中的ROS染色的蘇木精和伊紅染色。(F)點狀囊泡染色，其中顯示囊泡染色的插圖放大。圖14A和B-是使用雙色斷裂-分離探針(2-colorbreak-a-partprobe)通過FISH特異性檢測ROS融合/易位(在人NSCLC細胞系中)的圖像。圖14A顯示了ROS基因上FISH探針雜交的位置，并且圖14B顯示了人NSCLC細胞系(左)和人NSCLC腫瘤中ROS基因的重排，其導致產生分開的橙色和綠色信號。圖15是顯示2個探針組的DNA探針與ROS基因和FIG基因雜交的位置的示意圖。兩個探針組的近端探針(即RP1-179P9)將產生橙色信號，而所有三個遠端探針將產生綠色信號。探針組1源自c-ros，并且如果發(fā)生平衡易位，則橙色將與綠色分開；然而如果發(fā)生FIG-ROS易位，則綠色信號將消失。探針組2源自c-ros(橙色RP1-179P9)和fig(綠色RP11-213A17)。圖16A-16F是顯示HCC78細胞(小圖A和B)、U118MG細胞(小圖C和D)和FFPE腫瘤ID749(小圖E和F)的FISH分析的結果的照片。用探針組1(A)和探針組2(B)探測的HCC78細胞顯示了從這些細胞中存在的SLC34A2-ROS融合體預測的結果。黃色箭頭指向表明HCC78細胞中的平衡易位的分開信號，白色箭頭指向完整染色體。用探針組1(C)和探針組2(D)探測的U118MG細胞顯示了從這些細胞中存在的FIG-ROS融合體預測的結果。用探針組1(E)或探針組2(F)探測的FFPE腫瘤749與U118MG細胞相同。在用探針組1探測的U-118MG和腫瘤ID749兩者中，只有c-ros(橙色)探針退火且缺失區(qū)域(綠色探針)不存在(分別為小圖C和E)。在用探針組2探測的U-118MG和腫瘤ID749(分別為小圖E和F)中，c-ros(橙色)和fig(綠色)探針走到一起，表明fig-ros融合。圖17顯示了來自腫瘤749的ROS融合蛋白的cDNA測序(在“本序列”行)和其與FIG-ROS(S)核苷酸序列(作為“查詢序列”)的比對的結果。圖18是顯示在0nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM或1000nMTAE-684存在的情況下表達FIG-ROS(S)的BaF3(紅色方形)、表達FIG-ROS(L)的BaF3(藍色菱形)、表達FLT3ITD的BaF3(綠色三角形)、和Karpas299細胞(紫色X)的細胞生長響應的線圖。圖19是顯示在TAE-684存在的情況下表達FIG-ROS(S)或FIG-ROS(L)的BaF3通過細胞凋亡而死亡的條形圖。圖20是顯示TAE-684抑制FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)兩者以及它們的下游信號傳遞分子的磷酸化的Western印跡分析的描述。圖21A和21B是顯示在0uM、0.01uM、0.03M、0.10uM、0.3uM、1.0uM的TAE-684(圖21A)或克里唑替尼(圖21B)存在的情況下用neo-myc轉導的BaF3細胞(陰性對照；藍色菱形)；表達FIG-ROS(S)的BaF3(紫色X)、表達FIG-ROS(L)的BaF3(綠色三角形)、表達FLT3ITD的BaF3(紅色方形)和Karpas299細胞(藍色星號)的細胞生長響應的線圖。圖22是顯示克里唑替尼抑制FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)兩者以及ALK和其他信號傳遞分子的磷酸化的Western印跡分析的描述。具體實施方式本發(fā)明基于在人肺癌中發(fā)現異常ROS激酶表達。由于ROS激酶在正常肺組織或細胞中不表達，所以預測異常ROS激酶活性驅動其中其表達的肺癌的增殖和存活。此類癌癥可以根據本文提供的教導進行鑒定(例如，診斷)和/或治療?；谶@些發(fā)現，其肺癌(或疑似肺癌)表達具有ROS活性的蛋白(例如，全長ROS蛋白或ROS融合蛋白)的患者(其中健康患者的肺組織不表達此類具有ROS活性的蛋白)可以有利地對ROS抑制劑的施用響應(例如，與患有相同癌癥的未經治療的患者相比，癌癥的生長可能減緩或停止)。本文中提到的公開專利、專利申請、網站、公司名稱和科學文獻確立了本領域技術人員可獲得的知識，且完整地通過引用并入本文，其程度等同于各自被特定且單獨地指示通過引用并入。本文引用的任何參考文獻和本說明書中的具體教導之間的任何沖突應當以有利于后者的方式來解決。在下文中將更詳細地描述本發(fā)明的其他方面、優(yōu)點和實施方案。本文中提到的專利、公開申請和科學文獻確立了本領域技術人員的知識，且完整地通過引用并入本文，其程度等同于各自被特定且單獨地指示通過引用并入。本文引用的任何參考文獻和本說明書中的具體教導之間的任何沖突應當以有利于后者的方式來解決。同樣，詞或短語的本領域理解的定義和本說明書中具體教導的詞或短語的定義之間的任何沖突應當以有利于后者的方式來解決。如本文所使用，以下術語具有所示含義。如本說明書中所使用，單數形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”還具體包括它們所指術語的復數形式，除非內容另有清楚指出。術語“約”在本文中用來指接近，在…區(qū)間中，粗略地或約。當術語“約”連同數值范圍使用時，它通過延伸所示數值的上限和下限而修改范圍。通常，術語“約”在本文中用來以20％的方差修改所示數值的上限和下限數值。本文中使用的科技術語具有本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的含義，除非本文另有定義。本文參考本領域技術人員已知的各種方法和材料。記載抗體和重組DNA技術的一般原則的標準參考著作(所有這些都通過引用整體并入本文)包括Harlow和Lane,Antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1988),Ausubel等人CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.(1989和更新直至2010年9月),Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1989);Kaufman等人,Eds.,HandbookofMolecularandCellularMethodsinBiologyinMedicine,CRCPress,BocaRaton(1995);McPherson,Ed.,DirectedMutagenesis:APracticalApproach,IRLPress,Oxford(1991)。記載藥學的一般原則的標準參考著作(所有這些都通過引用整體并入本文)包括Goodman和Gilman的ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,第11版,McGrawHillCompaniesInc.,NewYork(2006)。在第一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。該方法包括以下步驟：獲得來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品；并且利用至少一種特異性結合所述具有ROS激酶活性的多肽的試劑來確定所述多肽是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在所述多肽。人ROS激酶蛋白(由ROS1基因編碼)是2347個氨基酸長的受體酪氨酸激酶，其容易發(fā)生異常表達，從而導致癌癥。全長人ROS激酶(具有人ROS蛋白的氨基酸序列)的描述可見UniProt登錄號P08922。如圖1中顯示，ROS的信號肽、胞外結構域、跨膜結構域和激酶結構域可見以下SEQIDNO:1中的氨基酸殘基：表1表1結構域SEQIDNO:1中的氨基酸殘基信號肽1-27胞外結構域28-1859跨膜結構域1860-1882激酶結構域1945-2222額外地，有多個ROS已知的天然存在的變體(參見例如，Greenman等人，Nature446:153-158,2007)。鼠全長ROS的核苷酸和氨基酸序列是已知的(參見例如，UniProt登錄號Q78DX7)。使用常規(guī)實驗，普通技術生物學家將能夠容易確定非人哺乳動物ROS同源物中的相應序列?！耙吧汀盧OS是指全長ROS激酶(即，對于人ROS，2347個氨基酸長多肽或在去除信號肽序列之后的2320個氨基酸長多肽)在正常個體(例如，不患癌癥的正常個體)的健康(或正常)組織(例如，非癌組織)中的表達和/或激活。ROS激酶(全長或截短的)似乎在人正常肺組織中不表達(例如，參見下文實施例)。然而，使用在以下實施例中描述的方法，本發(fā)明人已經作出了ROS激酶在肺癌中表達的令人驚訝的發(fā)現。此類在非典型細胞(在此類情況下，癌細胞)中的表達(其中在典型細胞(例如，非癌肺細胞)中沒有看到表達)是異常的。已經在成膠質細胞瘤(參見Charest等人,Charest等人,GenesChromosomesCancer37:58-71,2003;Charest等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:916-921,2003)和肝癌(參見，例如，PCT公開號WO2010/093928)中報道了以與另一種蛋白(即FIG)的融合體的形式的異常表達的ROS激酶。如本文所使用，術語“ROS融合體”是指ROS多肽的包含ROS蛋白的激酶結構域的部分(或者編碼其的多核苷酸)融合到另一種多肽全部或部分(或者編碼其的多核苷酸)，其中該第二種多肽或多核苷酸的名稱在融合體中命名。(術語“融合體”僅僅意味著來自第一基因的多肽或多核苷酸的全部或部分融合至來自第二基因的多肽或多核苷酸的全部或部分)。例如，SLC34A2-ROS融合體是SLC34A2多肽的部分(或者編碼其的多核苷酸)與ROS多肽的包含激酶結構域ROS的部分(或者編碼其的多核苷酸)之間的融合體。ROS融合體經常由于染色體易位或倒置而導致產生。存在許多已知的ROS融合體，所有這些都是本發(fā)明的ROS融合體，包括，但不限于，SLC34A2-ROS融合蛋白(其成員包括SLC34A2-ROS(VS)、SLC34A2-ROS(S)、SLC34A2-ROS(L)(參見美國專利公開號20100143918)、CD74-ROS(參見美國專利公開號20100221737))和FIG-ROS融合蛋白(其成員包括FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)和FIG-ROS(XL)(參見PCT公開號WO2010/093928))。所有已知的ROS融合蛋白包含全長ROS的完整激酶結構域。因此，如本文所使用，“具有ROS激酶活性的多肽”(或“具有ROS激酶活性的多肽”)是指包括全長ROS蛋白的完整激酶結構域并因此保留ROS激酶活性的蛋白(或多肽)。具有ROS激酶活性的蛋白的非限制性實例包括但不限于，全長ROS蛋白，SLC34A2-ROS融合蛋白(其成員包括SLC34A2-ROS(VS)、SLC34A2-ROS(S)、SLC34A2-ROS(L)(參見美國專利公開號20100143918)、CD74-ROS(參見美國專利公開號20100221737))和FIG-ROS融合蛋白(其成員包括FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)和FIG-ROS(XL)(參見PCT公開號WO2010/093928))和ROS激酶的保留全長ROS激酶蛋白的激酶結構域的任何截短或突變形式。由于ROS的激酶結構域描述于SEQIDNO:61，“具有ROS激酶活性的多肽”是其氨基酸序列包含SEQIDNO:61的多肽。如本文所使用，“多肽”(或“氨基酸序列”或“蛋白”)是指從優(yōu)選α-氨基酸、D-氨基酸、L-氨基酸及其組合以確定順序的連接而形成的聚合物。一個氨基酸殘基和下一個之間的連接被稱為酰胺鍵或肽鍵。多肽的非限制性實例包括指寡肽、肽、多肽、或蛋白質序列、以及其片斷或部分，并且指天然存在或合成分子。多肽還包括衍生分子，諸如糖蛋白和脂蛋白以及低分子量多肽?！鞍被嵝蛄小焙皖愃菩g語，諸如“多肽”或“蛋白質”，并不是將所示氨基酸序列限于與所述蛋白質分子有關的完全、天然氨基酸序列。本領域將會認識到本發(fā)明的多肽(例如，FIG-ROS(S)多肽)的一些氨基酸序列可以變化而不明顯影響所述突變蛋白的結構或功能。如果考慮序列中的這些差異，應當記住的是在蛋白上存在決定活性的關鍵區(qū)域(例如ROS的激酶結構域)。通常，可以置換形成三級結構的殘基，只要使用了執(zhí)行類似功能的殘基。在其他情況下，如果變化發(fā)生在蛋白質的非關鍵區(qū)，則殘基的類型可以是完全不重要的。因此，本發(fā)明的具有ROS酶活性的多肽進一步包括顯示實質上ROS激酶活性的全長ROS蛋白的變體或本文所述的各種ROS融合多肽。一些非限制性保守取代包括：脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之間的彼此交換；羥基殘基Ser和Thr的交換；酸性殘基Asp和Glu的交換；酰胺殘基Asn和Gln的交換；堿性殘基Lys和Arg的交換；以及芳香殘基Phe和Tyr的交換。本領域技術人員已知的保守氨基酸取代的進一步實例為：芳香氨基酸：苯丙氨基酸、色氨酸、酪氨酸(例如，色氨酸殘基被苯丙氨酸替換)；疏水氨基酸：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸；極性氨基酸：谷氨酰胺、天冬酰胺；堿性氨基酸：精氨酸、賴氨酸、組氨酸；酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸；小氨基酸：丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸。如上面詳細說明的，關于哪些氨基酸變化可能是表型沉默的(即，不可能對功能具有顯著的有害影響)的進一步指導可以在Bowie等人，Science247，同上中找到。在一些實施方案中，變體可以具有“非保守”改變，例如用色氨酸置換甘氨酸。類似的改變還可以包括氨基酸缺失或插入，或者二者。利用本領域眾所周知的計算機程序，例如DNASTAR軟件，可以找到指導，其用來確定可以取代、插入、或缺失哪些氨基酸殘基而不消除生物或免疫活性。本發(fā)明具有ROS激酶活性的多肽包括：全長人ROS蛋白(具有如SEQIDNO:1中所述的氨基酸序列)和具有如SEQIDNOs:5、7、22、28、56、58、和60中所述的氨基酸序列的ROS融合多肽(不管包括還是不包括前導序列)，編碼包含包括融合連接的至少六個連續(xù)氨基酸的多肽的氨基酸序列(即，在非ROS伴侶蛋白和ROS蛋白之間的連接處的序列；參見表2)，以及與上述那些具有至少90%相似性，更優(yōu)選至少95%相似性，且仍更優(yōu)選至少96%、97%、98%或99%相似性的多肽?？捎糜谌缦挛乃龅臋z測ROS多肽表達和/或ROS激酶活性的測定中，或者可用作能夠抑制ROS蛋白功能/活性的ROS抑制性治療劑的全長ROS特異性試劑和ROS融合多肽特異性試劑(諸如多克隆和單克隆抗體)。而且，此類多肽可以用于酵母雙雜交系統(tǒng)以“捕獲”ROS蛋白或ROS融合蛋白-結合蛋白，其還是根據本發(fā)明的候選ROS抑制性治療劑。酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song在Nature340:245-246(1989)中描述。在一些實施方案中，試劑可以進一步包含可檢測標記(例如，熒光標記或紅外標記)。關于本文公開的多肽、多核苷酸或試劑(例如，抗體或FISH探針)的“可檢測標記”是指多肽、多核苷酸或抗體的化學、生物或其他修飾或對多肽、多核苷酸或抗體的化學、生物或其他修飾，包括但不限于熒光(例如，FITC或藻紅蛋白)、紅外、質量(例如，等壓標簽)、殘基、染料(發(fā)色團染料)、放射性同位素(例如，32P)、標記或標簽(myc標簽或GST標簽)修飾等，可以通過其檢測目標分子的存在。此類多肽、多核苷酸或試劑因此被稱為“可檢測標記的”?？蓹z測標記可以通過共價(例如，肽鍵或磷酸二酯鍵)或非共價化學鍵(例如，離子鍵)連接到所述多肽、多核苷酸或結合劑?？捎糜诒景l(fā)明方法的試劑包括但不限于，特異性結合肺癌中表達的全長ROS蛋白或許多ROS融合蛋白之一的試劑，諸如抗體或AQUA肽或其結合部分?！疤禺愋越Y合”或“特異性結合”是指本發(fā)明的試劑或結合劑(例如，核酸探針、抗體、或AQUA肽)與其目標分子(例如，ROS融合多肽或多核苷酸、或全長ROS多肽或多核苷酸)相互作用，其中所述相互作用依賴于特定結構(例如，多肽上的抗原決定簇或表位或多核苷酸的核苷酸序列)的存在；換言之，所述試劑識別并結合特定多肽或多核苷酸結構，而不是一般的所有多肽或多核苷酸?！捌浣Y合片段”是指特異性結合目標分子的試劑的片段或部分(例如，抗體的Fab片段)。特異性結合目標分子的試劑可以被稱為目標-特異性試劑或抗-目標試劑。例如，特異性結合FIG-ROS(L)多肽的抗體可以被稱為FIG-ROS(L)-特異性抗體或抗-FIG-ROS(L)抗體。類似地，特異性結合FIG-ROS(L)多核苷酸的核酸探針可以被稱為FIG-ROS(L)-特異性核酸探針或抗-FIG-ROS(L)核酸探針。在其中目標分子是多肽的一些實施方案中，特異性結合目標分子的試劑對其目標分子(例如，全長ROS或ROS融合多肽)具有1x10-6M或更小的結合親和力(KD)。在一些實施方案中，本發(fā)明的特異性結合目標分子的試劑對其目標分子具有1x10-7M或更小的KD、或1x10-8M或更小的KD、或1x10-9M或更小的KD、或1x10-10M或更小的KD、或1x10-11M或更小的KD、或1x10-12M或更小的KD。在某些實施方案中，本發(fā)明的特異性結合目標分子的試劑對其目標分子的KD是1pM至500pM、或500pM至1μM、或1μM至100nM、或100mM至10nM。本發(fā)明的試劑特異性結合的目標分子的非限制性實例包括全長ROS多肽或ROS融合多肽，包括SLC34A2-ROS(S)融合多肽、SLC34A2-ROS(VS)融合多肽、SLC34A2-ROS(L)融合多肽、CD74-ROS融合多肽、FIG-ROS(L)融合多肽、FIG-ROS(S)融合多肽、FIG-ROS(XL)融合多肽及其片段，特別是包括ROS部分和ROS融合多肽的第二蛋白(例如，SLC34A2、FIG或CD74)的部分之間的連接的那些片段。在其中目標分子是多核苷酸的一些實施方案中，本發(fā)明的特異性結合其目標分子的試劑是在嚴格條件與其目標多核苷酸雜交的試劑。關于核苷酸序列或核苷酸探針雜交條件的術語“嚴格條件”是“嚴格性”，其發(fā)生在約Tm-5℃(即，低于試劑或核酸探針的熔解溫度(Tm)5℃)至低于Tm約20℃至25℃的范圍內。典型的嚴格條件是：在42℃下在溶液中過夜孵育，所述溶液包含：50％甲酰胺、5X.SSC(750mMNaCl，75mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5XDenhardt溶液、10％硫酸葡聚糖、以及20微克/ml變性的、剪切的鮭魚精DNA，接著在約65℃的0.1XSSC中洗滌濾膜。如本領域技術人員將理解的，可以改變雜交的嚴格性以便鑒定或檢測相同的或有關的多核苷酸序列。“在嚴格條件下與目標多核苷酸(例如，全長ROS多核苷酸)雜交的試劑(例如，多核苷酸或核苷酸探針)”是指沿參考多核苷酸的整個長度雜交或與作為參考多核苷酸的至少約15個核苷酸(nt)、或至少約20nt、或至少約30nt、或約30-70nt的參考多核苷酸的部分雜交的試劑(例如，多核苷酸或核苷酸探針(例如，DNA、RNA或DNA-RNA雜合體))。本發(fā)明的這些核苷酸探針可用作如本文討論的診斷探針(例如，對于FISH)和引物(例如，對于PCR)。本發(fā)明的試劑特異性結合的目標分子的非限制性實例包括：全長ROS多肽，例如包含SEQIDNO:1(或編碼其的多核苷酸)的序列，ROS蛋白的激酶結構域，例如包含SEQIDNO:61(或編碼其的多核苷酸)的序列，ROS多肽的跨膜結構域(或編碼其的多核苷酸)，FIG-ROS(S)融合多肽，例如具有包含SEQIDNO:58(或FIG-ROS(S)多核苷酸)的序列，FIG-ROS(L)融合多肽，例如包含SEQIDNO:56(或FIG-ROS(L)多核苷酸)的序列，FIG-ROS(VL)融合多肽，例如包含SEQIDNO:60(或FIG-ROS(VL)多核苷酸)的序列，SLC34A2-ROS(VS)融合多肽，例如包含SEQIDNO:28(或SLC34A2-ROS(VS)多核苷酸)的序列，SLC34A2-ROS(S)融合多肽，例如包含SEQIDNO:7(或SLC34A2-ROS(S)多核苷酸)的序列，SLC34A2-ROS(L)融合多肽，例如包含SEQIDNO:5(或SLC34A2-ROS(L)多核苷酸)的序列，CD74-ROS融合多肽，例如包含SEQIDNO:22(或CD74-ROS多核苷酸)的序列及其片段，特別是包括ROS部分和ROS融合多肽的第二蛋白的部分(例如，SLC34A2、FIG或CD74)之間的連接的那些片段(參見例如，表2)?？