專利名稱：一種蚓激酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蚓激酶的制備方法。
背景技術：
地龍又名蚯蚓，在我國已有四千多年入藥歷史，臨床應用廣泛，療效顯著，無毒副作用。?，F(xiàn)代藥理研究認為地龍有抗凝血、溶血雙重作用，有降壓，抗心律失常，鎮(zhèn)靜，抗驚厥，平咳，抗腦缺血，促進傷口愈合等作用，可治療細菌病毒感染，燒燙傷，癌癥，免疫性等疾病。近二十年來，世界上許多國家，如美國、日本、加拿大、英國、德國、澳大利亞等，都比較重視蚯蚓的養(yǎng)殖應用和研究工作日本宮崎醫(yī)科大學美原恒教授Mihara于1982年報道了從艇蝴(Lumbricus rubellus)中提取一組具有纖溶活性的蝴激酶。韓國Ryu用日本Mihara的方法從Φ丘蝴(Lumbricus rubellus)中提取出由六個成分組成的具有強纖溶活性的蚓激酶成分。北京大學生命科學院、清華大學、中國科學院生物物理研究所等單位的科研人員通過國家“八五”科技攻關計劃，歷時十余年的艱苦努力，采取現(xiàn)代生物技術從蚯蚓中分離提取有效組分蚓激酶。中國農(nóng)業(yè)大學孫振鈞教授等對蚯蚓的抗菌肽進行了深入研究。珠海博康藥業(yè)有限公司及北京百奧藥業(yè)有限公司先后研制出治療心腦血管疾病國家II類新藥“蚓激酶腸溶膠囊”，突破了抗栓溶栓藥物不能口服的禁區(qū)，成為唯一被國內(nèi)外認可、首個具有特異性的口服抗栓溶栓生物技術藥物。我國科研人員在國家自然科學基金、國家重點基礎研究發(fā)展計劃“973”計劃的支持下，開始在分子層面上探索這種酶制劑的溶栓機制，以從根本上闡明其作用機理，與日本、韓國等發(fā)達國家展開了激烈地競爭。2003年，我國科研人員經(jīng)過五年多的努力在世界上率先測定了一種具有溶栓活性的蛋白質(zhì)——蚓激酶的三維結(jié)構(gòu)，從而為在分子層面上了解這一蛋白藥物開啟了大門。這不僅為進一步的藥物設計奠定基礎，也使蚓激酶成為我國最早被測定三維結(jié)構(gòu)的蛋白藥物之一。在已有的蚓激酶的研究方法和生產(chǎn)工藝中，都存在著蚯蚓原材料的選取較單一，只能用鮮活的蚯蚓作為原材料，工藝過程較復雜，且只能單一的分離提取一種物質(zhì)，產(chǎn)品的有效成分較低，所含重金屬離子較高，生產(chǎn)的廢渣廢液回收利用率較低，生產(chǎn)成本較高等諸多問題，本方法針對以上問題做了研究和改進，實現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)所必須的條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種蚓激酶的制備方法。本發(fā)明的技術方案概述如下一種蚓激酶的制備方法，包括如下步驟(1)冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質(zhì)量3-5倍的體積濃度為50%_95%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié) pH = 5. 5-6. 5,閃式提取 2min-5min ；(2)采用離心機對步驟(I)獲得的提取液進行分離得到沉淀I和上清液I ;
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(3)向步驟(2)分離得到的沉淀I中加入所述沉淀I質(zhì)量3-5倍的去離子水，調(diào)節(jié)pH = 7. 0-7. 5,閃式提取2min-5min,離心分離,得到上清液2 ；(4)向上清液2中，加入所述上清液2質(zhì)量15%_25%的質(zhì)量濃度為O. 1%_0· 5%的聚丙烯酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)PH = 6. 5-7. 5，攪拌15-30min，離心分離，得到上清液3 ；(5)向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質(zhì)量濃度為17%_23%，調(diào)節(jié)PH = 6. 5-7. 5，離心分離，得到上清液4 ；(6)向上清液4中補加硫酸銨，使硫酸銨在上清液4中的質(zhì)量濃度為50%_70%，調(diào)節(jié)pH = 5. 5-6. 5 ;離心分離得到沉淀2 ；(7)向沉淀2中加入所述質(zhì)量2-4倍的去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑 TMTH-15調(diào)節(jié)pH = 8. 5-9. 5，離心得到上清液5 ；(8)將上清液5進行超濾濃縮，以除去上清液5中的硫酸銨，得到超濾濃縮液；(9)調(diào)節(jié)超濾濃縮液pH = 7-7. 5 ;冷凍干燥，得到蚓激酶。所述步驟(I)優(yōu)選為冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質(zhì)量4倍的體積濃度為75%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié)pH = 6. O,閃式提取3min。所述步驟(3)優(yōu)選為向步驟(2)分離得到的沉淀中加入所述沉淀質(zhì)量4倍的去離子水，調(diào)節(jié)pH = 7. 3,閃式提取3min,離心分離,得到上清液2。所述步驟(4)優(yōu)選為向上清液2中，加入所述上清液2質(zhì)量20%的質(zhì)量濃度為O. 3%的聚丙烯酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH = 7. 0，攪拌20min，離心分離，得到上清液3。所述步驟(5)優(yōu)選為向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質(zhì)量濃度為20%,調(diào)節(jié)pH = 7.0,離心分離，得到上清液4。