專利名稱：一種低免疫原性蚓激酶及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蚓激酶的制備方法，特別是涉及ー種低免疫原性蚓激酶的制備方法和由其制備的可供ロ服、注射的多種劑型的藥物制劑。屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血栓和心腦血管疾病是ー種嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，全世界毎年死于血栓和心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)2500萬人，居各種死因之首。血栓和心腦血管疾病已成為導(dǎo)致人類死亡的頭號殺手。血栓和心腦血管疾病具有“四高一多”的特點，即“發(fā)病率高、致殘率高、 死亡率高、復(fù)發(fā)率高，并發(fā)癥多”，目前，我國血栓和心腦血管疾病患者已經(jīng)超過3. 7億人，我國每年死于血栓和心腦血管疾病的人達(dá)530萬人，占我國每年總死亡人數(shù)的60%。而幸存下來的患者中75%患不同程度的并發(fā)癥。因此，快速滲透，溶解血栓淤阻，使血管暢通，靜脈曲張逐漸回落是治療血栓和心腦血管疾病的關(guān)鍵。迄今為止人們已從多種生物組織中提取得到各種各樣的溶栓酶，如鏈激酶、尿激酶、蝮蛇抗栓酶等并已開發(fā)成溶血栓類藥物。這些藥物在臨床使用上,易引起出血、過敏等副作用；有的品種給藥方式単一，使得用藥范圍受到很大限制；而有的原料非常缺乏，從而導(dǎo)致藥價非常昂貴。理想的溶栓藥物要求可迅速溶解血栓、無毒、無出血等副作用，給藥方便，價格便宜。因此尋找有效的治療藥物是國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界重點攻關(guān)的熱點之一。鑒于蚯蚓蚓激酶能溶解血栓，無毒副作用，且來源豐富、療效顯著，因此，人們期望能將蚯蚓蚓激酶開發(fā)成ー種新型的溶栓藥劑。九十年代初，日本、韓國及我國的江西江中制藥廠、山東青島雙龍藥業(yè)有限公司等制藥企業(yè)相繼開發(fā)成功價格廉、療效佳的ロ服蚓激酶膠囊，如博洛克，該產(chǎn)品為多組分酶制齊U，經(jīng)臨床驗證該酶可降低血液粘滯度、改善微循環(huán)。對缺血性心腦血管病、陳舊性血栓病、高血壓、動脈硬化、心肌梗塞等具有較好治療作用，尤其對因腦血管病導(dǎo)致的肢體癱瘓及語言障礙的恢復(fù)效果顯著。但是，ロ服劑型在體內(nèi)易受酶、抑制劑等分解破壞，也不易進(jìn)入病灶細(xì)胞和組織，人體生物利用度低，吸收慢，起效時間長而無法作急救之用，此外蚓激酶對人體而言屬于異種蛋白，即使純度達(dá)到要求，也可能會在采用非腸胃道給藥途徑(如注射、輸液等)進(jìn)入人體后，使人體產(chǎn)生免疫過敏反應(yīng)，使藥物失去臨床療效，甚至?xí)＜吧?。所以蚓激酶的抗原性問題是影響注射用蚓激酶在體內(nèi)發(fā)揮其功效的重要問題。此外，酶類藥物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性(半衰期)，抗水解酶降解能力等等也是影響酶在體內(nèi)發(fā)揮其功效的因素。本發(fā)明的目的是利用現(xiàn)代生物分離技木，分離得到來源廣泛且具有較高純度的蚓激酶(F-III-2組分)、通過大分子修飾劑聚こニ醇及右旋糖苷對其進(jìn)行修飾，獲得既可降底或消除蚓激酶的免疫原性，又可保留其生物活性，防止降解和延長半衰期的エ藝方法；同時研制新劑型抗血栓生物藥物-高純度注射用蚓激酶。此外經(jīng)分子修飾的低分子蚓激酶亦可用于抗血栓的固體制劑及液體制劑中，如片劑，膠囊劑，ロ服液等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服蚓激酶組分多，質(zhì)量不易控制，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)，利用度低等不足，提供ー種經(jīng)分子修飾的低免疫原性蚓激酶的制備方法及由該方法制備得到的低免疫活性的蚓激酶，該方法的特點是制備得到的蚓激酶比活力> 30000IU/mg，分子量為25500±2000道爾頓，免疫原性較天然酶的免疫原性小，小于天然酶免疫原性的12%。