捎糜谒_方法的實施中的試劑尤其包括全長ROS特異性和ROS融合多肽特異性抗體和AQUA肽(重同位素標記肽)，其對應于且適合于檢測和定量生物樣品中指示多肽的表達。因此，“ROS多肽特異性試劑”是能夠特異性結合、檢測和/或定量生物樣品中表達的ROS多肽的存在/水平的任何生物學或化學試劑。如果該試劑特異性結合至ROS蛋白的存在于ROS融合蛋白中的部分(例如，激酶結構域)，則ROS多肽特異性試劑也將能夠特異性結合至生物樣品中的表達的ROS融合多肽，檢測和/或定量生物樣品中的表達的ROS融合多肽的存在/水平。所述術語包括但不限于下文討論的抗體和AQUA肽試劑，并且等同結合劑也在本發(fā)明的范圍之內。在一些實施方案中，特異性結合具有ROS激酶活性的多肽的試劑是抗體。在一些實施方案中，所述試劑(例如，抗體)特異性結合全長ROS多肽。在一些實施方案中，所述試劑(例如，抗體)特異性結合全長FIG多肽。在一些實施方案中，所述試劑(例如，抗體)特異性結合全長SLC34A2多肽。在一些實施方案中，所述試劑(例如，抗體)特異性結合全長CD74多肽。在一些實施方案中，所述試劑(例如，抗體)特異性結合ROS融合多肽并且不特異性結合全長ROS或其融合伴侶(例如，全長FIG、全長CD74或全長SLC34A2)的全長多肽。其他試劑也可用于實施本發(fā)明的方法，諸如表位-特異性抗體，其特異性結合野生型ROS蛋白序列的細胞外結構域中的表位(因此能夠檢測樣品中野生型ROS的存在(或不存在))或特異性結合野生型ROS蛋白序列的激酶結構域中的表位(因此能夠檢測樣品中具有ROS激酶活性的任何蛋白的存在(或不存在))。特異性結合肺癌中全長ROS蛋白或ROS融合多肽之一的抗體還可以結合其他哺乳動物物種，例如鼠或兔的高度同源和等價的表位肽序列，并且反之亦然。可用于實施本發(fā)明方法的抗體包括(a)單克隆抗體，(b)特異性結合目標多肽(例如融合多肽的融合連接)的純化的多克隆抗體；(c)如上述(a)-(b)中所述的特異性結合其他非人類物種(例如小鼠，大鼠)的等價和高度同源的表位或者磷酸化位點的抗體；以及(d)上述(a)-(c)特異性結合由本文公開的示例性抗體結合的抗原(或者更優(yōu)選表位)的片段。術語“抗體”是指所有類型的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，包括其結合片段(即，能夠特異性結合抗體目標分子的抗體的片段，諸如Fab和F(ab’)2片段)，以及重組、人源化、多克隆和單克隆抗體和/或其結合片段。本發(fā)明的抗體可以源自任何動物物種，諸如源自哺乳動物。非限制性的示例性天然抗體包括源自人、雞、山羊和嚙齒動物(例如，大鼠、小鼠、倉鼠和兔)的抗體，包括基因工程改造以產生人抗體的轉基因嚙齒動物的抗體(參見，例如，Lonberg等人,WO93/12227；美國專利號5,545,806；和Kucherlapati,等人,WO91/10741；美國專利號6,150,584，其通過引用整體并入本文)。本發(fā)明的抗體也可以是嵌合抗體。參見例如，M.Wroser等人，Molec.Immunol.26:403-11(1989);Morrision等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.81:6851(1984);Neuberger等人，Nature312:604(1984))。所述抗體可以是按照美國專利號4,474,893(Reading)或美國專利號4,816,567(Cabilly等人)所公開的方法制備的重組單克隆抗體。所述抗體還可以是按照美國專利號4,676,980(Segel等人)公開的方法制備的化學構建的特異性抗體。天然抗體是由宿主動物產生的抗體，然而本發(fā)明還涵蓋遺傳改造的抗體，其中氨基酸序列已經與天然抗體的氨基酸序列不同。因為重組DNA技術與本申請的相關性，不必局限于在天然抗體中發(fā)現的氨基酸序列；抗體可以重新設計，以獲得所需特性。可能的變化有很多，范圍從改變僅一個或幾個氨基酸到完全重新設計例如可變區(qū)或恒定區(qū)。一般將進行恒定區(qū)中的改變以改善或改變特性，諸如補體結合(complementfixation)、與膜的相互作用和其他效應子功能。將進行可變區(qū)中的改變以改善抗原結合特性。如本文所使用，術語“人源化抗體”是指這樣的抗體分子，其中非抗原結合區(qū)中的氨基酸已被代替以便更接近地類似人抗體，同時仍然保留最初的結合能力。具體考慮的其他抗體是寡克隆抗體。如本文所使用，短語“寡克隆抗體”是指不同單克隆抗體的預定混合物。參見，例如，PCT公開WO95/20401；美國專利號5,789,208和6,335,163。在一個實施方案中，由針對一個或多個表位的抗體的預定混合物組成的寡克隆抗體在單一細胞中生成。在其他實施方案中，寡克隆抗體包含許多能夠與共同輕鏈配對的重鏈，以生成具有多種特異性的抗體(例如，PCT公開WO04/009618)。當期望寡克隆抗體靶向單一目標分子上的多個表位時，寡克隆抗體特別有用。鑒于本文公開的測定法和表位，本領域技術人員可以生成或選擇適用于預期目的和所需要求的抗體或抗體的混合物。重組抗體也包括在本發(fā)明中。這些重組抗體具有與天然抗體相同的氨基酸序列或具有與天然抗體的不同氨基酸序列。它們可以在任何表達系統(tǒng)中制備，所述表達系統(tǒng)包括原核和真核表達系統(tǒng)或使用噬菌體展示法(參見，例如，Dower等人,WO91/17271和McCafferty等人,WO92/01047；美國專利號5,969,108，其通過引用整體并入本文)。抗體可以以多種方式工程改造。它們可以制成單鏈抗體(包括小型模塊化免疫藥物或SMIPs?)、Fab和F(ab’)2片段等。抗體可以是人源化的、嵌合化的、去免疫化的或完全人的。許多出版物記載了許多類型的抗體和工程改造此類抗體的方法。例如，參見美國專利號6,355,245;6,180,370;5,693,762;6,407,213;6,548,640;5,565,332;5,225,539;6,103,889;和5,260,203。本發(fā)明的遺傳改造的抗體可以在功能上等同于上述天然抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的修飾抗體提供了改進的穩(wěn)定性或/和治療效果。修飾的抗體的非限制性實例包括沒有顯著有害地改變抗原結合效用的具有氨基酸殘基的保守取代和一個或多個氨基酸的缺失或添加的抗體。取代的范圍可以從改變或修飾一個或多個氨基酸殘基到完全重新設計區(qū)域，只要治療效用得以維持。本發(fā)明的抗體可以在翻譯后進行修飾(例如，乙酰化和/或磷酸化)，或者可以合成地修飾(例如，連接標記基團)。具有工程改造或變體的恒定區(qū)或Fc區(qū)的抗體可用于調節(jié)效應子功能，諸如，例如，抗原依賴性細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)。此類具有工程改造或變體的恒定區(qū)或Fc區(qū)的抗體可用于其中親本單獨分離的蛋白(parentsinglingprotein)在正常組織中表達的情況；在這些情況下沒有效應子功能的變體抗體可以引發(fā)所需治療響應，而不會損傷正常組織。因此，本公開的某些方面和方法涉及具有改變的效應子功能且包含一個或多個氨基酸取代、插入和/或缺失的抗體。術語“生物上活性的”是指具有天然存在分子的結構、調節(jié)、或生化功能的蛋白質。同樣，“免疫學上活性的”是指天然、重組或合成全長ROS蛋白或ROS融合多肽(例如，本文所述FIG-ROS融合多肽之一)、或其任何寡肽誘導適當動物或細胞中的特異性免疫應答以及與特異性抗體結合的能力。還在本發(fā)明內的是具有少于4條鏈的抗體分子，包括單鏈抗體、駱駝抗體等和抗體的組分，包括重鏈或輕鏈。在一些實施方案中，免疫球蛋白鏈從5'到3'可以包含可變區(qū)和恒定區(qū)?？勺儏^(qū)可以包含散布構架(FR)區(qū)的三個互補性決定區(qū)(CDRs)，結構為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。還在本發(fā)明內的是重鏈或輕鏈可變區(qū)、構架區(qū)和CDRs。本發(fā)明的抗體可以包含重鏈恒定區(qū)，所述重鏈恒定區(qū)包含一些或全部CH1區(qū)、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。本發(fā)明的融合多肽特異性抗體的一個非限制性表位位點是基本上由融合多肽序列的約11至17個氨基酸組成的肽片段，該片段包括在分子的ROS部分與該分子的來自非ROS融合伴侶的部分之間的融合連接。應當理解的是特異性結合更短或更長的包含ROS融合多肽的融合連接的肽/表位的抗體在本發(fā)明的范圍之內。本發(fā)明不限于使用抗體，而是包括等價分子，諸如蛋白結合結構域或核酸適配體，其以ROS蛋白特異性或ROS融合蛋白特異性方式，結合可用于本發(fā)明方法的全長ROS特異性或ROS融合多肽特異性抗體所結合的基本上相同表位。參見例如，Neuberger等人，Nature312:604(1984)。在下文中進一步描述的本發(fā)明的方法中，可以適當地采用此類等價的非抗體試劑?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明方法的多克隆抗體可以按照標準技術制備，其中按照已知程序，用包括所需融合蛋白質特異性表位(例如，在ROS融合多肽中非ROS蛋白伴侶與ROS蛋白伴侶之間的融合連接)的抗原免疫適宜的動物(例如，兔、山羊等)，從動物收集免疫血清，從免疫血清分離多克隆抗體，以及純化具有所需特異性的多克隆抗體。所述抗原可以是按照眾所周知的技術選擇和構建的包括所需表位序列的合成肽抗原。參見例如，Antibodies:ALaboratoryManual,Chapter5,p.75-76,Harlow&LaneEds.,ColdSpringHarborLaboratory(1988);Czernik,MethodsInEnzymology,201:264-283(1991);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:21-49(1962))。如下文進一步描述的，可以對如本文所述制備的多克隆抗體進行篩選和分離。單克隆抗體還可以有利地用于本發(fā)明的方法中，并且可以按照Kohler和Milstein的眾所周知的技術在雜交瘤細胞系中制備。Kohler和Milstein.Nature265:495-97(1975);Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.6:511(1976);還參見CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人.Eds.(WileyandSins,NewYork,NY1989并且每年更新直到包括2010年)。這樣制備的單克隆抗體是高度特異性的，能提高本發(fā)明提供的測定方法的選擇性和特異性。例如，可以將含有適當抗原(例如包含ROS融合多肽的融合連接的合成肽)的溶液注射小鼠，在足夠的時間(與常規(guī)技術一致)后處死小鼠并獲取脾細胞。然后，通常在存在聚乙二醇的情況下，通過將脾細胞與骨髓瘤細胞融合來固定脾細胞，以產生雜交瘤細胞。兔融合雜交瘤例如可以如美國專利號5,675,063中所述來產生。然后在適宜的選擇培養(yǎng)基諸如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)中生長雜交瘤細胞，并篩選上清液以獲得具有期望特異性的單克隆抗體，如下所述。通過常規(guī)方法諸如沉淀、離子交換或親和層析等，可以從組織培養(yǎng)上清液回收分泌的抗體。通過本領域技術人員已知的重組技術，還可以在大腸桿菌中產生單克隆Fab片斷。參見例如，W.Huse,Science246:1275-81(1989);Mullinax等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.87:8095(1990)。如果一種同種型的單克隆抗體期望用于特定用途，則可以通過從最初融合進行選擇來直接制備，或通過利用用來分離類別轉換變體的同胞選擇技術，從分泌不同同種型的單克隆抗體的親代雜交瘤來二次制備特定的同種型(Steplewski等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.,82:8653(1985);Spira等人，J.Immunol.Methods,74:307(1984))。結合單克隆抗體的位點的抗原可以通過PCR加以克隆并且單鏈抗體產生為噬菌體展示重組抗體或在大腸桿菌中的可溶抗體(參見例如，AntibodyEngineeringProtocols,1995,HumanaPress,SudhirPaul編輯)。更進一步，美國專利號5,194,392，Geysen(1990)描述了檢測或確定單體(氨基酸或其他化合物)的序列的一般方法，該序列是表位的拓撲等同物(即，“模擬表位”)，其互補于目標抗體的特定互補位(抗原結合位點)。更一般地，該方法涉及檢測或確定單體的序列，該序列是配體的拓撲等同物，其互補于目標特定受體的配體結合位點。類似地，美國專利號5,480,971，Houghten等人(1996)公開了線性C1-C-rosylperrosylated寡肽以及此類肽的組和文庫，以及使用此類寡肽組和文庫用于確定優(yōu)先結合于目標受體分子的perrosylated寡肽的序列的方法。因此，本發(fā)明含有表位的肽的非肽類似物可以通過這些方法常規(guī)制備。可以按照標準技術針對表位和融合蛋白特異性，來篩選可用于本發(fā)明的方法的抗體(不管是多克隆或單克隆)。參見例如，Czernik等人，MethodsinEnzymology,201:264-283(1991)。例如，可以針對肽文庫并通過ELISA來篩選抗體以確保對于兩種所需抗原的特異性，以及如果需要的話，確保僅與，本發(fā)明全長ROS蛋白、特定ROS融合多肽(例如，SLC34A2-ROS(S)多肽)或其片段的反應性的特異性。還可以通過針對包含目標蛋白的細胞制劑的Western印跡來試驗抗體以證實僅與所期望的目標具有反應性以及確保沒有明顯結合于其他蛋白。融合蛋白特異性抗體的制備、篩選和使用是本領域技術人員已知的，并已被描述。參見例如，美國專利公開號20050214301。可用于本發(fā)明方法的抗體(例如，全長ROS蛋白特異性或ROS融合多肽特異性)可以表現出與其他蛋白或多肽中的類似表位(諸如類似融合多肽)某些有限的交叉反應性。這并不是意外的，因為大多數抗體表現出一定程度的交叉反應性，并且抗肽抗體將經常與對于免疫肽具有高同源性或同一性的表位進行交叉反應。參見例如，Czernik,同上。通過Western印跡連同已知分子量的標記可以容易地表征與其他融合蛋白的交叉反應性。可以檢測交叉反應蛋白的氨基酸序列以鑒定抗體結合的與全長ROS蛋白序列或ROS融合多肽(例如FIG-ROS(S)多肽)序列高度同源或相同的位點。通過陰性選擇并利用肽柱上的抗體純化可以除去不期望的交叉反應性?？捎糜趯嵤┍疚墓_方法的本發(fā)明的ROS特異性抗體和ROS融合多肽-特異性抗體對于人融合多肽是理想地特異性的，但并不僅限于結合人物種本身。本發(fā)明包括還結合其他哺乳動物物種(例如小鼠、大鼠、猴)中保守的和高度同源或相同的表位的抗體的制備和使用。使用本文公開的人ROS蛋白序列(SEQIDNO：1)和人ROS融合多肽序列(SEQIDNOs：5、7、22、28、56、58和60)通過標準序列比較，諸如使用BLAST，可以容易地確定在其他物種中的高度同源的或相同的序列?？梢酝ㄟ^在特定測定形式中的應用，例如FC、IHC、和/或ICC，來進一步表征和證實在本發(fā)明的方法中采用的抗體。本文進一步描述了此類方法中全長ROS蛋白特異性和/或ROS融合多肽-特異性抗體的應用。本文所述抗體(單獨或在下文所述的測定中使用)還可以有利地綴合熒光染料(例如Alexa488、藻紅蛋白)或標記諸如量子點(quantumdots)，連同其他信號轉導(磷酸-AKT、磷酸-Erk1/2)和/或細胞標記(細胞角蛋白)抗體用于多參數分析，如下文進一步描述的。在實施本發(fā)明的方法時，還可以使用對全長ROS蛋白特異性(即，與之特異性結合)的抗體或對ROS融合多肽特異性的抗體有利地檢查本發(fā)明的ROS融合多肽和/或全長ROS在給定生物樣品中的表達和/或活性。例如，ROS特異性抗體(即，特異性結合全長ROS的抗體)可商業(yè)上獲得(參見SantaCruzBiotech.,Inc.(SantaCruz,CA)目錄號sc-6347;CellSignalingTechnology,Inc.(Danvers,MA),目錄號3266);以及例如，Abcam(Cambridge,MA),目錄號ab5512和ab108492)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的ROS特異性抗體特異性結合ROS的激酶結構域，且因此將檢測本文所述的全長ROS和全部ROS融合多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明方法中使用的ROS特異性抗體特異性結合ROS蛋白上在ROS的激酶結構域的C'末端的區(qū)域，并且因此，將檢測到全長ROS和本文所述的所有ROS融合多肽。此類抗體還可以按照標準方法制備。在生物樣品(例如腫瘤樣品)中，全長ROS的表達和/或活性和/或ROS融合多肽表達的檢測，可以提供關于融合蛋白是否單獨驅動腫瘤或者異常表達的全長ROS是否也存在并驅動腫瘤的信息。此類信息臨床上可用于評估是否靶向融合蛋白或者全長蛋白、或者二者，或可能最有益于抑制腫瘤的發(fā)展，以及有利于選擇適當的治療劑及其組合。對ROS激酶細胞外結構域特異性的抗體(其并不存在于本文公開的突變ROS中)，可以特別用于確定突變ROS激酶的存在/不存在。應當理解的是實施本文所述方法時，可以使用多于一種抗體。例如，可以同時使用一種或多種ROS融合多肽特異性抗體連同對于另一種激酶、受體、或激酶底物(在其中表達ROS融合多肽的癌癥中，其疑似被激活、或潛在被激活)特異性的抗體，以在包含來自此類癌癥的細胞的生物樣品中檢測此類其他信號傳遞分子的活性。一種或多種本領域技術人員將能理解的是，上述本發(fā)明的融合多肽及其含有表位的片段可以與其他分子的部分組合形成嵌合多肽。例如，全長ROS或ROS融合多肽的攜帶表位片段可以與免疫球蛋白(IgG)的恒定結構域組合，以促進嵌合多肽的純化且增加嵌合多肽的體內半衰期(參見，例如，EPA394,827中CD4-Ig嵌合蛋白的實例；Traunecker等人,Nature331:84-86(1988))。具有二硫鍵連接的二聚體結構的融合蛋白(例如，來自IgG部分)還可以比單獨的單體多肽更有效地結合并中和其他分子(參見Fountoulakis等人,JBiochem270:3958-3964(1995))。在一些實施方案中，特異性結合全長ROS或ROS融合多肽的試劑是重同位素標記的肽(即，AQUA肽)，例如，其對應于包含ROS融合多肽的融合連接的肽序列。此類AQUA肽可適合于生物樣品中表達FIG-ROS融合多肽的絕對定量。如本文所使用，術語“重同位素標記肽”與“AQUA肽”可互換使用。用于絕對定量或檢測復雜混合物中的蛋白質(AQUA)的AQUA肽的制備和使用已被描述。參見WO/03016861,“AbsoluteQuantificationofProteinsandModifiedFormsThereofbyMultistageMassSpectrometry,”Gygi等人，并且還描述在Gerber等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:6940-5(2003)(它們的教導通過引用整體并入本文)中。關于此類AQUA肽的術語“特異性檢測”意指所述肽只檢測和定量含有AQUA肽序列的多肽和蛋白質，且基本上不檢測不含有AQUA肽序列的多肽和蛋白質。AQUA方法使用將已知量的至少一種重同位素標記的肽標準(其具有可由LC-SRM層析檢測的獨特特征(signature))導入到消化的生物樣品中，以通過與肽標準比較確定生物樣品中的具有相同序列和蛋白質修飾的肽的絕對量。簡而言之，AQUA方法具有兩個階段：肽內標準選擇和驗證以及方法開發(fā)；和使用證實的肽內標準檢測并定量樣品中的目標蛋白來實施。該方法是一種有力的技術，用于檢測和定量在復雜的生物混合物中的給定肽/蛋白質，諸如細胞裂解物，并且可以用來，例如，定量由于藥物處理而引起的蛋白質磷酸化的變化，或定量在不同生物狀態(tài)蛋白質水平的差異。通常，為了開發(fā)出適當的內標準，基于其氨基酸序列和用來消化的特定蛋白酶，選擇在目標蛋白質序列內的特定肽(或修飾肽)。然后通過固相肽合成方法產生肽，從而使得一個殘基被含有穩(wěn)定同位素(13C、15N)的相同殘基置換。結果是這種肽在化學上與通過蛋白質水解形成的天然對應物相同，但容易通過MS并經由7-Da質量漂移加以區(qū)別。然后通過LC-MS/MS評價新合成的AQUA內標準肽。