專利名稱：高純度蚓激酶的制備方法及由其制備的藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蚓激酶的制備方法，更具體地說，涉及高純度蚓激酶的制備方法和由其制備的可供口服、肌注及靜脈給藥的多種劑型的藥物制劑。
背景技術(shù)：
血栓性疾病的高發(fā)病率、高死亡率及高致殘率嚴(yán)重威脅人類的生存，溶栓性藥物是治療該病的首選用藥。目前臨床上使用的溶栓性藥物中普遍存在易引起出血的副作用；有的價格昂貴，一般百姓難以承受；有的穩(wěn)定性較差，保存條件要求較高，給用藥者帶來很多不便；有的品種給藥方式單一，只有口服、或只有靜脈或肌肉注射，使用藥范圍受到很大限制。
蚯蚓在中藥中統(tǒng)稱為地龍，可分為雙胸蚓(Bimastos)、赤子愛勝蚓(Eisenia Foetida Sarigny)、鋸齒遠(yuǎn)蚓(Amynthasdancataa)及參環(huán)毛蚓(廣地龍)等不同種屬，在我國早已被列入藥源，其中作為活血化瘀應(yīng)用已有幾千年的歷史。研究表明，新鮮的蚯蚓體內(nèi)含有多種蛋白酶類，其中一組具有強(qiáng)烈溶解纖維蛋白及血栓作用的絲氨酸蛋白酶由日本Mihara等于八十年代首次發(fā)現(xiàn)，命名為蚓激酶(Thromb Heamostas 1983，50258～263)，由此引起了國內(nèi)外諸多學(xué)者的關(guān)注，開始了對蚓激酶從分離純化和理化性質(zhì)到藥效學(xué)研究與臨床應(yīng)用等方面的廣泛研究。大量的研究證實(shí)蚓激酶廣泛存在于不同種屬蚯蚓體內(nèi)，是一組富含酸性氨基酸，等電點(diǎn)pl3～5，分子量20000～40000道爾頓，具有激酶和纖溶酶雙重功能的絲氨酸蛋白酶它既可類似纖溶酶直接降解纖維蛋白及纖維蛋白原，又類似尿激酶、鏈激酶等激活纖溶酶原形成纖溶酶，起到纖溶酶原激活劑的作用。蚓激酶的最大特點(diǎn)是穩(wěn)定性好，纖溶活性強(qiáng)，藥理作用明顯，副作用小，可做成各種劑型的藥品，且來源廣泛，具有廣泛開發(fā)價值。近20年來，不少單位的研究人員都在力求將蚓激酶的研究推向?qū)嶋H應(yīng)用，先后有各種各樣的分離純化技術(shù)問世，但是直到目前為止，還沒有一套成熟的制備高純度蚓激酶技術(shù)真正轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高純度蚓激酶的制備方法，該方法的特點(diǎn)是得到的高純度蚓激酶的比活達(dá)到每毫克蛋白20萬單位以上；經(jīng)高效液相色譜測試為單一組分；在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上呈現(xiàn)一條帶，分子量為32000±2000道爾頓；氨基酸序列分析，N-末端10個氨基酸序列為Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr本發(fā)明的再一個目的在于提供以高純度蚓激酶為原料藥制成的可供口服、肌注、以及靜脈注射與靜脈輸液多種途徑給藥的藥物制劑。
本發(fā)明公開一種高純度蚓激酶的制備方法，包括以下步驟(1)蚓激酶粗品的提取取鮮活蚯蚓用水洗凈，加入食鹽處理；加入pH6.8～8.3的緩沖液，用膠體磨制備勻漿；將勻漿液速凍，再融化；將勻漿液加熱，去除對熱不穩(wěn)定的雜蛋白；將勻漿液離心，取上清液；上清液經(jīng)超濾濃縮，截留分子量為10000～50000道爾頓的組分，冷凍干燥即為蚓激酶粗品。
(2)蚓激酶粗品的純化將步驟(1)中的蚓激酶粗品溶于緩沖液中，離心，取上清液用離子交換層析分離，得到活性組分；(3)蚓激酶活性組分的再純化將步驟(2)中的蚓激酶活性組分用親和層析平衡緩沖液溶解，用單克隆抗體親合層析柱進(jìn)行再純化，用緩沖液平衡至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線后，再用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫，收集活性洗脫峰，冷凍干燥得到高純度的蚓激酶。
本發(fā)明公開的高純度蚓激酶的制備方法中，蚯蚓包括雙胸蚓、赤子愛勝蚓、參環(huán)毛蚓或鋸齒遠(yuǎn)蚓。
本發(fā)明公開的高純度蚓激酶的制備方法中，緩沖液為磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸。