本發(fā)明的另ー個目的是提供以低免疫活性蚓激酶為原料制成的片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、注射劑等多種途徑給藥的藥物制劑。為了達(dá)到所述的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段本發(fā)明的一種制備低免疫原性蚓激酶的方法，其特征在于包括首先從蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然后粗品通過離子交換柱進(jìn)行洗脫，純化，收集具有纖溶活性的組分，冷凍干燥濃縮，濃縮后的蚓激酶溶液用凝膠過濾色譜柱進(jìn)行分離，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為 23500-27500Da，洗脫峰經(jīng)透析脫鹽低溫冷凍干燥后采用活化的單甲氧基聚こニ醇以及右旋糖酐對其進(jìn)行分子修飾，即得。本發(fā)明的方法具體的，包括以下步驟(I)蚓激酶粗品的制備取新鮮蚯蚓，水洗數(shù)次，清水浸泡除去內(nèi)臟中的污物，然后加入水，并加入苯甲酸鈉防腐，置于4 (TC - 5 (TC水浴加熱自溶8 -10 h，離心，棄去沉淀，抽濾；濾液加入固體(NH4)2SO4使得(NH4)2SO4的濃度為30-40%，在4°C下保存3h_5h，用離心機離心，取得上清液，加(NH4)2SO4使得(NH4)2SO4的濃度為60-80%，離心，收集沉淀，用去離子水溶解，用透析袋透析2-3天，脫鹽，然后用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾濃縮，低溫冷凍干燥即得蚓激酶粗品；(2)蚓激酶的純化將步驟(I)提取的蚓激酶粗品用緩沖液溶解后，上離子交換柱，用磷酸鹽緩沖液平衡，用O. 1-0. 6M氯化鈉梯度洗脫，用HPLC分析，并用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，收集具有纖溶活性的組分，冷凍干燥濃縮；(3)蚓激酶組分F-II1-2的分離及純化將經(jīng)離子交換得到的蚓激酶，過Superdex 75凝膠過濾色譜柱，用磷酸鹽緩沖液洗脫，流速為I. ο-I. 3ml/h，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為23500-27500Da，即為蚓激酶組分F-111-2純品，洗脫峰經(jīng)透析脫鹽低溫冷凍干燥備用；(4)蚓激酶組分F-II1-2分子修飾a、將PEG活化成單甲氧基聚こニ醇甲酸琥珀酰亞胺脂肪采用改良N-羥基琥珀酰亞胺活化脂法活化mPEG5000，即將mPEG5000，N-羥基琥珀酰亞胺溶于CH2Cl2中，完全溶解后攪拌約25-35min，緩慢滴加無水三こ胺，攪拌12h，向反應(yīng)液中滴加こ醚，過濾后重新溶解于CH2Cl2中，然后再以こ醚沉淀，過濾，干燥，得到顏色為淡黃色的產(chǎn)物，即為單甲氧基聚こニ醇甲酸琥珀酰亞胺脂肪，以SC-mPEG表示；稱上述終產(chǎn)物于三ロ燒瓶中，加入氨基磺酸(NH2SO3H)，溶解于CH2Cl2中，緩慢滴加三こ胺與CH2Cl2混合液，繼續(xù)反應(yīng)5-7h，在低溫下向反應(yīng)物中緩慢加入こ醚，過濾后溶解于CH2Cl2，再以こ醚沉淀，所得產(chǎn)物即為活化的SC-mPEG，存放于真空干燥器中備用；b、SC-mPEG 修飾 F-II1-2將活化過的修飾劑SC-mPEG與蚓激酶組分F-III-2以摩爾比I : 3的比例加入O. lmol/L, ρΗ9· 2的硼酸緩沖液中，在37°C下水浴保溫lh，然后在O. lmol/L, ρΗ7· O磷酸緩沖液中透析24h，然后用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾，濃縮液冷凍干燥48h，即得經(jīng)單甲氧基聚こニ醇甲酸琥珀酰亞胺脂肪修飾的蚓激酶，用SC-mPEG — F-III-2表示；C、右旋糖苷修飾 SC-mPEG — F-III-2①右旋糖苷的活化