通過反向層析、電離效率、以及借助于碰撞誘導解離的片段化，該方法提供了關于肽保留的定性信息。選擇用于天然和內標準肽集合的信息和豐富的片斷離子，然后作為層析保留的函數快速連續(xù)加以具體監(jiān)測以形成基于肽標準的獨特概況的選擇反應監(jiān)測(LC-SRM)方法。AQUA策略的第二階段是應用該方法測量復雜混合物中的蛋白質或修飾蛋白質的量。通常使用SDS-PAGE凝膠電泳分級分離全細胞裂解物，并且切出與蛋白質遷移一致的凝膠區(qū)域。該過程之后是在AQUA肽存在的情況下進行凝膠內蛋白水解和LC-SRM分析。(參見Gerber等人,同上。)將AQUA肽加入到通過蛋白水解酶消化全細胞裂解物獲得的復雜肽混合物，然后經受免疫親和純化，如上所述。通過消化(例如胰蛋白酶消化)形成的天然肽的保留時間和片段化模式與先前測定的AQUA內標準肽的相同；因此，采用SRM實驗進行LC-MS/MS分析導致內標準和直接來自極端復雜肽混合物的分析物兩者的高度特異性和敏感的測量。由于加入了絕對量的AQUA肽(例如250fmol)，所以曲線下面的比率可以用來確定在最初細胞裂解物中蛋白質或蛋白質的磷酸化形式的精確的表達水平。此外，凝膠內消化形成天然肽時存在內標準，從而使得凝膠片斷肽提取效率、處理樣品過程中的絕對損失(包括真空離心)和在導入LC-MS系統(tǒng)過程中的易變性不影響天然和AQUA肽豐度的確定的比率。開發(fā)了一種AQUA肽標準，其用于通過IAP-LC-MS/MS方法先前在目標蛋白內鑒定的已知序列。如果位點被修飾，則可以開發(fā)一種AQUA肽，其在位點內摻入特定殘基的修飾形式；以及開發(fā)第二種AQUA肽，其摻入殘基的未修飾形式。以這種方式，使用兩種標準檢測并定量生物樣品中位點的修飾和未修飾的形式。還可以通過檢查蛋白質的一級氨基酸序列和確定由蛋白酶剪切產生的肽的邊界來產生肽內標準?？商娲?，可以用蛋白酶實際消化蛋白質，然后可以對產生的特定肽片斷進行測序。合適的蛋白酶包括但不限于絲氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶、hepsin)、金屬蛋白酶(例如PUMP1)、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、羧肽酶等。按照一個或多個標準選擇目標蛋白內的肽序列，以優(yōu)化使用該肽作為內標準。優(yōu)選地，選擇肽的大小以便將在其他非目標蛋白中重復肽序列的機會降到最低程度。因此，肽優(yōu)選為至少約6個氨基酸。還優(yōu)化肽的大小以使電離頻率最大化。因此，在一些實施方案中，肽不大于約20個氨基酸。在一些實施方案中，肽的長度約7-15個氨基酸。還選擇在質譜法過程中不可能是化學活性的肽序列，因此避免包含半胱氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的序列?？梢赃x擇不包括目標區(qū)域的修飾區(qū)域的肽序列，從而使得可以使用所述肽內標準來確定所有形式蛋白質的量。或者，包括修飾氨基酸的肽內標準可以期望用來僅檢測和定量目標蛋白的修飾形式?？梢砸黄鹗褂糜糜谛揎椇臀葱揎梾^(qū)域兩者的肽標準，確定特定樣品中修飾的程度(即確定蛋白質總量的多少部分由修飾形式表示)。例如，可以使用已知在特定位點磷酸化的蛋白的磷酸化和非磷酸化形式兩者的肽標準來定量樣品中磷酸化形式的量。使用一種或多種標記的氨基酸來標記肽(即，標記是肽的實際部分)，或較少優(yōu)選地可以在按照標準方法合成以后連接標記。優(yōu)選地，標記是基于以下考慮事項所選擇的質量變化標記：質量應當對于MS分析所產生的片斷質量與具有低背景的譜區(qū)的遷移是獨特的；離子質量特征成分是標記部分的一部分，其在MS分析中優(yōu)選呈現獨特的離子質量特征；標記的組分原子的質量總和優(yōu)選獨特地不同于所有可能的氨基酸的片斷。作為結果，通過在所得到的質譜中的離子/質量模式，標記氨基酸和肽容易與未標記的氨基酸和肽分開。優(yōu)選地，離子質量特征成分將質量賦予并不匹配任何20種天然氨基酸的殘基質量的蛋白質片斷。所述標記在MS的片段化條件下是穩(wěn)定的，不會經歷不利的片段化。在一定范圍的條件下，尤其是在變性條件下，標記化學應是有效的，并且標記標簽優(yōu)選仍然可溶于所選擇的MS緩沖系統(tǒng)中。標記優(yōu)選不抑制蛋白質的電離效率并且不是化學反應性的。標記可以含有兩種或更多種不同同位素物質的混合物以在每一個標記的片段位置產生獨特的質譜模式。穩(wěn)定的同位素諸如2H、13C、15N、17O、18O或34S是一些非限制性標記。還可以制備摻入不同同位素標記的肽內標準對。重同位素標記可以摻入的非限制性氨基酸殘基包括亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸。按照它們的質荷(m/z)比，以及優(yōu)選地還按照它們在色譜柱(例如，HPLC柱)上的保留時間來表征肽內標準。與相同序列的未標記肽共洗脫的內標準被選為最佳內標準。然后通過任何適當的方法，例如通過使用例如氬氣或氦氣作為碰撞氣體的碰撞誘導解離(CID)對肽進行片段化，來分析內標準。然后采用例如多步質譜法(MSn)分析片段以獲得片段離子譜，從而獲得肽片段化特征。優(yōu)選地，肽片斷具有顯著的m/z比差異，以使得對應于各片段的峰很好分開，以及獲得目標肽特有的特征。如果在第一步沒有獲得適當的片段特征，則進行MS的另一階段，直到獲得獨特的特征。在MS/MS和MS3譜中的片段離子對于目標肽通常是高度特異的，連同LC方法，可以高度選擇性地檢測和定量復雜蛋白質混合物，諸如細胞裂解物，中的目標肽/蛋白質，其中細胞裂解物包含數千或上萬種蛋白質。可以測定潛在地包含感興趣的目標蛋白/肽的任何生物樣品。優(yōu)選使用粗的或者部分純化的細胞提取物。通常，樣品具有至少0.01mg的蛋白質，通常濃度為0.1-10mg/mL，并且可調節(jié)到期望的緩沖液濃度和pH。然后將對應于待檢測/定量的目標蛋白的已知量的標記肽內標準，優(yōu)選約10飛摩爾，加入到生物樣品，諸如細胞裂解物中。然后用一種或多種蛋白酶消化摻入樣品適當的時間以允許進行消化。然后進行分離(例如通過HPLC、反相HPLC、毛細管電泳、離子交換層析等)以從樣品中的其他肽分離標記內標準和其相應的目標肽。微毛細管LC是一種非限制性方法。然后通過監(jiān)測MS中的選擇反應來檢查每種分離的肽。這涉及利用通過表征肽內標準所獲得的先前知識，然后獲得MS，以連續(xù)監(jiān)測在MS/MS或MSn譜用于目標肽和內標準兩者的特定離子。在洗脫后，計算肽標準和目標肽峰兩者的曲線下面積(AUC)。兩個面積的比率提供絕對定量，其可以加以歸一化，以獲得在分析中使用的細胞數目和蛋白質的分子量，從而提供每個細胞的精確的蛋白質拷貝數。AQUA方法更詳細地描述在Gygi等人，和Gerber等人同上。如上所述，可以期望制備AQUA內肽標準(重同位素標記肽)以檢測本發(fā)明突變ROS多肽內的任何量任何獨特位點(例如FIG-ROS融合多肽內的融合連接)。例如，可以制備AQUA磷酸肽，其相應于FIG-ROS融合多肽之一的融合連接序列。可以針對FIG-ROS融合連接制成肽標準，且在AQUA方法中使用此類標準檢測并定量生物樣品中的融合連接(即FIG-ROS融合多肽的存在)。例如，本發(fā)明的一個非限制性AQUA肽包括氨基酸序列AGSTLP(SEQIDNO:66)，其對應于FIG-ROS融合多肽(即，FIG-ROS(S)融合多肽)的短變體中直接側接融合連接的每一側的三個氨基酸，其中由FIG基因編碼的氨基酸是斜體且由ROS基因編碼的氨基酸是粗體。應當理解的是還可以構建包含融合連接序列(和其下游或上游另外的殘基)的更大的AQUA肽。類似地，可以可替代地構建更小的AQUA肽，其包含少于此類序列的所有殘基(但仍然包含融合連接本身的點)。此類更大或者更短的AQUA肽在本發(fā)明的范圍之內，并且可以如上所述進行AQUA肽的選擇和制備(參見Gygi等人,Gerber等人，同上。)。應當指出的是，因為AQUA肽跨越本文所述的ROS融合蛋白之一的融合連接的序列也可以是(或者包括在)ROS融合體特異性抗體特異性結合的表位。“表位”是指免疫原性表位(即能夠引發(fā)免疫應答)或抗原性表位(即，抗體可以特異性結合的蛋白分子的區(qū)域)。蛋白的免疫原性表位的數量少于抗原性表位的數量。參見，例如，Geysen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002(1983)。表2提供了本發(fā)明的ROS融合多肽的所有融合連接的序列的列表，其中非ROS基因編碼的氨基酸用斜體表示，并且ROS基因編碼的氨基酸用粗體表示。表2在一些實施方案中，哺乳動物肺癌來自人類(即，人)。在一些實施方案中，哺乳動物肺癌是NSCLC(非小細胞肺癌)。在一些實施方案中，哺乳動物肺癌是SCLC(小細胞肺癌)。在本發(fā)明方法的進一步實施方案中，所述哺乳動物是人，且人可以是用于治療肺癌的ROS抑制性治療劑的候選者。所述人候選者可以是目前用ROS激酶抑制劑治療或者考慮用ROS激酶抑制劑治療的患者。在另一個實施方案中，所述哺乳動物是大型動物，諸如馬或牛，而在其他實施方案中，所述哺乳動物是小型動物，諸如狗或貓，已知其均發(fā)展肺癌，諸如NSCLC和SCLC。如在整個說明書中所用，術語“生物樣品”以其最廣的含義使用，并且指任何疑似包含具有ROS激酶活性的生物樣品，包括但不限于，ROS融合多肽或全長ROS蛋白(具有或不具有信號肽序列)或其具有ROS激酶活性的片段。生物樣品包括但不限于，唾液、粘液、淚液、血液、循環(huán)腫瘤細胞、血清、組織、骨髓、淋巴/間質液、口腔細胞、粘膜細胞、腦脊髓液、精液、排泄物、血漿、尿液、細胞懸浮液、或細胞和病毒的懸浮液及其提取物，以及可以包括細胞、分離自細胞的染色體(例如，一定范圍的中期染色體)、基因組DNA(在溶液中或結合于固體載體諸如用于Southern分析)、RNA(在溶液中或結合于固體載體諸如用于northern分析)、cDNA(在溶液中或結合于固體載體)。在一些實施方案中，生物樣品包含疑似為癌性的肺細胞。任何包含來自哺乳動物癌癥的細胞(或細胞提取物)的生物樣品適合于本發(fā)明的方法。在一個實施方案中，生物樣品包括從腫瘤活組織檢查或腫瘤切除術獲得的細胞。活組織檢查物或切除術可以按照標準臨床技術從哺乳乳動物器官的原發(fā)性腫瘤或者從已轉移到其他組織的繼發(fā)性腫瘤獲得。在另一個實施方案中，生物樣品包括從來源于腫瘤的細針頭穿刺物獲得的細胞，獲得這些穿刺物的技術是本領域眾所周知的(參見Cristallini等人，ActaCytol.36(3):416-22(1992))。生物樣品還可以包括從滲出液諸如胸膜滲出液獲得的細胞。已知在許多晚期肺癌(包括NSCLC)患者中形成胸膜滲出液(形成在胸腔中的肺外側并且包含癌細胞的液體)，并且此類滲出液的存在是不良結果和短存活時間的預兆。已描述了用于獲得胸膜滲出液的標準技術并且在本領域是眾所周知的(參見Sahn,ClinChestMed.3(2):443-52(1982))。生物樣品可以包括從支氣管肺泡灌洗獲得的細胞。支氣管肺泡灌洗是標準醫(yī)療程序，其中使支氣管鏡通過口腔或鼻腔到肺并且將流體噴入肺部的一小部分，然后重新收集用于檢查。在一些實施方案中，生物樣品包括循環(huán)腫瘤細胞。循環(huán)腫瘤細胞(“CTC”)可以被純化，例如，使用以商標Vita-Assays?、Vita-Cap?、和CellSearch?(商購自Vitatex,LLC(aJohnsonandJohnsoncorporation))銷售的試劑盒和試劑。描述了分離CTC的其他方法(參見，例如，PCT公開號WO/2002/020825,Cristofanilli等人,NewEngl.J.ofMed.351(8):781-791(2004),和Adams等人,J.Amer.Chem.Soc.130(27):8633-8641(July2008))。在一個具體實施方案中，循環(huán)腫瘤細胞(“CTC”)可以被分離并鑒定為源自肺。因此，本發(fā)明提供方法用于分離CTC，然后以一種或多種測定形式篩選CTC以鑒定具有ROS激酶活性的多肽或編碼其的核酸分子(例如，全長ROS多肽或多核苷酸或ROS融合多肽或多核苷酸)在CTC中的存在。按照標準技術，本文所述生物樣品的細胞提取物可以制成粗制品，或經過部分(或者完全)純化，并用于本發(fā)明方法?？商娲兀毎纳飿悠犯鶕藴史椒ㄖT如以下描述的那些(還參見，例如，Ausubel等人，同上)可以用于在測定形式，諸如體外激酶測定法、ELISA測定法、免疫組織化學(IHC)、流式細胞術(FC)、和免疫熒光(IF)、免疫組織化學(IHC)、熒光原位雜交(FISH)和聚合酶鏈式反應(PCR)。此類全細胞測定法是有利的，因為它們將腫瘤細胞樣品的操作降到最低程度，因此降低了改變細胞的體內信號傳遞/激活狀態(tài)和/或引入人工信號的風險。全細胞測定法還是有利的，因為它們僅在腫瘤細胞中、而不是腫瘤和正常細胞的混合物中表征表達和信號傳遞。因此，可用于實施本發(fā)明方法中的生物樣品可以從任何哺乳動物獲得，在所述哺乳動物中，特征在于存在具有ROS激酶活性的多肽(例如，全長ROS多核苷酸或多肽或ROS融合多核苷酸或多肽)的癌癥或疑似癌癥存在或可能存在或發(fā)展。如本文所使用，關于癌癥(或疑似癌癥)和所示分子(例如，具有ROS激酶活性的多肽)的短語“特征在于”是指其中與另一種癌癥或正常組織(其中全長ROS和/或具有ROS激酶活性的多肽的此類易位、異常表達不存在)相比其中存在基因易位或突變(例如，引起全長ROS的異常表達)和/或表達的具有ROS激酶活性的多肽的癌癥(或疑似癌癥)。全長ROS和/或具有ROS激酶活性的多肽的此類易位、異常表達的存在可以，全部或部分，驅動(即，刺激或引起)此類癌癥或疑似癌癥的生長和存活。因此，被鑒定為包含具有ROS激酶活性的多肽或編碼其的多核苷酸(例如，全長ROS多肽或多核苷酸或ROS融合多肽或多核苷酸)的來自患者的任何生物樣品(例如，CTC、胸腔積液、針穿刺物、腫瘤活檢等..)可以表明該患者的始發(fā)性癌癥(例如，肺癌諸如NSCLC或SCLC)被具有ROS激酶活性的多肽驅動，并且因此可能對包含至少一種ROS激酶抑制性治療劑的組合物響應。如本文所使用，“可能響應”是指癌癥更可能顯示對ROS抑制性治療劑(例如，在與ROS抑制性治療劑接觸或用ROS抑制性治療劑處理之后)響應的生長遲緩或停止。在一些實施方案中，可能對ROS抑制性治療劑響應的癌癥是響應于ROS抑制性治療劑而死亡(例如，腫瘤細胞細胞凋亡)的癌癥。在評估包含來自哺乳動物癌癥腫瘤的細胞的生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽(或編碼其的多核苷酸)的存在時，可以期望采用代表其中不存在此類具有ROS激酶活性的多肽的細胞(例如，健康肺組織)的對照樣品用于比較目的。理想地，對照樣品包含來自特定癌癥(例如，肺癌)的亞型的細胞，所述亞型代表其中不存在具有ROS激酶活性的多肽(或編碼其的多核苷酸)的亞型。因此，對照樣品與試驗生物樣品中水平的比較可以確定是否存在突變多核苷酸和/或多肽?？商娲?，因為具有ROS激酶活性的多肽(或編碼其的多核苷酸)可能不存在于大多數癌癥中，所以類似地不表達具有ROS激酶活性的多肽(或編碼其的多核苷酸)的任何組織可以用作對照。下述方法對于特征在于具有ROS激酶活性的多肽的存在的癌癥、以及與其有關的治療決策將具有有價值的診斷應用。例如，生物樣品可以獲自以下受試者，所述受試者先前并沒有診斷為具有特征在于具有ROS激酶活性的多肽的存在的癌癥，也還沒有經受針對此類癌癥的治療，并且該方法用來診斷性鑒定此類受試者中的腫瘤為屬于其中存在/表達具有ROS激酶活性的多肽(或編碼其的多核苷酸)的腫瘤亞型(例如，NSCLC或SCLC)?？商娲兀飿悠房梢垣@得自已經被診斷為具有特征在于存在一種類型的激酶諸如EFGR的癌癥并且已經接受用于治療此類癌癥的治療諸如EGFR抑制劑治療(例如，Tarceva?、Iressa?)的受試者，并且采用本發(fā)明的方法以鑒定受試者的腫瘤是否特征還在于存在具有ROS激酶活性的多肽(或編碼其的多核苷酸)，諸如全長ROS蛋白或許多ROS融合多肽之一(例如，SLC34A2-ROS(S))，并且因此可能對現有治療完全響應和/或可替代或額外的ROS抑制性治療是否是期望的或保證的。本發(fā)明的方法還可以用于監(jiān)測在用包含ROS抑制性治療劑或治療劑組合的組合物對受試者進行治療以后表達ROS激酶活性的多肽的癌癥的發(fā)展或抑制。此類診斷測定法可以在初步評價或外科檢視程序之后或之簽進行。本發(fā)明的鑒定方法可以有利地用作診斷方法來確定患有特征在于具有ROS激酶活性的多肽(諸如，ROS融合蛋白(例如，FIG-ROS(S))的存在的癌癥的患者，所述癌癥諸如肺癌(例如，非小細胞肺癌)，所述患者將最可能對目標在于抑制ROS激酶活性的治療劑響應。選擇此類患者的能力也將用于臨床評估未來ROS抑制性治療劑的功效以及用于給予患者的此類藥物的未來處方。選擇性鑒定其中存在具有ROS激酶活性的多肽(或編碼其的多核苷酸)，諸如ROS融合蛋白或ROS融合多核苷酸，或全長ROS多肽或全長ROS多核苷酸的癌癥的能力使得能夠實現重要的新方法，其用于精確地鑒定此類腫瘤(用于診斷目的)，以及獲得信息，當作為單藥劑施用以治療癌癥時，該信息可用于確定此類腫瘤是否可能對ROS抑制性治療劑組合物響應，或是否可能部分或完全地對靶向不同激酶的抑制劑不響應。如本文所使用，“癌癥”或“癌性”是指與相同細胞類型的正常(即，非癌性)細胞相比顯示異常生長的細胞。例如，癌性細胞可以是轉移性或非轉移性的。癌性細胞也可以顯示缺乏接觸抑制，其中該相同細胞類型的正常細胞顯示了接觸抑制。在一些實施方案中，癌癥是肺癌(例如，非小細胞肺癌或小細胞肺癌)。如本文所使用，“疑似癌癥”(如在“疑似哺乳動物肺癌”)或“疑似癌性的組織”是指與疑似癌癥相同細胞或組織類型的正常細胞或組織相比具有一些異常特征(例如，增生性或缺乏接觸抑制)、但其中細胞或組織尚未由醫(yī)生或病理學家證實作為癌性的細胞或組織。在一些實施方案中，本發(fā)明的各種方法可以用本領域技術人員已知的各種不同測定形式進行。一些方法的非限制性實例包括免疫測定以及肽和核苷酸測定。免疫測定可用于實施本發(fā)明方法的免疫測定可以是均質免疫測定(homogenousimmunoassay)或者異質免疫測定(heterogeneousimmunoassay)。在均質免疫測定中，免疫反應通常涉及特異性試劑(例如ROS特異性抗體)、標記的分析物和目標生物樣品。在抗體結合于標記分析物以后，產生自標記的信號被直接或間接地修飾。在均質溶液中進行免疫反應及其程度的檢測兩者?？梢允褂玫拿庖呋瘜W標記包括自由基、放射同位素、熒光染料、酶、噬菌體、輔酶等。還可以有利地使用半導體納米晶體標記或者“量子點”，其制備和使用已被詳細描述。通常參見，K.Barovsky,Nanotech.Law&Bus.1(2):Article14(2004)和本文引述的專利。在異質測定方法中，所述材料通常是生物樣品、結合試劑(例如抗體)和用于產生可檢測信號的適宜方式?？梢允褂孟挛倪M一步描述的生物樣品?？贵w通常固定到載體上，諸如珠、平板或載片，并且在液相中與疑似含有抗原的樣品接觸。然后將載體從液相中分離，檢測支持相或液相使用產生可檢測信號的手段產生的可檢測信號。信號與生物樣品中分析物的存在相關。產生可檢測信號的手段包括使用放射性標記、熒光標記、酶標記、量子點等。例如，如果待檢測的抗原含有第二個結合位點，那么結合該位點的抗體可以綴合可檢測基團，并在分離步驟前將所述抗體加入到液相反應溶液中。在固相載體上可檢測基團的存在表示在檢測的樣品中存在抗原。適當的免疫測定的實例為放射免疫測定、免疫熒光方法、酶聯免疫測定等?？捎糜谶M行本文公開的方法的免疫測定形式及其變體為本領域眾所周知。通常參見E.Maggio,Enzyme-Immunoassay,(1980)(CRCPress,Inc.,BocaRaton,Fla.);還參見例如美國專利號4,727,022(Skold等人，“MethodsforModulatingLigand-ReceptorInteractionsandtheirApplication”);美國專利號4,659,678(Forrest等人，“ImmunoassayofAntigens”);美國專利號4,376,110(David等人，“ImmunometricAssaysUsingMonoclonalAntibodies”)。適合形成試劑-抗體復合物的條件為本領域技術人員眾所周知。參見同上。ROS特異性抗體可用于“雙位點(two-sites)”或“三明治”測定法中，其中單一雜交瘤細胞系作為標記的單克隆抗體和結合的單克隆抗體兩者的來源。此類測定法描述于美國專利號4,376,110?？蓹z測試劑的濃度應當足夠，從而使得具有ROS激酶活性的蛋白(例如，全長ROS蛋白或ROS融合多肽)的結合與背景相比可以被檢測到?？捎糜趯嵤┍疚墓_的方法中的抗體可以是按照已知技術諸如沉淀綴合到適合用于診斷測定的固體載體上(例如由材料諸如膠乳或聚苯乙烯形成的珠、板、載片或孔)。同樣，抗體或者其他結合試劑結合試劑也可以按照已知技術綴合到可檢測基團諸如放射性標記(例如35S、125I、131I)、酶標記(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)和熒光標記(例如熒光素)?