所述步驟(6)優(yōu)選為向上清液4中補加硫酸銨，使硫酸銨在上清液4中的質(zhì)量濃度為60%，調(diào)節(jié)pH = 6. O ;離心分離得到沉淀2。所述步驟(7)優(yōu)選為向沉淀2中加入所述質(zhì)量3倍的去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑TMTH-15調(diào)節(jié)pH = 9. O,離心得到上清液5。本發(fā)明的優(yōu)點( I)本發(fā)明的方法工藝簡單，產(chǎn)率高，有效組分含量高，質(zhì)量易控制。(2)原料來源廣泛，前處理簡單，成本低廉。(3)本發(fā)明能有效的達到廢水，廢液的無害化回收處理，不污染環(huán)境，且有效的降低生產(chǎn)成本。(4)本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)品重金屬離子含量較低。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例I一種蚓激酶的制備方法，包括如下步驟(I)冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質(zhì)量4倍的體積濃度為75%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié)pH =調(diào)節(jié)pH = 6. O,閃式提取3min ；(2)采用離心機對步驟(I)獲得的提取液進行分離得到沉淀I和上清液I ;(3)向步驟(2)分離得到的沉淀I中加入所述沉淀I質(zhì)量4倍的去離子水，調(diào)節(jié)pH=7. 3,閃式提取3min,離心分離,得到上清液2 ；(4)向上清液2中，加入所述上清液2質(zhì)量20%的質(zhì)量濃度為O. 3%的聚丙烯酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)PH = 7. 0，攪拌20min，離心分離，得到上清液3 ；(5)向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質(zhì)量濃度為20%，調(diào)節(jié)pH =7.0，離心分離，得到上清液4;(6)向上清液4中補加硫酸銨，使硫酸銨在上清液4中的質(zhì)量濃度為60%，調(diào)節(jié)pH=6. O ;尚心分尚得到沉 疋2 ；(7)向沉淀2中加入所述質(zhì)量3倍的去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑TMTH-15調(diào)節(jié)pH = 9.0,離心得到上清液5 ；(8)將上清液5進行超濾濃縮，以除去上清液5中的硫酸銨，得到超濾濃縮液；(9)調(diào)節(jié)超濾濃縮液pH = 7. 3 ;冷凍干燥，得到蚓激酶。蚓激酶產(chǎn)率達到冷凍蚯蚓質(zhì)量的O. 95%，效價大于22000 μ /mg。實施例2—種蚓激酶的制備方法，包括如下步驟(I)冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質(zhì)量3倍的體積濃度為95%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié)pH = 5. 5,閃式提取2min ；(2)采用離心機對步驟(I)獲得的提取液進行分離得到沉淀I和上清液I ;(3)向步驟(2)分離得到的沉淀I中加入所述沉淀I質(zhì)量3倍的去離子水，調(diào)節(jié)pH=7. O,閃式提取5min,離心分離,得到上清液2 ；(4)向上清液2中，加入所述上清液2質(zhì)量15%的質(zhì)量濃度為O. 5%的聚丙烯酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)PH = 6. 5，攪拌30min，離心分離，得到上清液3 ；(5)向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質(zhì)量濃度為17%，調(diào)節(jié)pH =7. 5，離心分離，得到上清液4;(6)向上清液4中補加硫酸銨，使硫酸銨在上清液4中的質(zhì)量濃度為50%，調(diào)節(jié)pH=5. 5 ;尚心分尚得到沉 疋2 ；(7)向沉淀2中加入所述質(zhì)量2倍的去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑TMTH-15調(diào)節(jié)pH = 8. 5，離心得到上清液5 ；(8)將上清液5進行超濾濃縮，以除去上清液5中的硫酸銨，得到超濾濃縮液；(9)調(diào)節(jié)超濾濃縮液pH = 7 ;冷凍干燥，得到蚓激酶。蚓激酶產(chǎn)率達到冷凍蚯蚓質(zhì)量的I. 02%，效價大于20200 μ /mg。實施例3一種蚓激酶的制備方法，包括如下步驟(I)冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質(zhì)量5倍的體積濃度為50%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié)pH = 6. 5,閃式提取5min ；(2)采用離心機對步驟(I)獲得的提取液進行分離得到沉淀I和上清液I ;(3)向步驟(2)分離得到的沉淀I中加入所述沉淀I質(zhì)量5倍的去離子水，調(diào)節(jié)pH=7. 5,閃式提取2min,離心分離,得到上清液2 ；(4)向上清液2中，加入所述上清液2質(zhì)量25%的質(zhì)量濃度為O. 1%的聚丙烯酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)PH = 7. 5，攪拌15，離心分離，得到上清液3 ；
(5)向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質(zhì)量濃度為23%，調(diào)節(jié)pH =