取右旋糖苷溶于蒸餾水，另取適量的NaIO4，兩溶液混合，在4°C冰箱反應(yīng)18h、滴加5%的NaHSO3的溶液還原過量的NaIO4,室溫下以蒸餾水透析4h后，再以適量的磷酸鹽緩沖液透析16h，濃縮、冷凍干燥即得活化的右旋糖苷；②活化右旋糖苷化學(xué)修飾SC-mPEG — F-III-2用ρΗ8· 4，O. IM的硼酸緩沖液溶解SC-mPEG — F-III-2,按照I : I摩爾比加入活化的右旋糖苷，在25°C下反應(yīng)18h，滴加NaBH4中止反應(yīng)，再調(diào)pH值至7. 0，對水透析4小時，冷凍干燥即得修飾的蚓激酶，用SC-mPEG — F-III-2 —糖苷表示。在本發(fā)明中，優(yōu)選的所述蚯蚓包括赤子愛勝蚓、雙胸蚓、縞蚯蚓(土地龍)、參環(huán)毛蚓(廣地龍)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的所述的超濾膜為中空纖維超濾膜或管式超濾膜。在本發(fā)明中，優(yōu)選的步驟(2)中所述的緩沖液為磷酸緩沖液或三羥甲基氨基甲燒-鹽酸。在本發(fā)明中，優(yōu)選的步驟(2)中所述的離子交換柱采用瓊脂糖凝膠柱或葡聚糖凝膠柱，更優(yōu)選的為DEAE-52離子交換柱。在本發(fā)明中，優(yōu)選的所述冷凍干燥其干燥條件為-20 _30°C預(yù)凍5 6h，然后在10 20Pa壓カ40 45°C條件下升華干燥IOh 12h。在本發(fā)明中，采用沉淀曲線法或者放射免疫法測定化學(xué)修飾后蚓激酶的抗原性。本發(fā)明提供了ー種由上述方法制得的低免疫原性蚓激酶。經(jīng)檢測該蚓激酶比活力彡30000IU/mg，分子量為25500 ±2000道爾頓，免疫原性小于天然酶免疫原性的12%。本發(fā)明還提供了由以上任一項所述的方法制備得到的蚓激酶。及所述的蚓激酶在制備抗血栓藥物、治療或預(yù)防心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用。采用的本發(fā)明的方法制備得到的蚓激酶可用于制備抗血栓、治療或預(yù)防心腦血管疾病的藥物制劑，所述制劑中含有權(quán)利要求8所述的蚓激酶。本發(fā)明還提供了由本發(fā)明的低免疫原性蚓激酶為原料藥制備的藥物制劑。使用常用的藥物制劑的制備方法可以制成下列劑型的藥物制劑(I)蚓激酶ロ服固體制劑(片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑等)；(2)蚓激酶ロ服液；(3)蚓激酶注射用針劑。對蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾的修飾劑很多，其中應(yīng)用最廣泛的是PEG，這是因為PEG是ー種可溶性惰性聚合物，水溶性好，沒有免疫原性和毒性，具有較好的生物活性且反應(yīng)條件溫和，不會破壞生物分子的活性。經(jīng)PEG修飾后的蛋白質(zhì)一般具有以下優(yōu)點(I)提高蛋白的穩(wěn)定性(2)降低或消除蛋白的免疫原性((3)延長其在體內(nèi)的半衰期(4)増加蛋白在水中的溶解度等。蛋白質(zhì)分子表面的游離氨基(主要為Lys的-NH2)，具有較高的親核反應(yīng)活性，使之成為蛋白質(zhì)化學(xué)修飾中最常用的被修飾基團。具有羥基的修飾劑，由于羥基反應(yīng)活性低，為了能在溫和條件下，以較高速率與蛋白質(zhì)相偶聯(lián)，事先需對PEG進(jìn)行活化，形成活化的PEG。本專利采用改良N-羥基琥珀酰亞胺活化脂法修飾PEG，此法具有生物活性保留較好，質(zhì)量易于控制等特點。然而，采用PEG修飾的蛋白，其疏水作用增強，溶解度會顯著下降，為了增加被修飾蛋白的溶解性，本發(fā)明引入了右旋糖苷修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基。當(dāng)活化后的水溶性分子右旋糖苷與酶分子上的氨基共價結(jié)合，使分子間的空間位阻増加，與水解酶接觸的難度加大，抗水解酶的能力得到加強；而且修飾后的酶分子上纏繞的親水性很強的多糖鏈?zhǔn)姑傅乃苄蕴岣撸瑥亩谒芤褐行揎椕竿鈬纬梢蝗軇┗瘜?