專利名稱：蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離方法，尤其是涉及一種采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑的等電沉淀雜蛋白分離提純蚓激酶的方法。
背景技術(shù)：
蚓激酶(lumbrokinase)是自蚯蚓中提取出來的具有纖溶酶活性的多組分蛋白質(zhì)的總稱，是目前較有開發(fā)前景的纖溶藥物之一?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明，蚓激酶是一組分子量為20～40kD、具有激酶和纖溶酶活性的絲氨酸蛋白酶，其中較多活性組分等電點集中在4.0以下。此外，蚯蚓中還含有其他一些生物活性成分，因而采用溫和、環(huán)保的辦法分離提純蚓激酶對于其中多種營養(yǎng)和藥物有效成分的分離具有較重要的意義。目前蚓激酶是將新鮮的赤子愛勝蚓搗碎，離心收集上清夜，然后從上清液中鹽析得到沉淀，繼而脫鹽凍干后的粗加工制品[1]。專利00132716.X公開了一種蚓激酶的分離工藝，包括食鹽處理、洗凈、加緩沖液、制漿、離心、親和層析，離子交換層析等步驟，該過程操作復(fù)雜，酶損失量較大。且該分離工藝沒有考慮到蚯蚓中其他活性組分的提取和分離問題。
參考文獻(xiàn)[1]王東鵬，孫貴寶，高活性蚓激酶提取工藝研究，寧夏科技，2001，(6)，44-45發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法。
方法的步驟如下1)首先，將蚓激酶粗品溶于乙醇-水溶液中，配制粗酶濃度為2～7％(質(zhì)量百分比)，乙醇濃度為0～40％(體積百分比)的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到預(yù)熱溫度為20～40℃高壓釜中，繼而通入預(yù)熱溫度為20～40℃，壓力為3.5～8.5MPa的加壓CO2同時攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH為4.4，在高壓下保持20～60分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中，再將沉淀分離出去即可。
本發(fā)明與傳統(tǒng)等電沉淀方法相比，酶活損失少，同時又比傳統(tǒng)的等電沉淀體系具有較多的優(yōu)勢，如操作條件比較溫和，且可同時得到蚓激酶粗品中的多種活性成分。另外乙醇的加入可使水溶性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)易于沉淀出來，所加助劑乙醇量較有機(jī)溶劑沉淀法要少很多，因而酶活損失很少。采用加壓CO2進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)可以避免用無機(jī)酸等調(diào)節(jié)溶液pH時酸過量或局部pH過低的情況，減少因此帶來的蛋白質(zhì)變性。由于CO2在溶液中大多以分子形式存在，這使得溶液離子強(qiáng)度不會因此過多升高，因而比無機(jī)酸更適于等電沉淀中的pH調(diào)節(jié)。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)所存在的操作條件苛刻，無法同時得到蚯蚓酶中其它活性成分，酶損失量較大等技術(shù)問題，提供了一種操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶活基本無損失的蚓激酶的分離提純方法。本發(fā)明還解決了現(xiàn)有技術(shù)所存在的操作條件難以精確控制，操作過程波動較大等技術(shù)問題，提供了一種操作參數(shù)可精確控制，操作過程無波動的一種蚓激酶的分離提純方法。
具體實施例方式
本發(fā)明采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)；分離提純步驟包括蚓激酶乙醇-水溶液的配制，用加壓CO2將溶液pH調(diào)至所需范圍，過濾沉淀出來的雜蛋白，而蚓激酶仍然存留在濾液中。為實現(xiàn)該過程，首先配制合適濃度的蚓激酶的乙醇-水溶液，然后取適量的溶液加入到高壓釜中，繼而通入加壓CO2，用來調(diào)節(jié)溶液的pH至所需范圍，由于蚓激酶粗品中的一些無激酶活性蛋白質(zhì)的沉淀pH在3.0～5.0之間，而在此范圍內(nèi)蚓激酶類并不沉淀，因而用CO2將溶液pH調(diào)至此范圍時，蚓激酶中的無激酶活性蛋白質(zhì)就會沉淀出來，從而達(dá)到分離提純的效果。本發(fā)明所采用的加壓CO2-乙醇-水體系用于等電沉淀蛋白質(zhì)，蚓激酶的分離提純方法的高壓釜預(yù)熱溫度和CO2預(yù)熱溫度為20～40℃，CO2壓力為3.5～8.5MPa，纖維素酶質(zhì)量百分比濃度為2～7％，乙醇溶液體積百分比濃度為0～40％，CO2壓力維持時間為20～60分鐘。
下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明。實施例1稱取適量的蚓激酶粗品配制成乙醇濃度為30％(體積百分比)，粗酶濃度為4％(質(zhì)量百分比)的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物。然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至25℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度25℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至7.0MPa，并調(diào)節(jié)操作溫度至25℃，此時溶液的pH為4.4，釜內(nèi)沉淀現(xiàn)象明顯，在高壓下保持40分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中。然后將沉淀分離出來，酶活得率為98.6％，該過程的純化倍數(shù)2.53。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉淀出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例2稱取適量的蚓激酶粗品配制成乙醇濃度為40％(體積百分比)，粗酶濃度為6％(質(zhì)量百分比)的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物。然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至25℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度25℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至4.5MPa，并調(diào)節(jié)操作溫度至25℃，釜內(nèi)沉淀現(xiàn)象明顯，在高壓下保持55分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中。然后將沉淀分離出來，酶活得率為94.1％，該過程的純化倍數(shù)2.41。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉淀出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例3稱取適量的蚓激酶粗品配制成乙醇濃度為35％(體積百分比)，粗酶濃度為2％(質(zhì)量百分比)的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物。