本發(fā)明公開的高純度蚓激酶的制備方法中，步驟(2)中離子交換層析采用羧甲基葡聚糖凝膠柱、二乙氨基葡聚糖凝膠柱或瓊脂糖凝膠柱層析，先用緩沖液平衡脫洗，再用含有0～0.5mol/LNaCl緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。
本發(fā)明公開的高純度蚓激酶的制備方法中，步驟(3)中單克隆抗體親和層析柱是由蚓激酶抗體偶聯(lián)到經(jīng)過溴化氰活化處理的羧甲基葡聚糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠的多糖基質(zhì)上制得的。
本發(fā)明公開的高純度蚓激酶的制備方法中，蚓激酶抗體由如下步驟制備得到用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的蚓激酶與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對小鼠皮下注射免疫；取經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠骨髓瘤細(xì)胞混合，加入分子量為40000～60000聚乙二醇作用后，將細(xì)胞混合液分別接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)；將接種細(xì)胞混合液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時間階段選擇不同的培養(yǎng)基；收集細(xì)胞分泌液，對單克隆抗體進(jìn)行篩分得到穩(wěn)定的蚓激酶抗體。
本發(fā)明公開的高純度蚓激酶的制備方法中，經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠骨髓瘤細(xì)胞按5～10∶1的比例混合。
本發(fā)明公開的高純度蚓激酶的制備方法中，培養(yǎng)基的選擇按照第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基。
按照另一方面，本發(fā)明公開一種由上述方法制得的高純度蚓激酶，其比活達(dá)到每毫克蛋白20萬單位以上；經(jīng)高效液相色譜測試為單一組分；在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上呈現(xiàn)一條帶，分子量為32000±2000道爾頓；氨基酸序列分析，N-末端10個氨基酸序列為Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr按照又一方面，本發(fā)明還公開了由本發(fā)明的高純度蚓激酶為原料藥制備的藥物制劑，其包含有治療有效量的本發(fā)明的高純度蚓激酶、藥學(xué)上可接受的藥用輔料。使用常用的藥物制劑的制備方法可以制成下列劑型的藥物制劑(1)蚓激酶口服腸溶劑(片劑、膠囊等)；(2)蚓激酶注射液；(3)注射用蚓激酶；(4)靜脈注射用蚓激酶；(5)凍干靜脈注射用蚓激酶。
本發(fā)明公開的高純度蚓激酶的制備方法中，采用單克隆抗體技術(shù)實(shí)現(xiàn)蚓激酶活性組分的再純化。單克隆抗體技術(shù)是將具有分泌特定抗體能力的B淋巴細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞。通過有限稀釋法從雜交瘤細(xì)胞中篩選出特定的一個細(xì)胞集落(即克隆)，再由該集落的細(xì)胞不斷培養(yǎng)增殖而形成細(xì)胞系，由此細(xì)胞分泌的抗體即為單克隆抗體。單克隆抗體的主要特點(diǎn)是①抗體的分子結(jié)構(gòu)高度均一，甚至氨基酸序列及空間構(gòu)型均相同；②抗體識別的是抗原分子上單一抗原位區(qū)，且所有抗體分子均相同，由此具有高度特異性；③產(chǎn)生抗體的細(xì)胞是無性細(xì)胞系，可長期傳代并保存，因此只要該細(xì)胞系建立，便可持續(xù)穩(wěn)定地生產(chǎn)同一性質(zhì)的抗體。