，這樣對分子間的碰撞起到緩沖作用，降低了碰撞的能量，減少了相互聚集的傾向，使穩(wěn)定分子構(gòu)象的次級鍵得到保護，致使穩(wěn)定性提高；另外，修飾酶分子上的大分子右旋糖苷能“屏蔽”其分子表面的抗原決定簇，避免相應(yīng)抗體的產(chǎn)生，或阻止抗原抗體的結(jié)合，從而抑制免疫應(yīng)激反應(yīng)。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在如下方面(I)化學(xué)修飾后的蚓激酶，純度高，比活力高，免疫原性低，具有較強的溶栓、調(diào)節(jié)微循環(huán)、提聞免疫力等功能；(2)修飾后的蚓激酶可用于制備ロ服制劑和注射劑，患者長期應(yīng)用無任何毒副作用。


圖I蚓激酶組分(F-III-2)提取エ藝流程圖；圖2是低免疫原性蚓激酶化學(xué)修飾エ藝流程具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)ー步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明實施中涉及的主要材料及試劑的來源mPEG5000 :按照文獻(xiàn)Abraham Abuchowski, et al. Alteration of immunologicalproperties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethyleneglycol [J]. The Journal of Biological Chemistry, 1977,252 (11) :3578-3581.所述的方法制備得到。赤子愛勝蚓寧夏眾生福奧特生物制品有限公司PEG 江蘇南京花奇化工有限公司、
N-羥基琥珀酰亞胺上海勁馬生物科技有限公司超濾膜杭州超濾膜技術(shù)有限公司DEAE-52離子交換柱上海密理博生物技術(shù)有限公司Superdex 75凝膠過濾色譜柱廣州何為化工有限公司右旋糖酐上海華茂藥業(yè)有限公司氨基磺酸南京金彰實業(yè)有限公司無水三こ胺南京厚旺化工有限公司實施例I蚓激酶(F-III-2)的制備
一、蚓激酶組分(F-III-2)精制I、蚓激酶粗品的制備取新鮮赤子愛勝蚓50g，水洗數(shù)次，清水浸泡除去內(nèi)臟中的污物。然后加水50ml，并加入千分之O. 02苯甲酸鈉防腐，置于45 °C水浴加熱自溶9h，渾濁液用離心機離心4000rpm，10min，棄去沉淀，抽濾。濾液加固體(NH4)2SO4使(NH4)2SO4的終濃度達(dá)30. 0%，在4°C下保存4h，用離心機15，000r/min離心lOmin，取得上清液，加(MM)2SO4，使(MM)2SO4的終濃度達(dá)75. 0%,15, 000r/min離心lOmin，收集沉淀，用去離子水溶解。用透析袋透析48小時，脫鹽，然后用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾濃縮。低溫冷凍干燥即得蚓激酶粗品O2、蚓激酶的純化將步驟I提取的蚓激酶粗品用磷酸緩沖液(PH6. 8，IOmM)溶解后，上DEAE-52離子交換柱，用磷酸鹽緩沖液(PH6.8，5mM)平衡，用O. 4M氯化鈉梯度洗脫，然后用截流分子量為10000麗的超濾膜超濾濃縮。用HPLC分析，并用Deogny等提供的瓊脂糖-纖維&白平板法(具體參見 Lynn Deogny, ea al. Improved fibrin plate method forfibrinolytic activity measurements Use of bentonite precipitation and agarsolidification [J]. Clinica Chimica Acta, 1975,60 :85-89.)檢測，收集具有纖溶活性的組分。冷凍干燥濃縮到蛋白質(zhì)含量為2mg/ml。