；诩毎臏y定法，諸如流式細胞術(FC)、免疫組織化學(INC)或者免疫熒光(IF)尤其適合實施本發(fā)明方法，因為這些測定形式適合臨床，能在體內檢測具有ROS激酶活性的蛋白(例如，全長ROS多肽或ROS融合多肽)的表達，并能避免由于操縱從例如腫瘤樣品獲得的細胞獲得提取物時導致的人為活性變化的風險。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法通過用流式細胞術(FC)、免疫組織化學(IHC)或者免疫熒光(IF)測定形式進行?？梢栽谟冒邢蛞种芌OS激酶活性的藥物處理前、處理中和處理后用流式細胞術(FC)檢測哺乳動物腫瘤中具有ROS激酶活性的多肽的表達。例如，可以通過流式細胞術分析來自細針穿刺物的腫瘤細胞的具有ROS激酶活性的多肽或編碼其的多核苷酸(例如，全長ROS多核苷酸或多肽或者ROS融合多核苷酸或多肽)的表達和/或激活、以及鑒定癌細胞類型的標記等(如果希望如此)?？梢园凑諛藴史椒ㄟM行流式細胞術。參見例如，Chow等人,Cytometry(CommunicationsinClinicalCytometry)46:72–78(2001)。簡而言之，例如可采用以下方案進行細胞計數分析：用2％多聚甲醛在37℃固定細胞10分鐘，然后在90％甲醇在冰上透化30分鐘。然后用第一抗體(例如，全長ROS特異性或ROS融合多肽特異性抗體)染色細胞、洗滌并用熒光標記的第二抗體標記。然后按照所使用儀器的特定方案用流式細胞儀(例如BeckmanCoulterFC500)分析細胞。此類分析將鑒定腫瘤中表達的全長ROS或ROS融合多肽的水平。在用ROS抑制性治療劑處理腫瘤后，類似的分析將揭示表達全長ROS腫瘤或表達ROS融合多肽的腫瘤對靶向ROS激酶抑制劑的響應?？梢栽谟冒邢蛞种芌OS激酶活性的治療劑處理前、處理中和處理后使用免疫組織化學(IHC)染色檢測哺乳動物癌癥(例如，肺癌)中具有ROS激酶活性的多肽的表達和/或激活狀態(tài)?？梢园凑毡娝苤夹g進行IHC。參見例如，Antibodies:ALaboratoryManual,Chapter10,Harlow&LaneEds.,ColdSpringHarborLaboratory(1988)。簡而言之，例如石蠟包埋的組織(例如來自活組織檢查的腫瘤組織)通過對組織切片用二甲苯然后用乙醇脫蠟用于免疫組織化學染色；先用水然后用PBS水化；通過在檸檬酸鈉緩沖液中加熱載片暴露抗原；在過氧化氫中孵育切片；在封閉溶液中封閉；將載片在第一抗體(例如，ROS-特異性抗體)和第二抗體中孵育；最后使用抗生物素蛋白/生物素方法檢測。在用靶向抑制ROS激酶活性的治療劑處理前、處理中和處理后，還可以使用免疫熒光(IF)測定法確定哺乳動物癌癥中具有ROS激酶活性的多肽(例如，全長ROS多肽或ROS融合多肽)的表達和/或激活狀態(tài)?？梢园凑毡娝苤夹g進行IF。參見，例如，J.M.polak和S.VanNoorden(1997)IntroductiontoImmunocytochemistry,第2版;RoyalMicroscopySocietyMicroscopyHandbook37,BioScientific/Springer-Verlag。簡而言之，例如患者樣品可以先用多聚甲醛然后用甲醇固定后，在封閉溶液諸如馬血清中封閉，與針對(即特異性結合)具有ROS激酶活性的多肽(例如CD74-ROS融合多肽)的第一抗體孵育，隨后用熒光染料諸如Alexa488標記的第二抗體孵育，然后用落射熒光顯微鏡分析。用于測量具有ROS激酶活性的多肽的表達和/或活性的各種各樣的其他方案，包括酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、Western印跡分析、體外激酶測定、以及熒光激活細胞分選術(FACS)，在本
技術領域：
是已知的，并且提供用于診斷具有ROS激酶活性的多肽(例如，全長ROS、或ROS融合多肽諸如FIG-ROS(S)融合多肽)存在的基礎。通過獲自正常哺乳動物受試者(優(yōu)選人)的體液或細胞提取物在適合于復合物形成的條件下與特異性結合全長ROS多肽的抗體組合，來建立全長ROS多肽表達的正常或標準值?？梢酝ㄟ^各種方法，但優(yōu)選通過光度法，來定量標準復合物形成的量。將在受試者、對照、以及來自活檢組織的疾病樣品中表達的全長ROS多肽的量與標準值比較。標準和受試者值之間的偏差建立用于診斷疾病的參數。當然，如本文所述，由于在癌性肺組織中發(fā)現具有ROS激酶活性的蛋白(例如，FIG-ROS(S)或SLC34A2-ROS(S))，所以預測沒有正常肺組織生物樣品含有這些具有ROS激酶活性的蛋白(或編碼其的多核苷酸)。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測生物樣品中編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌，所述方法包括以下步驟：(a)獲得來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品并且(b)利用特異性結合編碼所述具有ROS激酶活性的多肽的所述多核苷酸來確定所述多核苷酸是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在編碼所述具有ROS激酶活性的多肽的所述多核苷酸?？梢酝ㄟ^任何標準方法評估編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的存在。此外，這些方法可以與方法組合以檢測具有如上所述的ROS激酶活性的多肽。核苷酸測定。用于實施本發(fā)明方法的全長ROS多核苷酸或ROS融合多核苷酸特異性結合試劑還可以是能直接雜交并檢測生物樣品中的融合或截短多肽表達轉錄物的mRNA、寡核苷酸或DNA探針。此類探針本文詳細討論。簡而言之，例如福爾馬林固定的、石蠟包埋的(PPFE)患者樣品可以用熒光素標記的RNA探針探測，隨后用甲酰胺、SSC和PBS洗滌，并且用熒光顯微鏡分析。編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸還可以用于診斷目的?？梢允褂玫亩嗪塑账岚ü押塑账嵝蛄?、反義RNA和DNA分子和PNA。該多核苷酸可以用來檢測和定量在活檢組織中的基因表達，其中具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或全長ROS)的表達可以與疾病有關。診斷測定可以用來區(qū)別具有ROS激酶活性的多肽的缺少、存在、以及過量表達，以及在治療性干預過程中監(jiān)測具有ROS激酶活性的多肽的水平的調節(jié)。在一個實施方案中，可以使用能夠檢測多核苷酸序列包括編碼具有ROS激酶活性的多肽(例如，編碼ROS融合多肽或全長ROS蛋白)的基因組序列的PCR引物雜交以鑒定編碼具有ROS激酶活性的此類多肽的核酸序列。無論探針是來源于高度特異的區(qū)域，例如融合連接的10個獨特核苷酸，還是來源于特異性較低的區(qū)域，例如3′編碼區(qū)，探針的特異性以及雜交或擴增(最強、高、中等或低)嚴格性將決定探針是否僅鑒定編碼ROS激酶多肽(例如，全長ROS或ROS融合蛋白)的天然存在序列、等位基因或相關序列。探針還可以用于檢測相關序列，并且應當優(yōu)選含有至少50％的任一個突變ROS多肽編碼序列的核苷酸。本發(fā)明的雜交探針(例如，FISH探針或Southern或Northern印跡探針)可以是DNA或RNA并且衍生自SEQIDNO：_______的核苷酸序列[ROS和所有ROS融合蛋白的DNA序列]。在其中具有ROS激酶活性的多肽是ROS融合蛋白的一些實施方案中，雜交探針涵蓋融合連接，或來自包括天然存在的ROS基因和融合伴侶基因(例如SLC34A2、FIG、或CD74)的啟動子、增強子元件和內含子的基因組序列。ROS融合多核苷酸(即，編碼ROS融合多肽諸如FIG-ROS(S)或CD74-ROS的多核苷酸)或全長ROS多核苷酸可以用于以下方法中以檢測改變的具有ROS激酶活性的多肽表達，所述方法包括Southern或者Northern分析、斑點印跡或者其他基于膜的技術；PCR技術；或者浸測法(dipstick)、針(pin)、ELISA或者使用來自患者活組織檢查的體液或者組織的芯片分析。此類定性或者定量方法是本領域所眾所周知的。在特定方面，編碼具有ROS激酶活性的多肽的核苷酸序列可以用于檢測各種肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌)的激活或者誘導的測定法中。編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸可以通過標準方法可檢測地標記，并在適合形成雜交復合物的條件下加入到來自患者的體液或組織樣品中。在孵育適當時間后，洗滌樣品并定量信號，與標準值比較。如果活組織檢查的樣品或者提取的樣品中信號量與可比較的對照樣品相比明顯改變，則核苷酸序列與樣品中的核苷酸序列雜交，并且樣品中編碼具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或全長ROS多肽)的核苷酸序列水平發(fā)生改變表示存在相關疾病。此類測定法還可用于評價在動物研究、臨床試驗或者單個患者的監(jiān)測治療中特定治療方案的效力。在一些實施方案中，使用PCR測定形式執(zhí)行本發(fā)明的方法。對本領域技術人員而言，聚合酶鏈式反應(PCR)是標準的。參見例如，MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)。PCR引物(也稱為寡聚物)可以是化學合成的、酶促產生的或者從重組來源產生的。寡聚物優(yōu)選由兩種核苷酸序列組成，一種具有有義方向(5′到3′)，而另一種具有反義方向(3′到5′)，在最佳條件下使用以鑒定特定基因或條件。相同的兩個寡聚體、寡聚體的嵌套集合、或甚至寡聚體的簡并合并物可以在較低嚴格的條件下用于檢測和/或定量緊密相關的DNA或RNA序列?？梢允褂枚烤哂蠷OS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或者全長ROS多肽)表達的方法包括放射性標記或者生物素標記核苷酸、共擴增對照核酸以及實驗結果被內插到其上的標準曲線(Melby等人,J.Immunol.Methods,159：235-244(1993);Duplaa等人Anal.Biochem.229-236(1993))。可以通過以ELISA形式進行測定來加速多個樣品的定量速度，其中以不同稀釋度提供目標寡聚體，以及分光光度或比色反應給出快速定量。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以使用編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸產生雜交探針，所述雜交探針可用于對天然存在的基因組序列作圖?？梢允褂帽娝苤募夹g將所述序列作圖至特定染色體或者染色體的特異區(qū)域。此類技術包括熒光原位雜交(FISH)、FACS或者人工染色體構建諸如酵母人工染色體、細菌人工染色體、細菌P1構建或者單染色體cDNA文庫，這些被綜合概括在Price,C.M.,BloodRev.7:127-134(1993),和Trask,B.J.,TrendsGenet.7:149-154(1991)中。在進一步實施方案中，在本發(fā)明的方法中使用熒光原位雜交(FISH)(如在Verma等人HumanChromosomes:AManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork,N.Y.(1988)中所述)。在一些實施方案中，FISH測定可以與其他物理染色體作圖技術和基因圖譜數據關聯。FISH技術是眾所周知的(參見例如，美國專利號5,756,696;5,447,841;5,776,688;和5,663,319)?；驁D譜數據的實例可以在1994GenomeIssueofScience(265:1981f)中找到。在物理染色體圖譜上編碼ROS蛋白的基因，和/或在ROS融合多肽的情況下，編碼ROS融合蛋白的融合伴侶的基因(例如，FIG基因、SLC34A2基因或CD74基因)的位置和特定疾病、或特定疾病的傾向性之間的相關性可以有助于限定與遺傳疾病有關的DNA區(qū)。本發(fā)明的核苷酸序列可以用來檢測正常、載體、或者感染個體之間的基因序列的差異。染色體制備物的原位雜交和物理作圖技術諸如使用建立的染色體標記的連鎖分析可用于延伸基因圖譜。將基因放置在另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)的染色體上，經?？梢越沂鞠嚓P標記，即使特定人染色體的數目或臂是未知的。通過物理作圖，可以將新序列分配給染色體臂、或其部分。這為研究者提供有價值的信息，以便利用定位克隆或其他基因發(fā)現技術來尋找疾病基因。一旦通過基因連鎖將疾病或綜合征粗略地定位到特定基因組區(qū)，例如AT到11q22-23(Gatti等人，Nature336：577-580(1988))，任何序列作圖到該區(qū)域可以表示用于進一步研究的相關或調節(jié)基因。本發(fā)明的核苷酸序列還可以用來檢測在正常、載體、或受影響個體之間起因于易位、倒置等的染色體位置差異。應當理解的是，所有檢測編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸(例如，全長ROS或ROS融合多核苷酸諸如FIG-ROS(S))的方法，可以與其他檢測具有ROS激酶活性的多肽或編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的方法組合。例如，在生物樣品中的遺傳物質中FIG-ROS(S)融合多核苷酸的檢測(例如，循環(huán)腫瘤細胞中的FIG-ROS(S))可以隨后為Western印跡分析或免疫組織化學(IHC)分析樣品的蛋白，以確定FIG-ROS(S)多核苷酸實際上是否表達為生物樣品中的FIG-ROS(S)融合多肽。此類Western印跡或IHC分析可以使用特異性結合由檢測到的FIG-ROS(S)多核苷酸編碼的多肽的抗體進行，或者該分析可以使用特異性結合全長FIG(例如，結合蛋白的N-末端)或全長ROS(例如，結合ROS的激酶結構域中的表位)的抗體來進行。此類測定是本領域中已知的(參見，例如，美國專利7,468,252)。在另一個實例中，Dako的CISH技術允許相同組織切片上的顯色原位雜交和免疫組織化學。對于CISH和FISH的比較，參見Elliot等人,BrJBiomedSci2008;65(4):167-171,2008。本發(fā)明的另一個方面提供了用于診斷患有由ROS激酶驅動的肺癌或疑似肺癌的患者的方法。該方法包括：將所述肺癌或疑似肺癌的生物樣品(其中所述生物樣品包含至少一種核酸分子)與探針接觸，所述探針在嚴格條件下與核酸分子雜交，所述核酸分子編碼具有ROS激酶活性的多肽，諸如全長ROS多核苷酸或ROS融合多核苷酸(例如，FIG-ROS(S)融合多核苷酸，FIG-ROS(L)融合多核苷酸，FIG-ROS(VL)融合多核苷酸，SLC34A2-ROS(S)融合多核苷酸，SLC34A2-ROS(VS)融合多核苷酸，SLC34A2-ROS(L)融合多核苷酸或CD74-ROS融合多核苷酸)，且其中所述探針與所述生物樣品中的至少一種核酸分子的雜交將所述患者鑒定為患有由ROS激酶驅動的肺癌或疑似肺癌。本發(fā)明的又另一個方面提供了用于診斷患有由ROS激酶驅動的肺癌或疑似肺癌的患者的方法。該方法包括將所述肺癌或疑似肺癌的生物樣品(其中所述生物樣品包含至少一種多肽)與試劑接觸，所述試劑特異性結合具有ROS激酶活性的多肽(例如，FIG-ROS(S)融合多肽、FIG-ROS(L)融合多肽、FIG-ROS(VL)融合多肽、SLC34A2-ROS(S)融合多肽、SLC34A2-ROS(VS)融合多肽、SLC34A2-ROS(L)融合多肽、或CD74-ROS融合多肽)，其中所述試劑與所述生物樣品中的至少一種多肽的特異性結合將所述患者鑒定為患有由ROS激酶驅動的肺癌或疑似肺癌。在各個實施方案中，將肺癌或疑似肺癌鑒定為由ROS激酶驅動將具有該肺癌或疑似肺癌的患者鑒定為可能對ROS抑制性治療劑響應。為了提供特征在于具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽)的表達的疾病(例如，肺癌)的診斷基礎，可以建立表達的正?；驑藴矢艣r。這可以通過在適合于雜交或擴增的條件下，使獲自正常受試者(動物或人)的體液或細胞提取物與編碼具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或全長ROS多肽)的多核苷酸序列或其片斷相組合來完成?？梢酝ㄟ^比較獲自正常受試者的值與來自使用已知量的基本上純化多核苷酸的實驗的值而定量標準雜交。從正常樣品獲得的標準值可以與從有患有疾病癥狀的患者的樣品獲得的值比較。標準值和受試者的值之間的偏差用于確定存在疾病。一旦疾病被證實且啟動治療方案，則定期重復雜交測定法以評價患者表達水平是否開始接近在正?；颊咧杏^察的水平。獲自連續(xù)分析的結果可以用于表示經歷幾天到幾個月的一段時間內的治療效果?？梢源_立具有ROS激酶活性的多肽的表達或活性水平的類似的正?；驑藴矢艣r。例如，對于蛋白表達，所述概況可以使用特異性結合該多肽的試劑來確立，也可以使用，例如，特異性結合該多肽(例如，結合全長ROS或結合ROS融合多肽的融合連接)的抗體并且將正常受試者中的結合水平與有肺癌癥狀的患者中的結合水平相比較來確立。類似地，對于ROS激酶活性水平，與采集自有肺癌癥狀的患者的樣品相比，可以在采集自正常患者的樣品上進行標準體外激酶測定(參見Ausubel等人，同上；Sambrook等人，同上)。在各個實施方案中，使用以下試劑來確定ROS表達或激酶活性的抑制劑：特異性結合ROS融合多核苷酸的試劑，特異性結合ROS融合多肽的試劑，特異性結合全長ROS多核苷酸的試劑或特異性結合全長ROS多肽的試劑。在一些額外的實施方案中，使用以下試劑來確定ROS表達或激酶活性的抑制：特異性結合全長FIG多核苷酸的試劑，特異性結合全長FIG多肽的試劑，特異性結合全長SLC34A2多核苷酸的試劑，或特異性結合全長SLC34A2多肽的試劑，特異性結合全長CD74多核苷酸的試劑，或特異性結合全長CD74多肽的試劑。在各個實施方案中，用包含治療劑的組合物抑制所述多肽的表達和/或活性，所述治療劑選自克里唑替尼(也稱為PF-02341066)、NVTTAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、WHI-P131和WHI-P154。如本文所使用，“ROS抑制劑”或“ROS抑制性化合物”是指任何包含一種或多種化合物(化學的或生物的)的組合物，其直接或間接地抑制具有ROS激酶活性的多肽的表達和/或活性。此類抑制可以在體外或在體內?！癛OS抑制性治療劑”或“ROS-抑制性治療劑”是指用作用來治療具有特征在于存在具有ROS激酶活性的多肽諸如本文所述的異常表達的全長ROS蛋白或ROS融合多肽(例如，FIG-ROS融合蛋白之一)的肺癌(例如，NSCLC或SCLC)的患者的治療劑的ROS-抑制性化合物。在本發(fā)明的一些實施方案中，ROS抑制劑是特異性結合ROS融合多肽(例如，FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)、FIG-ROS(XL)、SLC34A2-ROS(VS)、SLC34A2-ROS(S)、SLC34A2-ROS(L)、或CD74-ROS)的試劑，特異性結合全長ROS多肽的試劑，靶向ROS融合多核苷酸(例如，SLC34A2-ROS(L)融合多核苷酸)的siRNA或靶向全長ROS多核苷酸的siRNA。ROS抑制性治療劑可以例如是激酶抑制劑，諸如小分子或抗體抑制劑。它可以是對多種不同激酶具有活性的泛激酶(pan-kinase)抑制劑，或者是激酶特異性抑制劑。由于ROS、ALK、LTK、InsR、和IGF1R屬于酪氨酸激酶的相同家族，所以它們可能在激酶結構域共有相似的結構。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的ROS抑制劑也抑制ALK激酶、LTK激酶、胰島素受體或IGF1受體的活性。ROS抑制性化合物在下文進一步詳細討論?？梢栽谟靡种苿┲委熐盎蚝螳@取患者生物樣品，然后用上述方法分析抑制劑對ROS激酶活性的生物作用，包括下游底物蛋白的磷酸化。此類藥效動力學分析可以用于確定藥物的生物活性劑量，其優(yōu)選是最大耐受劑量。此類信息對于通過闡述藥物作用機制請求獲得藥物批準是有用的。在另一個實施方案中，所述多肽的表達和/或活性被包含ROS抑制性治療劑的組合物所抑制，所述ROS抑制性治療劑選自PF-02341066)、NVTTAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、WHI-P131和WHI-P154。