6.5，離心分離，得到上清液4;(6)向上清液4中補加硫酸銨，使硫酸銨在上清液4中的質(zhì)量濃度為70%，調(diào)節(jié)pH=6. 5 ;尚心分尚得到沉 疋2 ；(7)向沉淀2中加入所述質(zhì)量4倍的去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑TMTH-15調(diào)節(jié)pH = 9. 5，離心得到上清液5 ；(8)將上清液5進行超濾濃縮，以除去上清液5中的硫酸銨，得到超濾濃縮液；(9)調(diào)節(jié)超濾濃縮液pH = 7. 5 ;冷凍干燥，得到蚓激酶。
蚓激酶產(chǎn)率達到冷凍蚯蚓質(zhì)量的O. 90%,效價大于23200 μ /mg。
權(quán)利要求
1.一種蚓激酶的制備方法，其特征是包括如下步驟 (1)冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質(zhì)量3-5倍的體積濃度為50%-95%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié) pH = 5. 5-6. 5,閃式提取 2min_5min ； (2)采用離心機對步驟(I)獲得的提取液進行分離得到沉淀I和上清液I; (3)向步驟(2)分離得到的沉淀I中加入所述沉淀I質(zhì)量3-5倍的去離子水，調(diào)節(jié)pH=7. 0-7. 5,閃式提取2min-5min,離心分離,得到上清液2 ； (4)向上清液2中，加入所述上清液2質(zhì)量15%-25%的質(zhì)量濃度為O.1%-0. 5%的聚丙烯酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)PH = 6. 5-7. 5，攪拌15-30min，離心分離，得到上清液3 ； (5)向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質(zhì)量濃度為17%-23%，調(diào)節(jié)pH=6.5-7. 5，離心分離，得到上清液4 ； (6)向上清液4中補加硫酸銨，使硫酸銨在上清液4中的質(zhì)量濃度為50%-70%，調(diào)節(jié)pH=5. 5-6. 5 ;離心分離得到沉淀2 ； (7)向沉淀2中加入所述質(zhì)量2-4倍的去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑TMTH-15調(diào)節(jié)pH = 8. 5-9. 5，離心得到上清液5 ； (8)將上清液5進行超濾濃縮，以除去上清液5中的硫酸銨，得到超濾濃縮液； (9)調(diào)節(jié)超濾濃縮液pH= 7-7. 5 ;冷凍干燥，得到蚓激酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種蚓激酶的制備方法，其特征是所述步驟(I)為冷凍蚯蚓解凍，加入所述蚯蚓質(zhì)量4倍的體積濃度為75%的乙醇水溶液，調(diào)節(jié)pH = 6. O,閃式提取3min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種蚓激酶的制備方法，其特征是所述步驟(3)為向步驟(2)分離得到的沉淀中加入所述沉淀質(zhì)量4倍的去離子水，調(diào)節(jié)pH = 7. 3，閃式提取3min，離心分離，得到上清液2。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種蚓激酶的制備方法，其特征是所述步驟(4)為向上清液2中，加入所述上清液2質(zhì)量20%的質(zhì)量濃度為O. 3%的聚丙烯酸鈉水溶液，調(diào)節(jié)pH = 7. 0，攪拌20min，離心分離，得到上清液3。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種蚓激酶的制備方法，其特征是所述步驟(5)為向上清液3中加硫酸銨，使硫酸銨在上清液3中的質(zhì)量濃度為20%，調(diào)節(jié)pH = 7. 0，離心分離，得到上清液4。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種蚓激酶的制備方法，其特征是所述步驟(6)為向上清液4中補加硫酸銨，使硫酸銨在上清液4中的質(zhì)量濃度為60%，調(diào)節(jié)pH = 6. O ;離心分離得到沉淀2。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種蚓激酶的制備方法，其特征是所述步驟(7)為向沉淀2中加入所述質(zhì)量3倍的去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑TMTH-15調(diào)節(jié)pH = 9. 0，離心得到上清液5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蚓激酶的制備方法，步驟為冷凍蚯蚓解凍，加乙醇水溶液，閃式提??；分離得沉淀1和上清液1；向沉淀1中加去離子水，閃式提取，分離，得上清液2；向上清液2中，加入聚丙烯酸鈉水溶液，攪拌，分離，得上清液3；向上清液3中加硫酸銨，分離，得上清液4；向上清液4中補加硫酸銨，離心分離得沉淀2；向沉淀2中加入去離子水溶解，用新型重金屬離子去除劑TMTH-15調(diào)節(jié)pH，離心得上清液5；將上清液5進行超濾濃縮，得濃縮液；調(diào)pH；干燥，得到蚓激酶。本發(fā)明的方法工藝簡單，產(chǎn)率高，有效成分含量高，質(zhì)量易控。原料來源廣，前處理簡單，成本低廉。廢水，廢液的無害化回收處理，不污染環(huán)境，產(chǎn)品重金屬離子含量低。
文檔編號C12N9/68GK102925421SQ20121049455
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月27日
發(fā)明者白鶴松, 董文超, 劉瑞, 楊成博, 田艷維 申請人:天津蚓福生物科技開發(fā)有限公司