3、蚓激酶(F-III-2)組分分離及純化將經(jīng)離子交換得到的蚓激酶，過Superdex 75凝膠過濾色譜柱，用磷酸鹽緩沖液(PH6.8,5mM)洗脫，流速為I. 2ml/h，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經(jīng)SDS-page電泳檢測，其分子量為23500_27500Da，即為蚓激酶(F-111-2)組分純品，洗脫峰經(jīng)透析脫鹽低溫冷凍干燥備用。蚓激酶組分(F-III-2)提取エ藝流程圖如圖I所示。ニ、蚓激酶組分(F-III-2)分子修飾2. I、活化PEG對蚓激酶(F_III-2)修飾I、PEG活化(單甲氧基聚こニ醇甲酸琥珀酰亞胺脂肪(SC-mPEG))采用改良N-羥基琥珀酰亞胺活化脂法活化mPEG5000，將mPEG5000，N-羥基琥珀酰亞胺溶于CH2CL2中，完全溶解后攪拌約30min，緩慢滴加無水三こ胺，攪拌12h。向反應(yīng)液中滴加こ醚30mL，過濾后重新溶解于CH2Cl2，然后再以こ醚沉淀，過濾，-25°C預(yù)凍6h，然后在15Pa壓カ45°C條件下升華干燥12h干燥，產(chǎn)品顏色為淡黃色。稱上述終產(chǎn)物于三ロ燒瓶中，加入氨基磺酸(NH2SO3H)，溶解于CH2Cl2中，緩慢滴加三こ胺與CH2Cl2混合液，繼續(xù)反應(yīng)約6h。在低溫下向反應(yīng)物中緩慢加入20mLこ醚，過濾后溶解于CH2Cl2，再以こ醚沉淀，所得產(chǎn)物即為活化的PEG，存放于真空干燥器中備用。2、SC-mPEG 修飾 F-II1-2將活化過的修飾劑SC-mPEG與蚓激酶(F-II1-2)以摩爾比I : 3的比例加入硼酸緩沖液(O. lmol/L,pH9. 2)中，在37°C下水浴保溫lh，然后在磷酸緩沖液(O. lmol/L,pH7. O)中透析24h，然后用截流分子量為IOOOODa的中空纖維超濾膜超濾，濃縮液冷凍干燥48h即得經(jīng)PEG修飾的蚓激酶(SC-mPEG — F-III-2)。2. 2、右旋糖苷(分子量 3000Da)修飾 SC-mPEG — F-III-2 I、右旋糖苷的活化取右旋糖苷溶于蒸餾水，另取適量的NaIO4，兩溶液混合，在4°C冰箱反應(yīng)18h、滴加5%的NaHSO3的溶液還原過量的NaIO4,室溫下以蒸餾水透析4h后，再以適量的磷酸鹽緩沖液透析16h，濃縮、-25°C預(yù)凍6h，然后在15Pa壓カ45°C條件下升華干燥12h，即得活化的右旋糖苷。2、活化右旋糖苷化學(xué)修飾SC-mPEG — F-III-2 將適量的酶液(用ρΗ8· 4，O. IM的硼酸緩沖液溶解)中加入一定的活化的右旋糖苷(摩爾比I : I)，在25°C下反應(yīng)18h，滴加NaBH4中止反應(yīng)，再調(diào)pH值至7.0，對水透析4小時，冷凍干燥得修飾的蚓激酶(SC-mPEG — F-III-2 —糖苷)。低免疫原性蚓激酶化學(xué)修飾エ藝流程圖如圖2所示。實施例2以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)作為原料藥，在十萬級潔凈區(qū)內(nèi)，將低免疫原性蝴激酶50g和淀粉15kg于濕法混合制粒機中，混合2 2. 5min后,在攪拌過程中分次加入淀粉漿(總量為5% )，并攪拌制軟材，快速制粒4 5min。取出濕顆粒于60 70°C下在烘房中干燥，經(jīng)加入硬脂酸鎂后整?；旌系酶深w粒。置壓片機中壓片。壓片過程中隨時注意片劑的外觀，按規(guī)定定時抽查藥片的重量差異、硬度和崩解實現(xiàn)。實施例3以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)作為原料藥，在十萬級潔凈區(qū)內(nèi)，將低免疫原性蝴激酶50g和淀粉15kg于濕法混合制粒機中，混合2 2. 5min后,在攪拌過程中分次加入淀粉漿(總量為5% )，并攪拌制軟材，快速制粒4 5min。取出濕顆粒于60 70°C下在烘房中干燥。整粒后填充0#膠囊。實施例4以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)50g作為原料藥，與植物油15kg、PEG60002kg、丙ニ醇4kg混合，用膠體磨充分研勻或者用低速攪拌加玻璃砂研勻，使得低免疫原性的蚓激酶以極細(xì)膩的質(zhì)點形式均勻分散于基質(zhì)中，制得軟膠囊內(nèi)容物。