根據本發(fā)明，具有ROS激酶活性的多肽可以存在于人肺癌的至少一種亞型中。因此，可以通過抑制在此類癌癥中ROS激酶的活性體內抑制其中表達具有ROS激酶活性的多肽的哺乳動物癌癥的發(fā)展。特征在于表達具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽或異常表達全長ROS多肽)的癌癥中的ROS活性可以通過將癌癥與治療有效量的ROS抑制性治療劑相接觸而抑制。因此，本發(fā)明部分提供了通過將癌癥(例如，腫瘤)與治療有效量的ROS-抑制性治療劑接觸而抑制肺癌中ROS激酶的表達和/或活性從而抑制表達具有ROS激酶活性的多肽的肺癌的進展的方法。如本文所使用，“治療有效量”或“藥學有效量”是指與未處理的癌癥或疑似癌癥相比，通過減緩癌癥或疑似癌癥的生長、降低癌癥或疑似癌癥的量、減少癌癥或疑似癌癥的細胞數量、或殺死癌癥而足以抑制癌癥(或其細胞)或疑似癌癥(或其細胞)的ROS抑制性治療劑的量。ROS抑制性治療劑可以是包含至少一種ROS抑制劑的任何組合物。此類組合物還包括只包含單一ROS抑制性化合物的組合物，以及包含多種治療劑(包括針對其他RTK的那些)的組合物，其還可以包括非特異性治療劑如化療劑或一般轉錄抑制劑。在一些實施方案中，可用于實施本發(fā)明方法的ROS抑制性治療劑是靶向小分子抑制劑。小分子靶向抑制劑是一類典型抑制其目標酶活性的分子，其通過特異性并經常可逆地結合酶的催化位點和/或結合ATP結合裂縫或者能阻止該酶形成對于其活性必需的構型的酶內部的其他結合位點而抑制其目標酶活性。因為在ROS激酶和ALK激酶之間的結構和功能的緊密相似性，預測任何ALK激酶抑制劑也抑制ROS激酶。此外，如下文實施例中所述，由ROS激酶驅動的肺癌不會由ALK激酶驅動。同樣地，由ALK激酶驅動的肺癌不會由ROS激酶驅動。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了治療患者肺癌的方法，所述方法包括：檢測來自患有或疑似患有肺癌的患者的肺的生物樣品中多肽的存在，所述多肽選自具有ROS激酶活性的多肽和具有ALK激酶活性的多肽；并且給患者施用有效量的ALK/ROS抑制性治療劑，從而治療受試者的肺癌。在一個進一步方面，本發(fā)明提供了用于將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者的方法，所述方法包括：將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合具有ROS激酶活性的多肽的第一試劑和特異性結合具有ALK激酶活性的多肽的第二試劑接觸，并且檢測所述第一試劑或所述第二試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述第一試劑或所述第二試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑒定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者。在各個實施方案中，第一試劑特異性結合全長ROS激酶蛋白。在各個實施方案中，第二試劑特異性結合全長ALK激酶蛋白。在各個實施方案中，第一試劑特異性結合ROS激酶蛋白的激酶結構域。在各個實施方案中，第二試劑特異性結合ALK激酶蛋白的激酶結構域。如本文所使用，“具有ALK激酶活性的蛋白”是指保留ALK全部激酶結構域且因此具有ALK激酶活性的任何多肽。具有ALK激酶活性的非限制性多肽包括全長ALK(參見美國專利號5,770,421)、NPM-ALK、ALO17-ALK、TFG-ALK、MSN-ALK、TPM3-ALK、TPM4-ALK、ATIC-ALK、MYH9-ALK、CLTC-ALK、SEC31L1-ALK、RANBP2-ALK、CARS-ALK、EML4-ALK、KIF5B-ALK、和TFG-ALK(參見例如，Palmer等人,Biochem.J.420(3):345-361,2009(和其中引用的文章),Rikova等人,Cell131:1190-1203,2007;Soda等人,Nature448:561-566,2007;Morris等人,Science263:1281-1284,1994;Du等人,J.Mol.Med84:863-875,2007;Panagopoulos等人,Int.J.Cancer118:1181-1186,2006;Cools等人,GenesChromosomesCancer34:354-362,2002;Debelenko等人,Lab.Invest.83:1255-1265,2003;Ma等人,GenesChromosomesCancer37:98-105,2003;Lawrence等人,Am.J.Pathol.157:377-384,1995;Hernandez等人,Blood94:3265-3268,1999;TakeuchiK.,ClinCancerRes.15(9):3143-3149,2009;Tort等人,Lab.Invest.81:419-426,2001;Trinei等人,CancerRes.60:793-798,2000;和Touriol等人,Blood95:3204-3207,2000。也參見Pulford等人,JournalofCellularPhysiology,199:330-358,2004。在各個實施方案中，受試者是人。在各個實施方案中，肺癌是非小細胞肺癌或者是小細胞肺癌。一種有用的小分子激酶抑制劑是Pfizer,Inc.的化合物克里唑替尼(也稱為PF-02341066)，其抑制ALK和MET激酶活性，并且其特性已經得到很好地描述。參見You等人，CancerRes67:4408(2007)和美國專利公開號2008/0300273?？梢园邢騌OS的其他小分子激酶抑制劑包括TAE-684(來自Novartis)、CH5424802(Chugai;參見Sakamoto,H.等人,CancerCell19:679-690,2011)、AP26113(AriadPharmaceuticals,Inc.)、和CEP-14083,CEP-14513、和CEP-11988(Cephalon;參見Wan等人,Blood107:1617-1623,2006)。PF-02341066具有以下結構：TAE-684(5-氯-2,4-二氨基苯基嘧啶)具有以下結構：并且已經顯示抑制ROSALK激酶。Grosin,等人,Proc.NationalAcad.Sci104(1)270-275,2007?？梢岳肦OS三維結構的X射線晶體學模擬或計算機模擬來合理地設計、或可以通過高通量篩選用于抑制關鍵上游調節(jié)酶和/或必要的結合分子(其導致ROS激酶活性的抑制)的化合物文庫來發(fā)現ROS激酶活性的額外的小分子抑制劑和其他抑制劑(例如，間接抑制劑)。此類方法在本領域是眾所周知的，并且已加以描述。例如，通過檢查所述化合物抑制ROS活性、但不抑制其他激酶活性的能力(在一組激酶中)，和/或通過檢查在包含癌細胞(例如，肺癌細胞)的生物樣品中ROS活性的抑制，可以證實ROS被此類治療劑所抑制。用于鑒定抑制特征在于ROS激酶活性的多肽的表達/存在的癌癥的化合物的方法進一步說明如下?？捎糜诒景l(fā)明方法中的ROS抑制性治療劑還可以是靶向抗體，其特異性結合ROS活性所需的關鍵催化位點或者結合位點或結構域，并且通過阻斷配體、底物或者第二種分子接近α和/或阻止酶采用其活性必需的構型而抑制激酶。人源化目標特異性抗體的制備、篩選和治療用途已被詳細描述。參見Merluzzi等人，AdvClinPath.4(2):77-85(2000)。用于人源化目標特異性抑制抗體的高通量制備和篩選的技術和系統(tǒng)可以商購獲得，諸如Morphosys,Inc.的人組合抗體文庫(HumanCombinatorialAntibodyLibrary)(HuCAL?)。各種抗受體激酶的靶向抗體的制備和它們抑制靶向受體的活性的用途已被描述。參見例如，美國專利公開號20040202655,美國專利公開號20040086503,美國專利公開號20040033543,制備和使用受體酪氨酸激酶活性抑制抗體的標準化方法是本領域已知的。參見例如，歐洲專利號EP1423428，還可以使用噬菌體展示方法制備ROS特異性抗體抑制劑，噬菌體文庫構建和重組抗體選擇的方案在眾所周知的參考文獻CurrentProtocolsinImmunology,Colligan等人(編),JohnWiley&Sons,Inc.(1992-2000),Chapter17,Section17.1中提供。還參見美國專利號6,319,690,美國專利號6,300,064,美國專利號5,840,479,和美國專利公開號20030219839?？梢援a生(參見例如美國專利6,300,064)和篩選展示在噬菌體表面上的抗體片段文庫與本文所述的具有ROS激酶活性的多肽(諸如ROS融合多肽)的結合。特異性結合ROS融合多肽(例如，SLC34A2-ROS(S)融合多肽)或全長ROS多肽的抗體片斷被鑒定為用于阻斷細胞中該融合多肽的組成型激活的候選分子。參見歐洲專利號EP1423428。然后可進一步篩選在上述抗體文庫的篩選中鑒定的ROS結合靶向抗體在體外激酶分析和體內細胞系和/或腫瘤中阻斷ROS活性的能力。ROS抑制可以通過例如檢測此類抗體治療劑在一組激酶中抑制ROS激酶活性的能力和/或通過檢測包含癌細胞的生物樣品中ROS活性的抑制而證實，如上所述。在一些實施方案中，本發(fā)明的ROS抑制性化合物降低了ROS激酶活性，但更低程度上降低(或根本沒有降低)其他激酶的激酶活性。篩選用于ROS激酶抑制的此類化合物的方法進一步描述在上文中?？捎糜趯嵤┕_的方法的ROS抑制性化合物還可以是通過抑制除ROS激酶本身以外的蛋白或分子的活性間接抑制ROS活性的化合物。此類抑制性治療劑可以是靶向抑制劑，其調節(jié)磷酸化或去磷酸化(從而激活或失活)ROS本身或者干擾與配體結合的關鍵調節(jié)激酶的活性。與其他受體酪氨酸激酶一樣，ROS通過接頭蛋白和下游激酶的網絡調節(jié)下游信號傳遞。結果，可以通過靶向這些相互作用或下游蛋白抑制由于ROS活性誘導的細胞生長和存活。還可以通過使用抑制對于全長ROS或ROS融合多肽(例如，CD74-ROS融合多肽)采用其活性構象(即，從而使得ROS激酶結構域能夠被激活)所需的激活分子的結合的化合物間接地抑制ROS激酶活性。例如，已描述了制備和使用抗-PDGF抗體。參見美國專利公開號20030219839,“Anti-PDGFAntibodiesandMethodsforProducingEngineeredAntibodies,”Bowdish等人。抑制配體(PDGF)與受體的結合直接下調受體活性。ROS抑制性化合物或治療劑還可以包括反義和/或轉錄抑制性化合物，其通過阻斷編碼全長ROS或ROS融合蛋白的基因的轉錄抑制ROS激酶活性。各種受體激酶包括VEGFR、EGFR和IGFR和FGFR被用于治療癌癥的反義治療劑的抑制已被描述。參見例如，美國專利號6,734,017;6,710,174,6,617,162;6,340,674;5,783,683;5,610,288?？梢园凑找阎夹g設計、構建和使用反義寡核苷酸作為針對目標基因的治療劑。參見例如，Cohen,J.,TrendsinPharmacol.Sci.10(11):435-437(1989);Marcus-Sekura,Anal.Biochem.172:289-295(1988);Weintraub,H.,Sci.AM.Pp.40-46(1990);VanDerKrol等人，BioTechniques6(10):958-976(1988);Skorski等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91:4504-4508。最近已經描述了使用EGFR的反義RNA抑制劑在體內抑制人腫瘤生長。參見美國專利公開號20040047847。類似地，可以根據標準方法制備包含針對哺乳動物ROS基因或哺乳動物編碼ROS融合蛋白的多核苷酸的至少一種反義寡核苷酸的ROS抑制性治療劑。包含ROS抑制性反義化合物的藥物組合物可以如下文進一步描述制備和施用。小干擾RNA分子(siRNA)組合物通過RNA干擾過程抑制ROS的翻譯并因而抑制其活性，其也可以期望地用于本發(fā)明方法中。已經詳細描述了RNA干擾和通過導入包含與編碼目標蛋白的mRNA互補的序列的外源小雙鏈RNA分子選擇地沉默目標蛋白表達。參見例如，美國專利公開號20040038921,美國專利公開號20020086356,和美國專利公開20040229266。已表明雙鏈RNA分子(dsRNA)以高度保守的調節(jié)機制即已知為RNA干擾(RNAi)阻斷基因表達。簡而言之，RNAseIII切酶(Dicer)將dsRNA加工成約22個核苷酸的小干擾RNA(siRNA)，其作為引導序列通過RNA誘導性沉默復合物RISC誘導目標特異性mRNA切割(參見Hammond等人，Nature(2000)404：293-296)。RNAi涉及催化型反應，從而通過連續(xù)地切割較長dsRNA產生新的siRNA。因此，與反義分子不同，RNAi以非化學劑量方式降解目標RNA。當施用于細胞或生物體時，已經顯示外源dsRNA通過RNAi指導內源性信使RNA(mRNA)的序列特異性降解。目前已可以商購獲得大量的目標特異性siRNA產品，包括用于在哺乳細胞中表達和使用的載體和系統(tǒng)。參見例如，Promega,Inc.(www.promega.com);Dharmacon,Inc.(www.dharmacon.com)。用于RNAi的dsRNA的設計、構建和使用的詳細技術指南可以得到。參見例如，Dharmacon的“RNAiTechnicalReference&ApplicationGuide”;Promega的“RNAi:AGuidetoGeneSilencing.”ROS抑制性siRNA產品也可以商購獲得，并且可適當用于本發(fā)明方法中。參見例如，Dharmacon,Inc.,Lafayette,CO(目錄號M-003162-03,MU-003162-03,D-003162-07thru-10(siGENOME?SMARTselection和SMARTpool?siRNAs)。最近已建立了長度小于49個核苷酸、優(yōu)選為19-25個核苷酸的小dsRNA，其包含至少一種基本上與目標mRNA序列的一部分相同的序列，并且該dsRNA最佳在末端具有至少一個1-4個核苷酸的突出，此類dsRNA在介導哺乳動物中RNAi時最有效。參見美國專利公開號20040038921和20040229266。這種dsRNA的構建及其在體內沉默目標蛋白表達的藥物制劑中的應用詳細描述在這些出版物中。如果在哺乳動物中被靶向的基因的序列是已知的，例如可以制備21-23nt的RNA并測試其在哺乳動物細胞諸如人或其他靈長類細胞中介導RNAi的能力。如果需要，可以在適當動物模型中測試那些顯示介導RNAi的21-23nt的RNA分子以進一步評價其體內效力。已知的目標位點也可用于設計靶向那些位點的siRNA分子，所述已知的目標位點為例如根據對其他核酸分子例如核酶或反義分子的研究被確定為有效目標位點的目標位點，或者那些已知與疾病或病癥相關的目標位點諸如含有突變或缺失的那些位點。或者，可以通過例如計算機折疊算法合理設計/預測對于篩選感興趣目標mRNA的目標位點的有效dsRNA的序列。使用定制的Perl腳本或者可商購的序列分析程序諸如Oligo、MacVector或GCGWisconsinPackage，目標序列可以通過計算機芯片上(insilico)分列為所有特定長度片段或亞序列(subsequence)例如23個核苷酸片段的列表?？梢杂酶鞣N參數確定哪些位點是目標RNA序列中最合適的目標位點。這些參數包括但不限于二級或三級RNA結構、目標序列的核苷酸堿基組成、目標序列的不同區(qū)域之間的同源性程度、或者在RNA轉錄物中目標序列的相對位置。根據這些確定，可以通過使用例如體外RNA切割分析、細胞培養(yǎng)或動物模型選擇RNA轉錄物中任何數量的目標位點以篩選siRNA分子的效力。參見例如，美國專利公開號20030170891。最近還描述了鑒定和篩選RNAi目標位點的算法。參見，美國專利公開號20040236517。通?？捎玫幕蜣D移技術包括磷酸鈣、DEAE-葡聚糖、電穿孔、微注射和病毒方法(Graham等人(1973)Virol.52:456;McCutchan等人,(1968),J.Natl.CancerInst.41:351;Chu等人(1987),Nucl.AcidsRes.15:1311;Fraley等人(1980),J.Biol.Chem.255:10431;Capecchi(1980),Cell22:479)。還可以使用陽離子脂質體將DNA導入細胞(Feigner等人(1987),Proc.Natl.Acad.SciUSA84:7413)。商業(yè)上可用的陽離子脂質制劑包括Tfx50(PromegaCorp.,Fitchburg,WI)或Lipofectamin200(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)?；蛘撸梢允褂貌《据d體將dsRNA運送到細胞并介導RNAi。參見，美國專利公開號20040023390。用于哺乳動物細胞中RNAi的轉染和載體/表達系統(tǒng)是可商購的并已經詳細地描述。參見例如，Dharmacon,Inc.(Lafayette,CO),DharmaFECT?system;Promega,Inc.,siSTRIKE?U6Hairpin系統(tǒng);還參見Gou等人(2003)FEBS.548,113-118;Sui,G.等人ADNAvector-basedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99,5515-5520;Yu等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99,6047-6052;Paul,C.等人(2002)NatureBiotechnology19,505-508;McManus等人(2002)RNA8,842-850。使用制備的dsRNA分子在哺乳動物中進行siRNA干擾然后可以通過將包含dsRNA的藥物制劑施用于哺乳動物實現。藥物組合物以足以抑制目標基因的表達的劑量施用。典型地，dsRNA以小于5mgdsRNA/每天每公斤體重的劑量施用，并且足以抑制或完全抑制目標基因的表達。通常，dsRNA合適的劑量為0.01-2.5毫克/每天每公斤受體體重，優(yōu)選為0.1-200微克/每天每公斤體重，更優(yōu)選為0.1-100微克/每天每公斤體重，甚至更優(yōu)選為1.0-50微克/每天每公斤體重，和最優(yōu)選為1.0-25微克/每天每公斤體重。包含dsRNA的藥物組合物每天施用一次，或者以多種亞劑量施用，例如使用本領域眾所周知的緩釋制劑。這些藥物組合物的制備和施用可以按照如下進一步描述的標準技術進行。然后，如上所述，通過制備包含治療有效量的此類dsRNA的藥物制劑，并將該制劑施用于患有肺癌或疑似為肺癌(例如，NSCLC或SCLC)(所述癌癥表達具有ROS激酶活性的多肽(諸如，例如，全長ROS蛋白的異常表達或ROS融合蛋白的表達))的人受試者(例如，經由直接注射到腫瘤)，此類dsRNA可以用來在癌癥中抑制ROS表達和活性。最近描述了使用siRNA抑制劑類似地抑制其他受體酪氨酸激酶諸如VEGFR和EGFR。參見美國專利公開號20040209832,美國專利公開號20030170891,和美國專利公開號20040175703?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明方法的ROS抑制性治療劑可以通過本領域已知的任何手段施用于哺乳動物，所述手段包括但不限于口腔或腹膜途徑，包括靜脈內、肌內、腹膜內、皮下、經皮、氣道(氣霧劑)、直腸、陰道和局部(包括口腔和舌下)施用。對于口服施用，ROS抑制性治療劑通常以片劑或膠囊的形式以粉狀或顆粒、或以水溶液或懸液的形式提供。用于口服使用的片劑可以包括用藥學上可接受的載體和賦形劑諸如惰性稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑、甜味劑、風味劑、著色劑和防腐劑混合的活性成分。適當的惰性稀釋劑包括碳酸鈉和碳酸鈣，磷酸鈉和磷酸鈣，和乳糖；而玉米淀粉和海藻酸是合適的崩解劑。粘合劑可以包括淀粉和明膠；而如果存在潤滑劑，通常為硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。如果需要，所述片劑可以用材料諸如甘油單硬脂酸酯和甘油二硬脂酸酯包衣以延長胃腸道中的吸收。用于口服使用的膠囊包括其中活性成分與固體稀釋劑混合的硬明膠膠囊和其中活性成分與水或油諸如花生油、液體石蠟或橄欖油混合的軟明膠膠囊。對于肌內、腹膜內、皮下和靜脈內使用，本發(fā)明的藥物組合物通常以緩沖到合適pH和等滲的無菌水溶液或懸浮液的形式提供。適當的水性媒介物包括Ringer氏溶液和等滲氯化鈉。載體可以僅由水性緩沖液組成(“僅”意指不存在可能影響或介導ROS抑制性治療劑吸收的輔劑或包囊化物質)。