然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至20℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度20℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至3.5MPa，并調(diào)節(jié)操作溫度至20℃，釜內(nèi)沉淀現(xiàn)象明顯，在高壓下保持30分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中。然后將沉淀分離出來，酶活得率為97.9％，該過程的純化倍數(shù)1.11。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉淀出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例4稱取適量的蚓激酶粗品配制成乙醇濃度為0％(體積百分比)，粗酶濃度為5％(質(zhì)量百分比)的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物。然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至40℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度40℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至8.5MPa，并調(diào)節(jié)操作溫度至40℃，釜內(nèi)沉淀現(xiàn)象明顯，在高壓下保持20分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中。然后將沉淀分離出來，酶活得率為98.1％，該過程的純化倍數(shù)1.29。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉淀出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例5稱取適量的蚓激酶粗品配制成乙醇濃度為30％(體積百分比)，粗酶濃度為3％(質(zhì)量百分比)的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物。然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至35℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度35℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至6.0MPa，并調(diào)節(jié)操作溫度至35℃，釜內(nèi)沉淀現(xiàn)象明顯，在高壓下保持60分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中。然后將沉淀分離出來，酶活得率為97.6％，該過程的純化倍數(shù)1.63。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉淀出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例6稱取適量的蚓激酶粗品配制成乙醇濃度為15％，粗酶濃度為7％的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物。然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至30℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度30℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至5.5MPa，并調(diào)節(jié)操作溫度至30℃，釜內(nèi)沉淀現(xiàn)象明顯，在高壓下保持50分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中。然后將沉淀分離出來，酶活得率為97.3％，該過程的純化倍數(shù)2.99。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉淀出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例7稱取適量的蚓激酶粗品配制成乙醇濃度為25％(體積百分比)，粗酶濃度為4％(質(zhì)量百分比)的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物。然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至30℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度30℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至8.0MPa，并調(diào)節(jié)操作溫度至30℃，釜內(nèi)沉淀現(xiàn)象明顯，在高壓下保持35分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中。然后將沉淀分離出來，酶活得率為98.9％，該過程的純化倍數(shù)2.61。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉淀出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
權(quán)利要求
1.一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特征在于方法的步驟如下1)首先，將蚓激酶粗品溶于乙醇-水溶液中，配制粗酶質(zhì)量百分比濃度為2～7％，乙醇體積百分比濃度為0～40％的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到預(yù)熱溫度為20～40℃高壓釜中，繼而通入預(yù)熱溫度為20～40℃，壓力為3.5～8.5MPa的加壓CO2同時攪拌，調(diào)節(jié)溶液的pH為4.4，在高壓下保持20～60分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉淀出來，而活性成分仍存留在溶液中，再將沉淀分離出去即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特征在于所說的高壓釜預(yù)熱溫度和CO2預(yù)熱溫度為25～35℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特征在于所說的CO2壓力為6.0～8.0MPa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特征在于所說的酶質(zhì)量百分比濃度為3～6％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特征在于所說的乙醇溶液體積百分比濃度為15～35％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特征在于所說的CO2壓力維持時間為30～50分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法。方法的步驟如下1)首先，將蚓激酶粗品溶于乙醇－水溶液中，配制粗酶質(zhì)量百分比濃度為2～7％，乙醇體積百分比濃度為0～40％的溶液，反復(fù)攪拌溶解后濾去不溶物；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到預(yù)熱溫度為20℃～40℃高壓釜中，繼而通入預(yù)熱溫度為20℃～40℃，壓力為3.5～8.5MPa的加壓CO
文檔編號C12N9/64GK1587398SQ20041005404
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者姚善涇, 關(guān)怡新, 齊祥明 申請人:浙江大學(xué)