將明膠、甘油、蒸餾水按I : 0.33 : I的重量比例加入夾層罐中，蒸汽夾層加熱，攪拌加熱I. 5h?；z后，用抽真空的方法去除膠液中的氣泡。將膠液置于保溫罐中，50 60°C保溫備用。采用滴制或壓制法制備軟膠囊，噴體的溫度為45 50°C，膠盒溫度為55 60°C。軟膠囊經(jīng)冷風(fēng)固化干燥后，用擦丸機進(jìn)行擦拭，保證軟膠囊外觀光潔。實施例5以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)作為原料藥50g，將其用蒸餾水溶解。用單效真空濃縮設(shè)備將溶液濃縮至可溶性固形物含量為35 45%，加入適量甜味劑混勻。常用甜味劑安賽蜜、阿巴斯甜、葡萄糖、甘露醇、木糖醇等。將濃縮后的ロ服液經(jīng)無菌灌裝，得低免疫原性蚓激酶ロ服液成品。實施例6以低免疫原性的蚓激酶(以20000IU/mg蚓激酶計)作為原料藥，在百級潔凈區(qū)內(nèi)按配制處方將主藥與輔料準(zhǔn)確稱量，在配液容器內(nèi)加注射用水，攪拌溶解后，用O. 45 μ m、O. 22 μ m濾芯過濾除菌。將濾液分裝于抗生素瓶，放入干燥箱，-20 -30°c預(yù)凍6h ;然后在10 20Pa壓カ40 45°C條件下升華干燥IOh 12h。最后壓塞、軋蓋得低免疫原性蚓激酶注射粉針成品。實驗例I修飾酶(SC-mPEG — F-III-2 —糖苷)活力測定
纖維蛋白原在凝血酶作用下，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊。蚓激酶SC-mPEG —F-II1-2 —糖苷不僅能激活纖溶酶原，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兴饣钚缘睦w溶酶，還可以直接溶解纖維蛋白，這與尿激酶作用原理相似。兩者均可溶解新鮮血栓，還可以溶解陳舊性血栓。本實驗例測定了該修飾酶的活性。實驗方法I、試劑的配制I. 10. 01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7. 8):取磷酸氫ニ鈉3. 58g，加水使溶解并稀釋至IOOOml為A液；取磷酸ニ氫鈉(NaH2PO4 · 2H20)0. 78g，加水使溶解并稀釋至500ml為B液；將A、B兩液混合至pH值為7. 8。I. 2工作溶液取O. Olmol/L磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 8)與O. 9%氯化鈉溶液(I 17)混合。I. 30. 75%瓊脂糖溶液取瓊脂糖O. 75g，加工作溶液IOOml加熱溶解。I. 4牛纖維蛋白原溶液取纖維蛋白原適量，加工作溶液制成每Iml中含IOmg的可凝蛋白溶液。I. 5牛凝血酶溶液取凝血酶，加工作溶液制成每Iml中含20BP單位的溶液。I. 6蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品，加工作液配制成每Iml中含50000IU/mL的溶液。2、纖維蛋白平板的配制在直徑9cm的平板上加入O. 5mL凝血酶溶液，再加2mL工作液混勻。在一支大試管中加入37°C保溫一段時間的牛纖維蛋白原溶液ImL和50°C的瓊脂糖溶液15mL，混合均勻。將試管中的溶液倒入平板，迅速混勻，靜止30min。用膠頭滴管在制備好的纖維蛋白平板上打孔，孔直徑約為3mm。3、配制樣品溶液將修飾酶配成質(zhì)量濃度為O. 5mg/mL的溶液 4、點樣在纖維蛋白平板的孔洞中加入蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各10μし5、保溫將點樣后的平板加蓋，放入37°C恒溫箱中保溫反應(yīng)18h。6、結(jié)果與計算