通過本發(fā)明公開的制備方法得到的高純度蚓激酶，其纖溶活性達(dá)到每毫克蛋白20萬單位以上；依照電泳法(中國藥典2000年版二部附錄V F第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法)顯示為一條帶，分子量應(yīng)為32000±2000道爾頓；依照高效液相色譜法測定(中國藥典2000年版二部附錄VI H)，呈現(xiàn)一個峰的水平，電泳法和高效液相色譜法(HPLC)測定結(jié)果都表明高純度蚓激酶為單一組分；氨基酸序列分析，N-末端10個氨基酸序列為Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr；經(jīng)瓊脂糖-纖維蛋白平板法測定，高純度蚓激酶樣品出現(xiàn)的纖溶圈比同樣濃度的蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品更為清晰。
取高純度蚓激酶，用氯化鈉注射液制成每1ml含20000單位的溶液，按熱原檢查法(中國藥典2000年版二部附錄XI D)，家兔每1kg體重注射1.0ml，應(yīng)符合規(guī)定；取高純度蚓激酶，加氯化鈉注射液制成每1ml中含20000單位的溶液，按異常毒性檢查法(中國藥典2000年版二部附錄XI C)，靜脈注射給藥，應(yīng)符合規(guī)定；取高純度蚓激酶，用氯化鈉注射液制成每1ml中含5000單位的溶液進(jìn)行過敏試驗(yàn)。試驗(yàn)方法取體重250-350g豚鼠6只，間日腹腔注射供試品溶液0.5ml，連續(xù)3次。然后將動物分成兩組，每組3只，分別在第一次注射后第14日及第21日靜脈注射供試品溶液1.0ml進(jìn)行攻擊。仔細(xì)觀察注射后15min內(nèi)豚鼠的反應(yīng)，均不得出現(xiàn)過敏性反應(yīng)。如有豎毛、呼吸困難、噴嚏、干嘔或咳嗽3聲等現(xiàn)象中的兩種或兩種以上者；或啰音、抽搐、虛脫或死亡現(xiàn)象之一者，應(yīng)判為陽性。
經(jīng)鑒定，高純度蚓激酶的熱原、異常毒性和過敏檢查均符合規(guī)定。


圖1為蚓激酶粗品提取工藝流程圖；圖2為蚓激酶粗品純化和活性組分再純化工藝流程圖；圖3為注射用蚓激酶和凍干靜脈注射用蚓激酶制劑生產(chǎn)工藝流程圖；圖4為蚓激酶注射液和靜脈注射用蚓激酶制劑生產(chǎn)工藝流程圖；
圖5為蚓激酶腸溶膠囊生產(chǎn)工藝流程圖；圖6為蚓激酶腸溶片生產(chǎn)工藝流程圖；圖7為蚓激酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜；圖8為蚓激酶高效液相色譜圖；以及圖9-A、9-B和9-C為蚓激酶效價測定瓊脂糖-纖維蛋白平板圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1～3為單克隆抗體親和層析柱的制作方法。
實(shí)施例1用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的蚓激酶50μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。
取經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細(xì)胞按5∶1的比例混合，加入分子量40000的50％聚乙二醇作用后，將細(xì)胞混合液分別接種在多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。
將接種細(xì)胞混合液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細(xì)胞分泌液，用酶聯(lián)免疫法對單克隆抗體進(jìn)行篩選及效價測定，將分泌特異性蚓激酶抗體的細(xì)胞挑選出來傳代培養(yǎng)，建立細(xì)胞系，由此可獲得穩(wěn)定的抗體。
用溴化氰活化4B-Sepharose瓊脂糖凝膠，把得到的蚓激酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成單克隆抗體親和層析柱。
實(shí)施例2用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的蚓激酶250μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。
取經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細(xì)胞按8∶1的比例混合，加入分子量50000的50％聚乙二醇作用后，將細(xì)胞混合液分別接種在多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。