此類物質包括例如下文描述的膠束(micellar)結構，諸如脂質體或衣殼。水性懸浮液可以包括懸浮劑諸如纖維素衍生物、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮和西黃芪膠樹膠，和潤濕劑諸如卵磷脂。用于水性懸浮劑的適當防腐劑包括對羥基苯甲酸乙酯和對羥基苯甲酸正丙酯。ROS抑制性治療劑組合物還可以包括包囊化制劑以保護治療劑(例如dsRNA化合物或特異性結合ROS融合多肽的抗體)免于被機體快速地清除，所述包囊化制劑諸如控制釋放制劑，包括埋植物和微囊化遞送系統(tǒng)。可以用可生物降解和生物相容的聚合物諸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這些制劑的制備方法對于本領域技術人員將是顯而易見的。所述材料也可商業(yè)獲得自AlzaCorporationandNovaPharmaceuticals，Inc.。脂質混懸劑(包括靶向受感染細胞的具有針對病毒抗原的單克隆抗體的脂質體)也可用作藥學上可接受的載體。這些可以按照本領域技術人員已知的技術制備，例如如美國專利號4,522,811；PCT公開WO91/06309；和歐洲專利公開號EP-A-43075中所述。包囊化的制劑可以包括病毒外殼蛋白。病毒外殼蛋白可以來自病毒或與病毒有關，諸如多瘤病毒，或者它可以是部分或者完全人工的。例如，外殼蛋白可以是多瘤病毒的病毒蛋白1和/或病毒蛋白2或其衍生物。ROS抑制性治療劑還可以包括施用于受試者的遞送媒介物(包括脂質體)、載體和稀釋劑及其鹽和/或可以存在于藥學上可接受的制劑中。例如，遞送核酸分子的方法描述在Akhtar等人，1992,TrendsCellBio.,2,139;DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,ed.Akbtar,1995,Maurer等人,1999,Mol.Membr.Biol.,16,129-140;Hofland和Huang,1999,Handb.Exp.Pharmacol.,137,165-192;和Lee等人，2000,ACSSymp.Ser.,752,184-192。美國專利號6,395,713和PCT公開號WO94/02595進一步描述了遞送核酸分子的一般方法。這些方案可以用于遞送事實上任何核酸分子。ROS抑制性治療劑(即，ROS抑制性化合物作為治療劑施用)可以通過各種本領域技術人員已知的方法施用于哺乳動物腫瘤，所述方法包括但不限于在脂質體中包囊化，通過離子電滲或者通過摻入到其他媒介物諸如水凝膠、環(huán)化糊精、可生物降解的納米膠囊和生物粘合微球體中、或者通過蛋白質載體(參見PCT公開號WO00/53722)?；蛘撸鲋委焺?媒介物組合通過直接注射或通過使用輸注泵局部遞送。不管是通過皮下、肌內或者皮內，直接注射所述組合物都可以使用標準針頭和注射器方法學，或者通過無針頭技術諸如由Conry等人，1999,Clin.CancerRes.,5,2330-2337和PCT公開號WO99/31262中描述的那些技術進行。ROS抑制性治療劑的藥學上可接受的制劑包括上述化合物的鹽，例如酸加成鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乙酸鹽和苯磺酸鹽。藥物組合物或制劑是指以適合用于施用(例如全身性施用)于細胞或患者(包括例如人)的形式的組合物或制劑。合適的形式部分取決于使用或進入的途徑，例如口服、經皮或通過注射。此類形式應當不會妨礙所述組合物或制劑到達目標細胞。例如，注射到血流中的藥物組合物應當是可溶的。其他因素是本領域已知的，并且包括一些考慮諸如毒性和阻止組合物或制劑發(fā)揮其效應的形式。導致全身性吸收的施用途徑(例如，藥物在血流中的全身性吸收或積聚，隨后分布到整個機體中)是所需的，并且包括但不限于：靜脈內、皮下、腹膜內、吸入、口腔、肺內和肌內。這些施用途徑的每一種都將ROS抑制性治療劑暴露給能接近的患病組織或腫瘤。已表明藥物進入到循環(huán)系統(tǒng)中的速率是分子量和大小的函數。使用包含本發(fā)明化合物的脂質體或者其他藥物載體可以潛在地將藥物定位到例如某些組織類型，諸如網狀內皮系統(tǒng)(RES)組織。能促進藥物連接到細胞諸如淋巴細胞和巨噬細胞的表面的脂質體制劑也是有用的。這種方法可以通過利用巨噬細胞和淋巴細胞免疫識別異常細胞(諸如癌細胞)的特異性的優(yōu)勢將藥物以增強的方式遞送到目標細胞?！八帉W上可接受的制劑”是指能將本發(fā)明的核酸分子有效地分布到最適合它們所需活性的身體位置的組合物或制劑。適合用于與本發(fā)明核酸分子配制的試劑的非限制性實例包括：P-糖蛋白抑制劑(諸如PluronicP85),其能增強藥物進入NCS(Jolliet-Riant和Tillement,1999,Fundam.Clin.Pharmacol.,13,16-26);可生物降解聚合物，諸如用于在腦內埋植后持續(xù)釋放的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球體(Emerich等人，1999,CellTransplant,8,47-58)(Rosermes,Inc.Cambridge,Mass.);和負載納米顆粒，諸如由聚丁基氰基丙烯酸酯制成的那些，其能將藥物遞送通過血腦屏障并且能改變神經元攝取機制(ProgNeuro-psychopharmacolBiolPsychiatry,23,941-949,1999)。用于可用于本發(fā)明方法的ROS抑制性化合物的遞送策略的其他非限制性實例包括由Boado等人，1998,J.Pharm.Sci.,87,1308-1315;Tyler等人，1999,FEBSLett.,421,280-284;Pardridge等人，1995,PNASUSA.,92,5592-5596;Boado,1995,Adv.DrugDeliveryRev.,15,73-107;Aldrian-Herrada等人1998,NucleicAcidsRes.,26,4910-4916;和Tyler等人1999,PNASUSA.,96,7053-7058中描述的材料。包括表面修飾的含有聚(乙二醇)脂質的脂質體(PEG-修飾的，或者長循環(huán)脂質體或者隱形脂質體(stealthliposomes))的治療組合物也適合用于本發(fā)明的方法中。這些制劑提供了一種增加藥物在目標組織中積聚的方法。這類藥物載體抵抗單核吞噬細胞系統(tǒng)(MPS或RES)的調理作用和清除作用，從而實現包囊化藥物的更長血液循環(huán)時間和增強的組織暴露(Lasic等人Chem.Rev.1995,95,2601-2627;Ishiwata等人,Chem.Pharm.Bull.1995,43,1005-1011)。已顯示這些脂質體可能通過在新血管化目標組織中外滲和捕獲而選擇性在腫瘤中積聚(Lasic等人,Science1995,267,1275-1276;Oku等人,1995,Biochim.Biophys.Acta,1238,86-90)。尤其與已知在MPS組織中積聚的常規(guī)陽離子脂質體相比(Liu等人,J.Biol.Chem.1995,42,24864-24870;PCT公開號WO96/10391;PCT公開號WO96/10390;和PCT公開號WO96/10392)，長循環(huán)脂質體增強了DNA和RNA的藥代動力學和藥效動力學。根據其在代謝迅速的MPS組織諸如肝和脾中避免積聚的能力，長循環(huán)脂質體與陽離子脂質體相比還可能更大程度地保護藥物免于被核酸酶降解。治療組合物可以包括在藥學上可接受的載體或稀釋劑中的藥學有效量的所需化合物。用于治療應用的可接受的載體或稀釋劑是藥學領域眾所周知的，并且描述在例如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)。例如可以提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和風味劑。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。此外，可以使用抗氧化劑和懸浮劑。在一些實施方案中，以有效量施用ROS抑制性治療劑和/或ALK/ROS抑制性治療劑?！坝行Я俊被颉坝行┝俊笔侵阜乐?、抑制疾病狀態(tài)的發(fā)生、或治療疾病狀態(tài)(減輕癥狀到一定程度、優(yōu)選所有癥狀)所需要的治療劑的量。有效劑量取決于疾病類型、所使用的治療劑、施用途徑、治療的哺乳動物類型、考慮的具體哺乳動物的身體特征、共同藥物治療和其他藥物領域技術人員將意識到的因素。通常，取決于帶負電荷聚合物的能力，施用的有效量為活性成分的0.1mg/kg-100mg/kg體重/天的量。約0.1mg-約140mg/kg體重/天的劑量水平可用于治療上述病癥(約0.5mg-約7g/患者/天)。能組合載體材料以產生單劑量形式的活性成分的量根據治療的宿主和施用的特定模式而變化。劑量單位形式通常含有約1mg-約500mg的活性成分。應當理解的是對于任何特定患者的特定劑量水平取決于各種因素，包括所使用的特定化合物的活性、年齡、體重、總體健康、性別、飲食、施用時間、施用途徑、排泄速度、藥物組合和經歷治療中的特定疾病的嚴重度。對于施用于非人類動物，組合物還可以添加到動物的飼料和飲水中?？梢员憷刂瞥蓜游镲暳虾惋嬎M合物，從而使得動物在飲食時攝取治療合適量的組合物。還可以便利地將所述組合物制成預混合物用于添加到飼料或飲水中?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的ROS抑制性治療劑可以包括上述單一化合物，或者多種化合物的組合，無論為同類抑制劑(例如，抗體抑制劑)還是不同類抑制劑(例如，抗體抑制劑和小分子抑制劑)?；衔锏拇祟惤M合可以增加抑制表達融合蛋白癌癥的進展的總體治療效果。例如，治療組合物可以是小分子抑制劑，諸如單獨的由Pfizer,Inc.生產的克里唑替尼(也稱為PF-02341066)(參見美國公開號2008/0300273)，或其與其他靶向ROS活性的克里唑替尼類似物和/或ROS的小分子抑制劑(諸如由Novartis,Inc.生產的NVP-TAE684，或Sakamoto等人,CancerCell19:679-690,2011中描述的CH5424802化合物)的組合。治療組合物除了一種或多種靶向抑制劑外還可以包含一種或多種非特異性化療劑。最近表明此類組合在多種癌癥中提供了協(xié)同腫瘤殺傷效果。此類組合在體內抑制ROS活性和腫瘤生長的效力可以按照下文所述評價。本發(fā)明還部分地提供了用于確定化合物是否抑制特征在于具有ROS激酶活性的多肽或編碼其的多核苷酸的癌癥(例如，肺癌)的進展的方法，該方法通過確定所述化合物是否抑制癌癥中該多肽的ROS激酶活性而實現。在一些實施方案中，通過檢測包括來自骨髓、血液或腫瘤的細胞的生物樣品確定ROS活性的抑制。在另一個實施方案中，至少使用以下試劑確定ROS活性的抑制：特異性結合ROS多肽的試劑(例如，ROS特異性抗體)或特異性結合編碼ROS多肽的多核苷酸的試劑(例如，siRNA或ROS反義)。測試化合物可以是上述的任何類型的治療劑或組合物。評價化合物在體外或體內效力的方法在本領域中已經充分確立并是已知的。例如，可以使用其中ROS激酶被激活的細胞或細胞提取物檢測組合物在體外抑制ROS的能力。可以使用一組化合物以檢測所述化合物對ROS的特異性(與其他目標，諸如EGFR或PDGFR相反)。另一種可以使用的藥物篩選技術提供了高通量篩選具有與目標蛋白適當結合親和力的化合物，如PCT公開號W084/03564中所述。在這種方法中，如應用于具有ROS活性的多肽(例如，全長ROS蛋白或多種ROS融合蛋白之一)，大量不同的小測試化合物在固相基底諸如塑料針或一些其他表面上合成。測試化合物與本發(fā)明多肽或其片段反應，并洗滌。然后通過本領域眾所周知的方法檢測結合的多肽(例如，SLC34A2-ROS(VS)、SLC34A2-ROS(S)、SLC34A2-ROS(L)、CD74-ROS、FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)、或FIG-ROS(XL)融合多肽或全長ROS多肽)。純化的多肽還可以直接包被到板上以用于上述藥物篩選技術?；蛘?，可以使用非中和抗體以捕獲肽并將它固定到固體載體上。對于發(fā)現是在體外ROS活性的有效抑制劑的化合物，然后可以檢查其體內抑制表達具有激酶活性的多肽的癌癥(諸如，肺癌或其他癌癥，諸如肝癌、肺癌、結腸癌、腎癌或胰腺癌)的進展的能力，其利用，例如，攜帶表達具有ROS激酶活性的多肽的人肺癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、肺癌或結腸腫瘤的哺乳動物異種移植物。在該程序中，可以將已知表達具有ROS激酶活性的蛋白(例如，全長ROS或ROS融合蛋白之一)的癌細胞系皮下置于動物中(例如，置于裸鼠或SCID小鼠或其他免疫缺陷動物)。然后這些細胞長成腫瘤塊，可以通過肉眼監(jiān)視。然后可以用藥物處理動物。藥物處理對腫瘤大小的效果可以從外部觀察。然后，處死動物并取出腫瘤通過IHC和Western印跡進行分析。類似地，可以通過標準方法制備哺乳動物骨髓移植物以檢測在表達具有ROS激酶活性的蛋白的血液腫瘤中的藥物反應。通過這種方式，可以觀察藥物在最接近模擬患者的生物環(huán)境中的效果。可以通過用磷酸化特異性抗體的分析確定藥物改變腫瘤細胞中或周圍基質細胞中信號傳導的能力。還可以通過用凋亡特異性標記諸如切割的胱天蛋白酶3和切割的PARP分析而觀察藥物誘導細胞死亡或抑制細胞增殖的效力?？梢酝ㄟ^在細胞培養(yǎng)或者實驗動物中的標準藥學程序確定此類化合物的毒性和治療效力，例如確定LD50(50％群體致死劑量)和ED50(50％群體治療有效劑量)。毒性和治療效果的劑量比是治療指數，并且它可以表示為比率LD50/ED50。在一些實施方案中，化合物展示了高治療指數。在實施所公開的方法確定化合物是否抑制特征在于存在具有ROS激酶活性的多肽(或編碼其的多核苷酸)的腫瘤的進展中，還可以有利地采用包含來自哺乳動物異種移植物(或骨髓移植物)的細胞的生物樣品。非限制性的異種移植物(或移植受體)是小型哺乳動物(諸如小鼠)，其攜帶表達具有ROS激酶活性的多肽(例如，ROS融合多肽(諸如CD74-ROS或FIG-ROS(S))或全長ROS)的人腫瘤(或白血病)。攜帶人腫瘤的異種移植物是本領域眾所周知的(參見Kal,CancerTreatRes.72:155-69(1995))，并且攜帶人腫瘤的哺乳動物異種移植物的制備被很好地描述(參見Winograd等人,InVivo.1(1):1-13(1987))。類似地，骨髓移植模型的產生和使用被很好地描述(參見例如，Schwaller,等人，EMBOJ.17:5321-333(1998);Kelly等人,Blood99:310-318(2002))。提供下述實施例只是為了進一步說明本發(fā)明并不是為了限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附的權利要求所限定。本發(fā)明包括本文教導方法的各種修改和改變，這對于本領域普通技術人員來說是顯而易見的。提及的材料、試劑等可獲自商業(yè)來源，除非另有說明。實施例1通過總磷酸肽譜分析鑒定NSCLC細胞系中的ROS激酶活性使用用于從復雜混合物中分離和質譜表征修飾肽的IAP技術檢測包括HCC78的幾種人NSCLC細胞系中激酶激活的總磷酸化譜(參見美國專利號7,300,753和7,198,896)。使用磷酸酪氨酸特異性抗體(商購獲得自CellSignalingTechnology,Inc.,Danver,MA,目錄號#9411)進行IAP技術以便從NSCLC細胞系的提取物中分離并隨后表征含有磷酸酪氨酸的肽。特別地，使用IAP方法促進鑒定NSCLC細胞系中激活的酪氨酸激酶以鑒定這種疾病中的新驅動因素。細胞培養(yǎng)從DSMZ(theGermanNationalResourceCentreforBiologicalMaterial)獲得HCC78細胞，生長在具有10％胎牛血清(FBS)(Sigma)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中。磷酸肽免疫沉淀將總共2×108個細胞在尿素裂解緩沖液(20mMHEPESpH8.0,9M尿素、1mM釩酸鈉、2.5mM焦磷酸鈉、1mMβ-甘油磷酸酯)中以1.25×108個細胞/ml裂解，并超聲處理。以20,000xg離心澄清超聲裂解物，并按前述還原并烷基化蛋白質(參見Rush等人,Nat.Biotechnol.23(1):94-101(2005))。用20mMHEPESpH8.0將樣品稀釋到尿素終濃度為2M。以1:100v/v將胰蛋白酶(1mg/ml于0.001MHCl中)加入澄清的裂解物中。在室溫下消化樣品過夜。消化后，將裂解物酸化到TFA的終濃度為1％。使用Sep-PakC18柱按前述進行肽的純化(參見Rush等人，同上)。純化后，將所有的洗脫液(8％、12％、15％、18％、22％、25％、30％、35％和40％的在0.1%TFA中的乙腈)合并并凍干。將干燥的肽重懸在1.4mlMOPS緩沖液(50mMMOPS/NaOHpH7.2,10mMNa2HPO4,50mMNaCl)中，并通過在12,000xg下離心10分鐘除去不溶物質。將來自腹水的磷酸酪氨酸單克隆抗體P-Tyr-100(CellSignalingTechnology)在4℃過夜非共價偶聯到4mg/ml珠的蛋白G瓊脂糖珠(Roche)上。偶聯后，使用PBS洗滌抗體-樹脂兩次，用MOPS緩沖液洗滌三次。將于MOPSIP緩沖液中的1:1漿料的固定抗體(40μl,160μg)加入到溶解的肽級分中，并在4℃將混合物孵育過夜。將固定的抗體珠用MOPS緩沖液洗滌三次，然后ddH2O洗滌兩次。通過每次使用40μl的0.15%TFA孵育20分鐘從珠洗脫肽兩次，合并級分。LC-MS/MS質譜分析于IP洗脫液(40μl)中的肽使用Stop和Go提取秘訣(StopandGoextractiontips)(StageTips)從洗脫的抗體中濃縮和分離(參見Rappsilber等人，Anal.Chem.,75(3):663-70(2003))。用1μl的60%MeCN、0.1%TFA將肽從微柱洗脫于7.6μl的0.4％乙酸/0.005％七氟丁酸(HFBA)。使用具有惰性樣品注射閥(Dionex)的Famos自動進樣儀將樣品加入具有MagicC18AQ反相樹脂(MichromBioresources)的10cmx75μm的PicoFrit毛細柱(NewObjective)中。用以280nl/min遞送的于0.4％乙酸、0.005％HFBA(Ultimate,Dionex)中的45-min線性梯度乙腈展開柱子。用LCQDecaXP和離子捕獲分光計(ThermoFinnigan)并采用top-four方法以數據依賴方式收集串聯質譜，動態(tài)排除重復計數為1，且重復持續(xù)時間為0.5min。數據分析和分配使用(以作為BioWorks3.0一部分提供的SequestBrowserpackage(v.27,rev.12))TurboSequest(ThermoFinnigan)評價MS/MS譜。使用SequestBrowserprogramCreateDta以下述參數將單個的MS/MS譜從原始數據文件中提?。鹤畹蚆W為700；最高MW為4,500；最少離子數為20；最小TIC為4×105；和前體電荷狀態(tài)未指定。在將樣品注射到最終的稀釋梯度前從原始數據文件的開始部分提取譜。不使用IonQuest和VuDta程序進一步選擇MS/MS譜進行Sequest分析。使用下述的TurboSequest參數評價MS/MS譜：肽質量允差(masstolerance)，2.5；片段離子允差，0.0；每修飾的差別氨基酸的最大數目，4；質量類型親本(masstypeparent)，平均值；質量類型片段(masstypefragment)，平均值；內部裂解位點的最大數目，10；在相關分析中考慮來自b和y離子的水和氨中性丟失(neutrallosses)。除了收集自彈性蛋白酶消化物的譜之外，具體說明了蛋白水解酶。針對2004年8月24日公布的NCBI人數據庫進行了檢索，該數據庫包含27,175個允許氧化的甲硫氨酸(M+16)和磷酸化(Y+80)作為動態(tài)修飾的蛋白質。在蛋白質組學研究中，期望僅僅基于觀察在一個實驗結果中的單個肽來驗證蛋白質鑒定，以便指示蛋白質事實上存在于樣品中。這已導致了仍未被普遍接受的驗證肽分配的統(tǒng)計方法以及關于本實施例中所遵循的公開蛋白質和肽鑒定結果的指南的發(fā)展(參見Carr等人,Mol.CellProteomics3:531-533(2004))。然而，因為免疫親和策略將磷酸化的肽與未磷酸化的肽分開，所以只觀察來自蛋白質的一個磷酸肽是通常結果，由于許多磷酸化的蛋白只有一個酪氨酸-磷酸化位點。出于該原因，使用額外的標準來驗證磷酸肽分配是適當的。