取出平板后，用游標(biāo)卡尺測量溶圈的垂直兩直徑，兩者乘積作為溶圈的纖溶活性面積。結(jié)果修飾酶的活力為31400IU/mg。實驗例2修飾酶(SC-mPEG — F-III-2 —糖苷)與天然酶抗原性的比較天然酶O. 5mg/ml 及修飾酶 O. 5mg/ml 分別取 25 μ L，50 μ L, 80 μ L，120 μ L, 200 μ L,250 μ L于試管中，分別加入50 μ L抗血清，空試管只加抗血清，不加酶，在37°C下反應(yīng)Ih后，每個樣品在4°C下保持5天，然后高速離心并用冷鹽水洗滌，沉淀物重新溶解在O. IN的NaOH中，再然后280nm下看吸光度，分別作出天然酶和修飾酶免疫沉淀曲線，結(jié)果顯示，經(jīng)分子修飾的蚓激酶的抗原性大約為原 酶的12. I %。
權(quán)利要求
1.一種制備低免疫原性蚓激酶的方法，其特征在于包括首先從蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然后粗品通過離子交換柱進(jìn)行洗脫，純化，收集具有纖溶活性的組分，冷凍干燥濃縮，濃縮后的蚓激酶溶液用凝膠過濾色譜柱進(jìn)行分離，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為23500-27500Da，洗脫峰經(jīng)透析脫鹽低溫冷凍干燥后采用活化的單甲氧基聚乙二醇以及右旋糖酐對其進(jìn)行分子修飾，即得。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于具體的，包括以下步驟 (1)蚓激酶粗品的制備 取新鮮蚯蚓，水洗數(shù)次，清水浸泡除去內(nèi)臟中的污物，然后加入水，并加入苯甲酸鈉防腐，置于40°C -50°C水浴加熱自溶8-10h，離心，棄去沉淀，抽濾；濾液加入固體(NH4)2SO4使得(NH4)2SO4的濃度為30-40%，在4°C下保存3h-5h，用離心機離心，取得上清液，力口(NH4)2SO4使得(NH4)2SO4的濃度為60-80%，離心，收集沉淀，用去離子水溶解，用透析袋透析2-3天，脫鹽，然后用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾濃縮，低溫冷凍干燥即得蚓激酶粗品； (2)蚓激酶的純化 將步驟(I)提取的蚓激酶粗品用緩沖液溶解后，上離子交換柱，用磷酸鹽緩沖液平衡，用0. 1-0. 6M氯化鈉梯度洗脫，用HPLC分析，并用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，收集具有纖溶活性的組分，冷凍干燥濃縮； (3)蚓激酶組分F-II1-2的分離及純化 將經(jīng)離子交換得到的蚓激酶，過Superdex 75凝膠過濾色譜柱，用磷酸鹽緩沖液洗脫，流速為I. 0-1. 3ml/h，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為23500-27500Da，即為蚓激酶組分F-III-2純品，洗脫峰經(jīng)透析脫鹽低溫冷凍干燥備用； (4)蚓激酶組分F-III-2分子修飾 a、將PEG活化成單甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亞胺脂肪 采用改良N-羥基琥珀酰亞胺活化脂法活化mPEG5000，即將mPEG5000，N-羥基琥珀酰亞胺溶于CH2Cl2中，完全溶解后攪拌約25-35min，緩慢滴加無水三乙胺，攪拌12h，向反應(yīng)液中滴加乙醚，過濾后重新溶解于CH2Cl2中，然后再以乙醚沉淀，過濾，干燥，得到顏色為淡黃色的產(chǎn)物，即為單甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亞胺脂肪，以SC-mPEG表示； 稱上述終產(chǎn)物于三口燒瓶中，加入氨基磺酸(NH2SO3H)，溶解于CH2Cl2中，緩慢滴加三乙胺與CH2Cl2混合液，繼續(xù)反應(yīng)5-7h，在低溫下向反應(yīng)物中緩慢加入乙醚，過濾后溶解于CH2Cl2，再以乙醚沉淀，所得產(chǎn)物即為活化的SC-mPEG，存放于真空干燥器中備用； b、SC-mPEG修飾 F-II1-2 將活化過的修飾劑SC-mPEG與蚓激酶組分F-II1-2以摩爾比I : 3的比例加入0. Imol/L，pH9. 2的硼酸緩沖液中，在37°C下水浴保溫lh，然后在0. lmol/L,pH7. 0磷酸緩沖液中透析24h，然后用截流分子量為10000WM的超濾膜超濾，濃縮液冷凍干燥48h，即得經(jīng)單甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亞胺脂肪修飾的蚓激酶，用SC-mPEG — F-III-2表示； C、右旋糖苷修飾SC-mPEG — F-III-2 ①右旋糖苷的活化取右旋糖苷溶于蒸餾水，另取適量的NaIO4，兩溶液混合，在4°C冰箱反應(yīng)18h、滴加5%的NaHSO3的溶液還原過量的NaIO4,室溫下以蒸餾水透析4h后，再以適量的磷酸鹽緩沖液透析16h，濃縮、冷凍干燥即得活化的右旋糖苷； ②活化右旋糖苷化學(xué)修飾SC-mPEG — F-III-2 用pH8. 4，0. IM的硼酸緩沖液溶解SC-mPEG — F-III-2,按照I : I摩爾比加入活化的右旋糖苷，在25°C下反應(yīng)18h，滴加NaBH4中止反應(yīng)，再調(diào)pH值至7. 0，對水透析4小時，冷凍干燥得修飾的蚓激酶，用SC-mPEG — F-III-2 —糖苷表示。
3.按照權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述的蚯蚓包括赤子愛勝蚓、雙胸蚓、縞蚯蚓及參環(huán)毛蚓。
4.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的超濾膜為中空纖維超濾膜或管式超濾膜。
5.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的緩沖液為磷酸緩沖液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸。
6.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述的離子交換柱采用瓊脂糖凝膠柱或葡聚糖凝膠柱。
7.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的冷凍干燥其干燥條件為-20 -30°C預(yù)凍5 6h，然后在10 20Pa壓力40 45°C條件下升華干燥IOh 12h。
8.由權(quán)利要求1-7任一項所述的方法制備得到的蚓激酶。
9.權(quán)利要求8所述的蚓激酶在制備抗血栓藥物、治療或預(yù)防心腦血管疾病藥物中的應(yīng) 用。
10.一種用于抗血栓、治療或預(yù)防心腦血管疾病的藥物制劑，其特征在于含有權(quán)利要求8所述的蚓激酶，優(yōu)選的，所述的藥物制劑包括口服固體制劑、口服液和注射用針劑，其中口服固體制劑包括片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低免疫原性蚓激酶及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。本發(fā)明的方法包括首先從蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然后粗品通過離子交換柱進(jìn)行洗脫，純化，收集具有纖溶活性的組分，冷凍干燥濃縮，濃縮后的蚓激酶溶液用凝膠過濾色譜柱進(jìn)行分離，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測纖溶活性，收集具有纖溶活性的第二個洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，其分子量為23500-27500Da，洗脫峰經(jīng)透析脫鹽低溫冷凍干燥后采用活化的單甲氧基聚乙二醇以及右旋糖酐對其進(jìn)行分子修飾，即得。通過本發(fā)明制備得到的蚓激酶具有免疫原性小，酶活力高等特點，能夠用于抗血栓藥物以及治療或預(yù)防心腦血管疾病藥物的研究和制備。
文檔編號A61P9/00GK102660523SQ20121012395
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者王輝, 陳喜君 申請人:哈爾濱眾生北藥生物工程有限公司