如果以下這些額外標準中的任何可以滿足，則分配可能是正確的：(i)相同序列分配給具有不同電荷狀態(tài)的共洗脫離子，因為MS/MS譜隨電荷狀態(tài)顯著變化；(ii)由于來自不完全蛋白水解或使用除胰蛋白酶之外的蛋白酶的序列重疊，所述位點見于超過一個肽序列中；(iii)由于同源但非相同的蛋白質同種型，所述位點見于超過一個肽序列中；(iv)由于在物種中同源但非相同的蛋白質，所述位點見于超過一個肽序列背景中；和(v)由于離子阱質譜儀產生高度可重現的MS/MS譜，經合成的對應于分配序列的磷酸肽的MS/MS分析驗證位點。最后的標準常規(guī)用來證實特別感興趣的目標新的位點分配。由Sequest進行的所有譜和所有序列分配被輸入相關數據庫。分配的序列在保守兩步法之后被接受或拒絕。在第一步中，高評分序列分配的子集通過過濾XCorr值進行選擇，對于+1的電荷狀態(tài)XCorr值至少為1.5，對于+2為2.2，對于+3為3.3，以使最大的RSp值為10。如果下述的標準中任何一個被滿足，子集中的分配被拒絕，所述標準為：(i)所述譜含有至少一個主峰(至少為所述譜中至少10％與最強離子一樣強)，該主峰不能作為a、b或y離子、作為a、b或y離子的水或氨中性丟失產生的離子或者作為多質子化離子(multiplyprotonatedion)被作圖到分配序列；(ii)所述譜不含有一系列等價于至少六個不間斷殘基的b或y離子；或者(iii)在我們進行的所有研究中至少有五次沒有觀察到該序列(除了由于不完全蛋白水解或者使用除胰蛋白酶外的蛋白酶導致的重疊序列)。第二步，如果低評分譜表現出與在其他研究中收集的高評分譜的高度相似性，則接受具有低于閾值的分配，這模仿真實參考文庫搜索策略(truereferencelibrary-searchingstrategy)。所有支持最終的分配序列表(此處未顯示)的譜將由至少三個科學家評價以建立其可信度。上述IAP分析從HCC78細胞中鑒定了454個非冗余含磷酸酪氨酸肽，395個磷酸酪氨酸位點和240個酪氨酸磷酸化蛋白，大多數都是新的(數據未顯示)。這些酪氨酸磷酸化激酶中，檢測到的那些中有幾種是在其他NSCLC細胞系中通常用MS分析檢測不到的(數據未公開)，包括ROS激酶。實施例2采用總磷酸肽譜分析檢測突變ROS激酶在人癌癥樣品中的表達為了進一步證實在人NSCLC中ROS融合突變的發(fā)生率，使用上述總磷酸肽譜分析的IAP技術檢測幾份人NSCLC腫瘤(參見實施例1)以鑒定在這些腫瘤中的ROS磷酸肽。腫瘤樣品(速凍切割的腫瘤并保存在液氮中)從中國臨床合作者(湘雅二醫(yī)院，中南大學，長沙，湖南，中國)獲得。簡而言之，將約300毫克-500毫克的腫瘤組織均質化。例如，將組織均質化并且以1.25x108個細胞/ml裂解在尿素裂解緩沖液(20mMHEPESpH8.0，9M尿素，1mM釩酸鈉，2.5mM焦磷酸鈉，1mMβ-甘油磷酸酯)，并且進行超聲處理。超聲裂解物通過20,000xg離心而澄清，并且如先前所述將蛋白還原和烷基化(參見Rush等人,Nat.Biotechnol.23(1):94-101(2005))。將樣品用20mMHEPESpH8.0稀釋至2M的最終尿素濃度。將胰蛋白酶(1mg/ml，在0.001MHCl中)以1:100v/v添加至澄清的裂解物。樣品在室溫下消化過夜。這些樣品的總磷酸酪氨酸譜分析按照上述實施例1所述的方法進行。譜分析結果表明腫瘤樣品之一具有ROS磷酸肽和SLC34A2磷酸肽兩者(參見下表1(其他檢測的磷酸肽未顯示)，并且顯示下游分子諸如IRS-1和IRS-2磷酸肽。如期望，這種腫瘤的酪氨酸譜分析特征與NSCLC細胞系HCC78的非常相似(參見表3)。FISH分析也顯示腫瘤具有ROS易位(參見下文實施例10)?？梢允褂肦T-PCR、DNA測序分析進一步證實在該患者中的ROS激活(其他攜帶ROS易位的患者)是由于SLC34A2/ROS的異常轉錄物所致。表3人NSCLC腫瘤的磷酸肽譜分析實施例3Western印跡分析NSCLC細胞系中的ROS激酶表達通過使用對于ROS和其他受體酪氨酸激酶(RTK)以及下游激酶特異性的抗體Western印跡分析細胞提取物來證實HCC78NSCLC細胞系(但不是其他NSCLC細胞系)表達激活的ROS激酶的觀察。用添加ProteaseArrest?(GBiosciences)的1X細胞裂解緩沖液(CellSignalingTechnology)裂解HCC78細胞，并通過電泳分離。所有用于免疫印跡的抗體和試劑都來自于CellSignalingTechnology,Inc.(Danvers,MA)。按照“WesternImmunoblottingProtocol”(CellSignalingTechnology,Inc.,2005-2006目錄)所述進行Western印跡?？筊OS抗體得自SantaCruzBiotechnology,Inc.。圖1顯示Western印跡結果。在多種不同的NSCLC細胞系中，只有HCC78表達ROS蛋白。HCC78中的ROS蛋白比野生型ROS蛋白具有小得多的分子量，表示是融合蛋白。Western印跡證實ROS融合蛋白是酪氨酸磷酸化的。通過磷酸酪氨酸抗體免疫沉淀HCC78細胞的蛋白裂解物，并且用總ROS抗體進行免疫印跡。通過ROS抗體從pY-IP檢測到與從總裂解物相同的條帶，其中IP’ed條帶具有較小更慢遷移，也表明蛋白質的磷酸化。實施例4使用siRNA對表達異常ROS激酶的哺乳動物NSCLC細胞系的生長抑制為了證實截短形式的ROS驅動HCC78細胞系的細胞生長和存活，檢測siRNA沉默抑制這些細胞生長的能力。RNA干擾下調ROS的表達。下述ROSsiRNA購自Proligo,Inc.，其在括號中表示相應的ROS序列：。在轉染前一天將2×105個細胞接種到12孔板中。使用MirusTransIT-TKOTransfectionReagent轉染100nMROS1siRNA。轉染48小時后，將細胞轉移到饑餓培養(yǎng)基中再24小時。通過胰蛋白酶消化收集細胞并計數，然后細胞裂解物用于WB以檢測ROS蛋白質水平。免疫印跡分析表明在將siRNA轉染到HCC78細胞后72小時，ROS的表達特異并且顯著地降低，而對照細胞系H2066不表達ROS蛋白(參見圖2，小圖B)。如預期，這伴隨下游底物諸如p-Erk1/2和p-Akt磷酸化的減少(參見圖2，小圖C)。此外，如預期，用ROSsiRNA處理導致HCC78細胞系凋亡增加(但在對照細胞系H2066中沒有)，如通過檢測切割的PARP確定(參見圖2，小圖B)。用ROSsiRNA轉染后3天殺死80％細胞，如圖2，小圖A中顯示。這些結果表明在HCC78細胞系中，突變/截短的ROS激酶驅動這些NSCLC細胞的增殖和生長，并且此類該增殖和生長可以被使用抑制ROS激酶表達的siRNA所抑制。實施例5SLC34A2-ROS融合基因的分離和測序鑒于在NSCLC細胞系(HCC78)中檢測到存在截短形式的ROS激酶，在編碼ROS的激酶結構域的序列上進行5′快速擴增cDNA末端以確定是否存在嵌合ROS轉錄物?？焖贁U增互補DNA末端使用RNeasyMiniKit(Qiagen)從HCC78細胞系提取RNA。使用DNeasyTissueKit(Qiagen)提取DNA。使用5’RACE系統(tǒng)(Invitrogen)快速擴增cDNA末端，對于cDNA合成的引物為ROS-GSP1，且對于嵌套PCR反應的引物為ROS-GSP2和ROS-GSP3。PCR測定對于RT-PCR，使用SuperScriptTMIII第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)用oligo(dT)20(商業(yè)獲自Invitrogen,Carlsbad,CA,目錄號18080)從2.5μg總RNA合成第一鏈cDNA。然后，使用引物對SLCROS-F1和SLCROS-R1、SLCROS-F2和SLCROS-R2擴增SLC34A2-ROS融合基因。構建體使用PlatinumTaqDNA高保真聚合酶(Invitrogen)和引物對SLC-Fb和ROS-Rb(具有BglII限制性位點)從HCC78細胞的cDNA通過PCR擴增SLC34A2-ROS融合基因的開放閱讀框。該PCR產物被克隆到逆轉錄病毒載體MSCV-Neo中。引物為：。在兩輪后檢測PCR擴增產物。然后通過5’RACE分析ROS的5’序列鑒定了該激酶融合至SLC34A2的N-末端。得到產物的序列分析表明ROS的c-末端融合到SLC34A2基因N-末端(參見圖3C和3D)。SLC34A2-ROS融合基因是符合讀框的，并且將SLC34A2的前126個氨基酸融合到ROS的最后598或495個氨基酸(參見圖3B，1750處的箭頭顯示C’末端598個氨基酸的斷裂，且1853處的箭頭顯示C’末端495個氨基酸的斷裂)分別導致產生了兩種變體融合蛋白(長的，短的)。基因結構的分析預測了另一種變體，非常短的變體，預測其包含SLC34A2的前126個氨基酸與ROS的最后467個氨基酸(參見圖3E)。SLC34A2定位到染色體4p15，而ROS在染色體6q22上。因此，由t(4;6)(p15;q22)產生了融合基因。參見圖3A。預測的SLC34A2-ROS(VS)(即，非常短的變體)的氨基酸和核酸序列分別提供在SEQIDNOs:28和29中。SLC34A2融合體的序列顯示在圖4A(長變體，上面為氨基酸序列，下面為核酸序列)和圖4B(短變體，上面為氨基酸，下面為核酸)。人SLC34A2蛋白的氨基酸和核酸序列提供在圖5中，其中參與易位的殘基用下劃線表示。類似地，人ROS蛋白的氨基酸序列與核酸序列分別顯示在圖6A和6B中。在圖6A和6B中，參與長變體的殘基用下劃線表示，用下劃線表示的粗體殘基是參與(短)變體易位的殘基，并且用下劃線表示的粗體紅色殘基是預測參與預測的(非常短)變體易位的殘基。對于長版本和短版本的SLC34A2和ROS的融合體通過對RNA的逆轉錄酶PCR證實。實施例6SLC34A2-ROS融合蛋白驅動轉染的293細胞的生長和存活。為了證實SLC34A2-ROS融合蛋白的表達能將正常細胞轉化為癌性表型，用上述編碼SLC34A2-ROS融合蛋白的長變體的cDNA構建體轉染人胚胎腎細胞(293細胞)。將上述SLC34A2-ROScDNA構建體(編碼長變體融合蛋白)插入MSCV病毒載體，并使用SuperFect轉染試劑(商業(yè)獲自Qiaqen,Valencia,CA)將該構建體轉染HEK293細胞。48小時后，收集轉染的HEK293細胞，并通過Western印跡證實所期望分子量的重組SLC34A2-ROS融合蛋白(長變體)的表達(參見圖7)。實施例7SLC34A2-ROS融合蛋白驅動轉化的哺乳動物細胞系的生長和存活。為了證實SLC34A2-ROS融合蛋白的表達可以將正常細胞轉化為癌性表型，可以使用上述cDNA構建體轉化3T3細胞。將細胞維持在具有10％胎牛血清(FCS)(Invitrogen,Carslbad,CA)的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中。如前述制備逆轉錄病毒上清液和轉導。參見Schwaller等人，EmboJ.17(18):5321-33(1998)。分別使用逆轉錄病毒上清液轉導3T3細胞，所述逆轉錄病毒上清液分別含有MSCV-Neo或MSCV-Neo/SLC34A2-ROS(長的)或者MSCV-Neo/ROS(短的)載體，然后針對G418(500ug/ml)選擇。穩(wěn)定轉染的細胞將用于軟瓊脂分析以證實SLC34A2-ROS將轉化3T3細胞。此類分析將證實SLC34A2-ROS融合蛋白的表達是否轉化了3T3細胞，從而使得細胞生長將不依賴貼壁。然后進行Western印跡分析以檢測ROS、SLC34A2、SHP-1和其他可能的ROS下游目標的磷酸化狀態(tài)。實施例8CD74-ROS融合基因的分離和測序還使用實施例1和2中描述的方法使用總磷酸肽譜分析的IAP技術篩選第二批次的幾種人NSCLC腫瘤(包括來自患者CD042的腫瘤)。在患者CD042中檢測到磷酸化的ROS激酶。為了確定該患者中存在的該ROS激酶是否是SLC34A2蛋白和ROS激酶蛋白之間的融合體，在編碼ROS的激酶結構域的序列上進行cDNA末端的5'快速擴增，以確定嵌合ROS轉錄物是否存在于那些患者。有趣的是，如下所述，使用這種方法發(fā)現了另一種ROS融合基因，即CD74和ROS之間的融合體。如實施例4中所述，使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)來從腫瘤組織提取RNA。以用于cDNA合成的引物ROS-GSP1和用于嵌套式PCR反應的ROS-GSP2和ROS-GSP3使用5’RACE系統(tǒng)(商購自Invitrogen(LifeTechnologies,Inc.的部分),Carlsbad,CA)。PCR測定對于RT-PCR，使用SuperScriptTMIII第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)與寡聚(dT)20(Invitrogen目錄號18080)從2.5μg總RNA合成第一鏈cDNA。然后，使用引物對CD74-F1和ROS-GSP3擴增CD74-ROS融合基因：所得產物的序列分析表明，ROS的c-末端融合至CD74基因N-末端(參見圖8，小圖B和C)。CD74-ROS融合基因符合讀框，并且將CD74的前208個氨基酸融合至ROS的最后495個氨基酸(參見圖8，小圖B)，導致產生融合蛋白。CD74位于染色體5q32，而ROS在染色體6q22上(參見圖8，小圖A)。因此，融合基因由t(5;6)(q32;q22)生成。CD74-ROS的序列提供在圖9中(上面，氨基酸序列；下面，核苷酸序列)。如圖9中顯示，來自CD74的殘基用下劃線表示，而ROS激酶結構域的殘基以粗體字型顯示。圖10顯示了人CD74的序列(上面的氨基酸和下面的核酸)，其中存在于CD74-ROS融合體中的殘基用下劃線表示。類似地，圖11A和11B顯示了人ROS的氨基酸和核酸序列，其中存在于CD74-ROS融合體中的殘基用下劃線表示。CD74和ROS的融合通過對RNA的逆轉錄酶-PCR證實。圖12是顯示了用指示引物的PCR獲得的RT-PCR產物的瓊脂糖凝膠。實施例9通過免疫組織化學(IHC)檢測ROS激酶蛋白為了確定NSCLC中發(fā)現的ROS融合蛋白是否可以通過免疫組織化學檢測，使用ROS特異性兔單克隆抗體。這些研究中使用的ROS特異性抗體(即兔單克隆抗體ROS1D4D6)先前已經描述(參見PCT公開號WO2010/093928)，并且特異性結合人ROS激酶蛋白上在ROS蛋白的激酶結構域的C-末端的區(qū)域。盡管D4D6抗體尚未商售，但是類似的ROS特異性抗體可商購自多個供應商，包括但不限于，來自SantaCruzBiotechnology,Inc.,(SantaCruz,CA)的Ros(C-20)抗體，目錄號sc-6347和來自CellSignalingTechnology,Inc.(Danvers,MA)的ROS(69D6)抗體，目錄號#3266。對于這些研究，將556份人NSCLC腫瘤樣品的組群制備為石蠟塊。所有腫瘤樣品由兩位獨立的病理學家評價，并且發(fā)現包含246份腺癌病例，64份支氣管肺泡癌病例，226份鱗狀細胞癌病例和20份大細胞癌病例。免疫組織化學：將4-6μm組織切片分別通過二甲苯和分級乙醇脫石蠟且再水化(例如，通過三次改變二甲苯，每次5分鐘，然后通過兩次改變100％乙醇和兩次改變95％乙醇(每次5分鐘)而再水化)。載片在diH2O中沖洗，然后使用1.0mMEDTA,pH8.0和制造商設置在DecloakingChamber(BiocareMedical,Concord,CA)中進行抗原修復：SP1125℃持續(xù)30秒和SP290℃持續(xù)10秒。載片在3%H2O2中猝滅10分鐘，然后在diH2O中洗滌。在濕室中在Tris緩沖鹽水陽性0.5％Tween-20(TBST)/5%山羊血清中封閉之后，載片在4℃下用稀釋在SignalStain?抗體稀釋劑(#8112CellSignalingTechnology,Danvers,MA)的0.19μg/ml的ROS1(D4D6)XP?兔mAb孵育過夜。用TBST洗滌之后，在室溫下在濕室中用Envisionpositive(Dako,Carpinteria,CA)或SignalStain?BoostIHC檢測試劑(HRP,兔)(目錄號8114CellSignalingTechnology,Danvers,MA)以30分鐘孵育進行檢測。對于SignalStain?BoostIHC載片，在洗滌載片(例如，在TBST中三次)之后，接下來將載片暴露于根據制造商的說明書制備的NovaRed(VectorLaboratories,Burlingame,CA)。載片顯色1分鐘，然后在diH2O中沖洗。載片通過在蘇木精中孵育(即用的商售自Invitrogen(Carlsbad,CA)，目錄號00-8011)1分鐘而復染，在diH2O中沖洗30秒，在發(fā)藍試劑(RichardAllanScientific,Kalamazoo,MI(ThermoScientificcompany),目錄號7301)中孵育20秒，然后最后在diH2O中洗滌30秒。通過2次更換95％乙醇(每次20秒)和2次更換100％乙醇(每次2分鐘)而使載片脫水。將載片以2次更換二甲苯(每次20秒)而清潔，然后在空氣中干燥。使用VectaMount(VectorLaboratories,Burlingame,CA)將蓋載片封固。載片在空氣中干燥，然后在顯微鏡下評估。使用配備OlympusDP70相機和DP控制器軟件的OlympusCX41顯微鏡而獲得圖像(20x)。在通過用ROS特異性RmabROS1D4D6的免疫組織化學篩選的556份NSCLC腫瘤中，鑒定出9份ROS1-陽性腫瘤。分類(breakdown)如下：在246份腺癌中，8份(或3.3％)對于ROS1激酶呈陽性。在20份大細胞癌中，1份(或5.0％)對于ROS1激酶呈陽性。觀察到多種ROSIHC染色模式，范圍從弱細胞質到強核周圍聚集(參見圖13A-F)。在5/9(55％)情況下，ROS在細胞質中彌漫定位(圖13A)。在1份大細胞癌中觀察到強細胞質染色(圖13C)。兩種情況具有彼此不同的獨特表型，一種是具有點狀質膜染色區(qū)域的彌散細胞質的(圖13D)，其他則為整個區(qū)域呈水泡性染色(圖13F)。還應當注意的是，在罕見情況下，非腫瘤細胞諸如巨噬細胞和支氣管上皮細胞被ROSD4D6染色。在周圍間質組織不存在ROS表達。實施例10使用FISH測定法檢測人癌癥樣品中的ROS融合體使用前述熒光原位雜交(FISH)測定法檢測人NSCLC腫瘤樣品中SLC34A2-ROS融合蛋白和/或CD74-ROS蛋白(或另一種ROS融合蛋白)的存在。參見例如，Verma等人HumanChromosomes:AManualofBasicTechniques,PergamonPress,NewYork,N.Y.(1988)。檢測了超過200份石蠟包埋的人NSCLC腫瘤樣品。為了分析涉及ROS的重排，設計了雙色斷裂分離探針(break-apartprobe)。獲得了一個近端探針(proximalprobe)(BAC克隆RP1-179P9)和兩個遠端探針(distalprobe)(BAC克隆RP1l-323O17，RP1-94G16)(所有的都可以商業(yè)上獲得，例如來自InvitrogenInc.,Carlsbad,CA,如目錄號RPCI1.C和RPCI11.C)。這些探針結合到ROS基因的位置示意性地顯示在圖14。如圖19A中顯示，近端探針用橙色光譜的dUTP標記，并且遠端探針用綠色光譜的dUTP標記。根據制造商的說明(EnzoLifeSciences,Farmingdale,NY)使用切口平移DNA標記試劑盒完成探針的標記。根據標準方法在4-μm厚FFPE組織切片上進行FISH。例如，將石蠟包埋的組織切片再水化，并在0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中微波抗原修復11分鐘。在37℃用蛋白酶(4mg/ml胃蛋白酶，2000-3000U/mg)消化切片25分鐘、脫水并用FISH探針在37℃雜交18小時。洗滌后，使用于Vectashield封固介質(VectorLaboratories，Burlingame，CA)中的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；mg/ml)對核復染。ROS的FISH-陽性病例被定義為在腫瘤細胞中>15％分裂信號。使用NikonC1共聚焦顯微鏡(60X物鏡和三濾片(dapi,TRITC,FITC))用于對每種情況進行評分。對于圖像采集，使用具有40X物鏡和Metamorph軟件的OlympusBX-51寬視場熒光顯微鏡來生成三色圖像。因此，ROS重排探針含有兩種在野生型(WT)序列中ROS基因斷裂點相對側上的不同標記探針(參見圖14A)。當雜交時，天然ROS區(qū)域將出現橙色/綠色融合信號，而在這個基因座的重排(如在SLC34A2-ROS融合蛋白中)將導致產生單獨的橙色和綠色信號。如圖14B中顯示，在HCC78中發(fā)現重排的ROS基因(圖14B，左小圖)，如上所述，其含有導致SLC34A2-ROS融合的基因重排。在一份人肺樣品(即肺306)中，發(fā)現類似的ROS基因重排，其可以是SLC34A2-ROS或CD74-ROS。FISH分析揭示了在研究的樣品群體中這種ROS突變發(fā)生率低。最初篩選的123份腫瘤中，123份腫瘤中的兩份或者1.6％的腫瘤含有ROS融合突變。然而，鑒于在世界范圍內NSCLC的發(fā)生率很高(僅在美國，每年超過151,00新病例)，可以預期有大量的患者攜帶這種突變ROS，這些患者可能從ROS抑制性治療劑方案中獲益。實施例11FIG-ROS陽性NSCLC腫瘤的發(fā)現來自實施例9的一份腫瘤樣品(即腫瘤749)顯示定位于囊泡區(qū)室的ROS1染色(參見圖13F)。該染色模式不同于所有其他ROS1陽性腫瘤，這指向不同ROS1融合伴侶的可能性。為了確定該腫瘤749的FISH模式是什么，從Invitrogen獲得第三遠端探針RP11-213A17，以進一步研究該腫瘤中的ROS突變是否可能是由于FIG-ROS融合。FIG基因和ROS基因之間的融合已經描述于成膠質細胞瘤、膽管癌和肝癌中(參見Charest等人,GenesChromosomesCancer37:58-71,2003;Charest等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:916-921,2003;和PCT公開號WO2010/093928)，但該融合以前從未在肺中描述過。由于FIG基因和ROS基因之間的融合沒有導致易位或倒置，而是反而由240千堿基的染色體6上的染色體內缺失而導致，所以設計一組新的FISH探針。先前所述(參見上文實施例11)的IHC驗證測試中使用的FISH探針鑒定了具有ROS平衡易位的那些腫瘤和細胞，所述ROS平衡易位可能是由于SLC34A2-ROS融合蛋白或CD74-ROS融合蛋白中一種的存在而導致的。在肺749中的FISH模式表明，該重排不是這兩種融合體中的一種，但可能是FIG-ROS的模式。為了確定肺ID749是否確實是FIG-ROS陽性的，設計另一個FISH探針組(圖15)。如上實施例11中所述，含有179P9和323O17BACs的探針組1位于本文所述的ROS融合蛋白中ROS斷裂點的任一側的側翼(例如，在ROS的外顯子34、35或36之后)(參見圖15和圖14A)。在SLC34A-ROS陽性HCC78細胞(參見圖14B，左小圖和圖16A)中，探針組1導致平衡易位。在FIG-ROS陽性人U118MG成膠質細胞瘤細胞系中，323O17BAC沒有雜交，因為染色體6的該部分缺失，導致只有橙色信號(圖16C)。探針組2含有位于ROS上的179P9和位于FIG基因上的213A7，因此U118MG用該探針組顯示橙色和綠色信號兩者(參見圖16D)。HCC78細胞顯示具有平衡易位的1條染色體(例如，來自SLC34A2-ROS融合體；參見圖16B中的兩個黃色箭頭)，并且圖16B中的白色箭頭指向具有靠近在一起的綠色和橙色信號的正常染色體，因為FIG基因和ROS基因事實上在相同染色體上靠近在一起(參見圖16B)。野生型染色體由于探針之間的距離而顯示分離的信號。肺ID749，當用探針組1(圖16E)或探針組2(參見圖16F)探測時，模擬了U118MG細胞的信號(圖16C和D)。這些數據首次顯示FIG-ROS融合體作為NSCLC中染色體6上的染色體內缺失。實施例12來自肺腫瘤749的FIG-ROS(S)融合基因的分離和測序為了分離和測序來自腫瘤749的ROS融合體(這是福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤)，使用以下方案。從FFPE腫瘤樣品RT-PCR：遵循標準方案(RNeasyFFPE試劑盒，Qiagen)從3X10μm切片提取RNA。使用SuperScriptIII第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)以基因特異性引物從500ng總RNA合成第一鏈cDNA。然后，使用用于短同種型的PCR引物對FIG-F3和ROS-GSP3.1與用于長同種型的PCR引物對FIG-F7和ROS-GSP3.2擴增FIG-ROS融合cDNA。GAPDH引物購自Qiagen(Valencia,CA)。引物選擇用于FIG的引物，因為基于腫瘤749中觀察到的FISH模式和關于FIG-ROS融合體的公開信息，預測腫瘤749是FIG-ROS融合體。如預測，腫瘤749中的ROS融合蛋白的確是FIG-ROS融合體，特別是先前描述的FIG-ROS(S)融合體(參見PCT公開號WO2010/0923828)。圖17顯示了來自腫瘤749的FFPE塊的序列(在“本序列”行)與PCT公開號WO2010/0923828中描述的FIG-ROS(S)的序列(在“查詢序列”行中)的比對。如圖17中顯示，同一性為100％，缺口為0。由于FIG-ROS(S)含有ROS激酶的整個激酶結構域，所以預測該FIG-ROS(S)保留激酶活性，因此，是具有如本文所述的ROS激酶活性的蛋白。FIG-ROS(S)的氨基酸序列示于SEQIDNO:58，并且FIG-ROS(S)的核苷酸序列示于SEQIDNO:57。也已經描述了肝癌中的FIG-ROS(L)(參見PCT公開號WO2010/0923828)。FIG-ROS(L)的氨基酸和核苷酸序列分別示于SEQIDNOs56和55。此外，基于FIG和ROS基因的基因結構分析，已經提出了第三種ROS變體(即FIG-ROS(XL))(參見PCT公開號WO2010/0923828)。FIG-ROS(XL)的氨基酸和核苷酸序列分別示于SEQIDNOs60和59。鑒于NSCLC中的FIG-ROS(S)這一發(fā)現，在NSCLC中還發(fā)現了FIG-ROS融合蛋白的其他變體。實施例13使用PCR測定法檢測ROS激酶在人肺癌樣品中的表達。可以使用前面描述的基因組或逆轉錄酶(RT)聚合酶鏈式反應(PCR)檢測人肺癌樣品中異常表達的全長ROS蛋白或ROS融合蛋白(例如，SLC34A2-ROS融合蛋白之一、CD74-ROS融合蛋白、或FIG-ROS融合蛋白之一)的存在。參見，例如，Cools等人,N.Engl.J.Med.348:1201-1214(2003)。簡而言之，例如可以使用標準技術從患有NSCLC的患者中獲得腫瘤或胸膜滲出液樣品。構建針對截短的ROS激酶、SLC34A2-ROS融合蛋白、CD74-ROS或FIG-ROS的PCR探針。可以使用RNeasyMiniKit(Qiagen)從腫瘤或胸膜滲出液樣品中提取RNA?？梢允褂肈NeasyTissueKit(Qiagen)提取DNA。對于RT-PCR，使用例如SuperScriptTMIII第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen)用oligo(dT)20從例如2.5mg總RNA合成第一鏈cDNA。然后，使用引物對例如SLC34A2-F1和ROS-P3(參見上述實施例5)擴增ROS基因或ROS融合基因(例如，SLC34A2-ROS、CD74-ROS、或FIG-ROS)。對于基因組PCR，可以使用PlatinumTaqDNA高保真聚合酶(Invitrogen)并采用引物對例如SLC34A2-F1和ROS-R1、或者SLC34A2-F1和ROS-R2擴增融合基因。此類分析將鑒定患有特征在于表達截短的ROS激酶(和/或ROS融合蛋白，諸如FIG-ROS、SLC34A2-ROS或CD74-ROS)的癌癥的患者，所述患者是使用ROS抑制性治療劑治療的候選者。實施例14ROS激酶融合體對TAE-684和克里唑替尼(Crizotinib)的敏感性小分子TAE-684(5-氯-2,4-二氨基苯基嘧啶)抑制ALK激酶。Galkin,等人,Proc.NationalAcad.Sci104(1)270-275,2007(通過引用并入)中提供了TAE-684的結構。另一種小分子，即克里唑替尼，也抑制ALK激酶，以及MET激酶。ZouHY等人,CancerResearch67:4408-4417,2007和美國專利公開號20080300273(通過引用并入)中提供了克里唑替尼(也稱為PF-02341066)的結構。確定TAE-684和/或克里唑替尼是否也抑制ROS融合多肽。BaF3和Karpas299細胞從DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Germany)獲得。需要白介素-3存活的BaF3細胞在37℃下維持在具有10％胎牛血清(FBS)(Sigma)和1.0ng/ml鼠IL-3(R&DSystems)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen)中。Karpas299細胞(淋巴瘤細胞系)生長在具有10%FBS的RPMI-1640中。BaF3細胞用編碼FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)或FLT-3ITD(在FLT3中的內部串聯重復突變引起AML白血病)的逆轉錄病毒轉導，并且選擇IL3依賴性生長。表達NPM-ALK的Karpas299細胞被用作陽性對照。如前所述生成逆轉錄病毒(參見PCT公開號WO2010/093928，其通過引用并入)。使用CellTiter96水性單溶液試劑(Promega,目錄號G3582)進行MTS測定。簡而言之，24孔板中的1x105個細胞/孔在1mL培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基包括0nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM或1000nMTAE-684。72小時后，將20μlCellTiter96水性單溶液試劑添加至96孔測定板(平底)的各孔中，然后添加100μl在處理或沒有處理的情況下生長的細胞。僅有培養(yǎng)基的孔用作對照。96孔板在37℃下孵育1-4小時，然后使用96孔讀板器通過讀取490nm處的吸光度而計數活細胞。如圖18中顯示，用表達FIG-ROS多肽之一的逆轉錄病毒轉導的BaF3細胞在TAE-684存在的情況下停止生長。與FIG-ROS(L)相比，FIG-ROS(S)更不易受TAE-684影響。Karpas299細胞在TAE-684存在的情況下也響應(即停止生長)。用FLT3/ITD轉導的BaF3細胞不易受TAE-684影響。來自兩次實驗的IC50值在如下表4中，其中數據來自最后的細胞系，即表達myc-標簽的新霉素的BaF3細胞，其僅在第二次實驗中可獲得。表4接下來通過使用切割的胱天蛋白酶-3作為細胞凋亡的標記通過流式細胞術測量切割的胱天蛋白酶-3陽性細胞的百分比來評估BaF3和Karpas299細胞的死亡機制。這些結果使用從CellSignalingTechnology,Inc.(Danvers,MA)可公開獲得的方案獲得。如圖19中顯示，TAE-684的存在引起表達FIG-ROS(S)或FIG-ROS(L)的BaF3細胞通過細胞凋亡而死亡。在TAE-684存在的情況下停止生長的Karpas299細胞沒有通過細胞凋亡而死亡-它們只是經歷細胞周期停滯。因此，TAE-684抑制FIG-ROS融合多肽的機制不同于TAE-684抑制ALK激酶的機制。為了進一步鑒定TAE-684對ROS融合多肽的作用機制，所有四個細胞系(即，用編碼FIG-ROS(S)、FIG-ROS(L)和FLT-3ITD的逆轉錄病毒轉導的Karpas299細胞和BaF3細胞)在用0、10、50、或100nMTAE-684處理三個小時之后進行Western印跡分析。所有抗體均來自CellSignalingTechnology,Inc.(Danvers,MA)。如圖20中顯示，表達FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)的BaF3細胞中FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)兩者的磷酸化均受TAE-684抑制。此外，STAT3、AKT、和ERK、和Shp2的磷酸化在表達FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)的BaF3細胞中被抑制。STAT3、AKT、和ERK、和Shp2的磷酸化在用FLT-3ITD逆轉錄病毒轉導的BaF3細胞中不受影響。TAE-684還抑制Karpas299細胞中的ALK和ERK磷酸化。由于ROS、ALK、LTK、InsR、和IGFlR屬于酪氨酸激酶的相同家族，所以它們可能在激酶結構域共有相似的結構。針對ALK、LTK、InsR、和IGFlR設計的激酶抑制劑或抗體可能具有針對ROS激酶的治療效果。接下來使用相同的方案在相同細胞上進行平行組實驗，其中添加另一個陰性對照，即用neo-myc標簽轉導的BaF3細胞，以比較兩種ALK治療劑，即TAE-684和克里唑替尼。如圖21A(TAE-684)和圖21B(克里唑替尼)中顯示，在相同濃度的各治療劑時，與對克里唑替尼相比，含有FIG-ROS融合蛋白的BaF3細胞對TAE-684更敏感。這可能是克里唑替尼沒有和類似劑量的TAE-684一樣有效，因為與相同濃度的TAE-684相比，甚至陽性對照(即表達NPM-ALK融合蛋白的Karpas299細胞)對克里唑替尼也不敏感。與表達FIG-ROS蛋白的BaF3細胞和表達NPM-ALK蛋白的Karpas299相比，兩個陰性對照(即，用FLT3-ITD轉導的BaF3或用neo-myc轉導的BaF3)都對克里唑替尼和TAE-684不太敏感。在用0、0.1、0.3、或1.0uM克里唑替尼處理三個小時之后，接下來使用從CellSignalingTechnology,Inc獲得的抗體進行Western印跡分析。如圖22中顯示，表達FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)的BaF3細胞中FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)兩者的磷酸化均被克里唑替尼抑制。此外，STAT3和ERK的磷酸化在表達FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)的BaF3細胞中被克里唑替尼抑制。在克里唑替尼處理之后，STAT3和ERK的磷酸化在用FLT-3ITD逆轉錄病毒轉導的BaF3細胞中不受影響。克里唑替尼還抑制Karpas299細胞中ALK、STAT3和ERK磷酸化。由于ROS、ALK、LTK、InsR、和IGFlR屬于酪氨酸激酶的相同家族，所以它們可能在激酶結構域共有相似的結構。針對ALK、LTK、InsR、和IGFlR設計的激酶抑制劑或抗體可能具有針對ROS激酶的治療效果。實施例15表達ALK和/或ROS的NSCLC的調查。除了ROS激酶以外，也已經描述了含有具有ALK活性的蛋白的NSCLC(參見，例如，美國專利號7,700,339；7,605,131；7,728,120)。使用上述實施例9中描述的IHC方法，篩選人NSCLC腫瘤的許多FFPE樣品被抗ROS或抗ALK抗體的特異性結合。此類抗體可商購自許多來源。還使用標準方法用針對ROS基因或對ALK基因的FISH篩選相同樣品。例如，對于ROS基因的FISH方案描述在上述實施例中。對于ALK的FISH方案描述在美國專利號7,700,339(其通過引用并入本文)中。同樣，另一種FISH測定法描述在美國專利公開號20110110923(其通過引用并入本文)中。篩選結果顯示在下表5(ROS陽性樣品)和表6(ALK陽性樣品)。表5ROS1陽性樣品的組織病理學患者編號腫瘤ID診斷組織學模式(%)ROS1FISH1147腺癌BAC(40)，乳頭狀(30)，腺泡狀(20)，實體(10)+2306腺癌腺泡狀(70)，乳頭狀(20)，和實體(10)+3570腺癌腺泡狀(90)，BAC(5)，微乳頭狀(5)+4400037腺癌腺泡狀+5668腺癌實體(80)，腺泡狀(10)，BAC(10)+6702腺癌乳頭狀(40)，腺泡狀(30)，實體(30)+7749腺癌實體(80)，腺泡狀(20)+，綠色缺失8760腺癌印戒細胞(Signetcells)+9575大細胞無法評分的表6：ALK陽性病例的組織病理學?；谶@種通過IHC和FISH兩者對人NSCLC的篩選，發(fā)現ALK和ROS在這些腫瘤中的表達是相互排斥的。換言之，如果NSCLC腫瘤被ALK驅動，則它將不表達ROS。同樣，如果NSCLC腫瘤被ROS驅動，則它將不表達ALK。因此，抑制ROS活性和ALK活性兩者的治療劑諸如克里唑替尼或TAE-684在治療NSCLC中將是特別有效的。等同方案應當理解的是，盡管本公開已經結合其詳述進行了描述，但是前述描述旨在說明而不是限制本發(fā)明的范圍，所述本發(fā)明的范圍由所附權利要求的范圍所定義。其他方面、優(yōu)點和修改在以下權利要求的范圍之內。1.用于檢測生物樣品中FIG-ROS融合多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌，所述方法包括以下步驟：(a)獲得哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品；并且(b)利用至少一種特異性結合所述多肽的試劑來確定在所述生物樣品中是否存在所述多肽，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在所述多肽。2.實施方案1的方法，其中所述哺乳動物肺癌是人肺癌。3.實施方案1的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽與選自下列的多肽95%相同：FIG-ROS(S)多肽(SEQIDNO:58)、FIG-ROS(L)多肽(SEQIDNO:56)和FIG-ROS(VL)多肽(SEQIDNO:60)。4.實施方案1的方法，其中所述試劑是抗體。5.實施方案1的方法，其中所述方法以選自流式細胞術測定、免疫組織化學(IHC)測定、免疫熒光(IF)測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定法和Western印跡分析測定的形式實施。6.用于檢測生物樣品中編碼FIG-ROS融合多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌，所述方法包括以下步驟：(a)獲得哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品，并且(b)利用特異性結合編碼所述多肽的所述多核苷酸的試劑來確定在所述生物樣品中是否存在所述多核苷酸，其中所述特異性結合所述編碼所述多肽的多核苷酸的試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在所述編碼所述多肽的多核苷酸。7.實施方案6的方法，其中所述哺乳動物肺癌是人肺癌。8.實施方案6的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽與選自下列的多肽95%相同：FIG-ROS(S)多肽(SEQIDNO:58)、FIG-ROS(L)多肽(SEQIDNO:56)和FIG-ROS(VL)多肽(SEQIDNO:60)。9.實施方案6的方法，其中所述多核苷酸包含選自SEQIDNO:57、SEQIDNO:55、SEQIDNO:59的核苷酸序列。10.實施方案6的方法，其中所述試劑是核酸探針。11.實施方案10的方法，其中所述核酸探針是熒光原位雜交(FISH)探針，且所述方法用FISH測定法實施。12.實施方案6的方法，其中所述試劑包含聚合酶鏈式反應(PCR)引物對，且所述方法用PCR測定法實施。13.實施方案1或6的方法，其中所述試劑是可檢測地標記的。14.物質在制備試劑中的用途，所述試劑用于抑制表達FIG-ROS融合多肽的肺癌的進展的方法中，所述方法包括抑制所述多肽在所述癌癥中的表達和/或活性的步驟。15.物質在制備試劑中的用途，所述試劑用于抑制包含編碼FIG-ROS融合多肽的多核苷酸的肺癌的進展的方法中，所述方法包括抑制所述多核苷酸在所述癌癥中的表達的步驟。16.實施方案14或15的用途，其中所述哺乳動物肺癌來自人。17.實施方案14的用途，其中所述物質是選自PF-02341066、NVTTAE-684和AP26113的治療劑。18.將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑒定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者的方法，所述方法包括：將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合FIG-ROS融合多肽的試劑相接觸，檢測所述試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑒定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者。19.實施方案18的方法，其中所述ROS抑制性治療劑是PF-02341066、NVTTAE-684或AP26113。20.ROS-抑制性治療劑在制備試劑中的用途，所述試劑用于治療患者的肺癌的方法中，所述方法包括檢測來自患有肺癌或疑似患有肺癌的患者的生物樣品中FIG-ROS融合多肽的存在，并且將有效量的所述試劑施用于所述患者。21.實施方案20的用途，其中所述治療劑是PF-02341066、NVTTAE-684或AP26113。當前第1頁1 2 3