將接種細(xì)胞混合液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細(xì)胞分泌液，用酶聯(lián)免疫法對單克隆抗體進(jìn)行篩選及效價測定，將分泌特異性蚓激酶抗體的細(xì)胞挑選出來傳代培養(yǎng)，建立細(xì)胞系，由此可獲得穩(wěn)定的抗體。
用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝膠，把得到的蚓激酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成單克隆抗體親和層析柱。
實(shí)施例3用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的蚓激酶500μg/ml與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對7周齡的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾靜脈注射加強(qiáng)免疫。
取經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠sp2/10骨髓瘤細(xì)胞按10∶1的比例混合，加入分子量60000的50％聚乙二醇作用后，將細(xì)胞混合液分別接種在多塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)。
將接種細(xì)胞混合液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集細(xì)胞分泌液，用酶聯(lián)免疫法對單克隆抗體進(jìn)行篩選及效價測定，將分泌特異性蚓激酶抗體的細(xì)胞挑選出來傳代培養(yǎng)，建立細(xì)胞系，由此可獲得穩(wěn)定的抗體。
用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝膠，把得到的蚓激酶抗體偶聯(lián)到多糖基質(zhì)上，從而制成單克隆抗體親和層析柱。
實(shí)施例4稱取10kg鮮活太平二號-赤子愛勝蚓置不銹鋼桶內(nèi)，用水洗凈泥沙，加100g食鹽攪拌10～20nin，再用水清洗干凈。取出后在膠體磨中加10升0.05mol/L磷酸鹽緩沖液制備勻漿。勻漿液放-20℃冷凍過夜，次日取出置水浴中盡快融化，反復(fù)3次。第3次融化后先加熱至50℃保持20min，再繼續(xù)加熱至80℃保持5min，迅速在冰水中冷卻至室溫。3000rpm離心30min，取上清。沉淀加5升同樣緩沖液攪拌30min，再次離心，合并兩次離心得到的上清液。
先用50K超濾器超濾取透過液，再用10K超濾器超濾濃縮到1升左右，加10升0.05mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)離子交換層析緩沖液繼續(xù)超濾濃縮到500ml左右，在4℃3500rpm離心10min，取上清液上羧甲基葡聚糖凝膠離子交換層析柱，用0.05mol/L Tris-HCl緩沖液平衡至基線平穩(wěn)，用含有0.1mol/L氯化鈉的上述緩沖液洗脫，收集各組分。經(jīng)HPLC分析，取保留時間8～10min收集的各組分樣品，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，將出現(xiàn)溶圈具有纖溶活性的組分合并，用10K超濾器濃縮到1升左右，加10升親和層析平衡緩沖液，繼續(xù)超濾濃縮至200～300ml，上實(shí)施例1中的親和層析柱，再用2倍柱床體積Tris-HCl親和層析平衡緩沖液平衡至基線平穩(wěn)，改用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫。分別收集各洗脫峰。同離子交換層析法鑒定收集到的各組分的纖溶活性。
經(jīng)活性檢測，收集的第2峰具有很高的纖溶活性，取2峰組分適當(dāng)稀釋，用高效液相色譜法檢測，獲得單組分圖譜，其保留時間為9.586min，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量為33000道爾頓。
熱原、異常毒性、過敏檢查，均符合規(guī)定。
實(shí)施例5稱取10kg鮮活雙胸蚓，用飲用水洗凈泥沙，加200g食鹽攪拌10～20nin，再用水洗凈。取出后在膠體磨中加15升0.05mol/L Tris-HCl緩沖液制備勻漿。勻漿液放-20℃冷凍過夜，次日取出置水浴中盡快融化，反復(fù)3次。第3次融化后先加熱至50℃保持25min，再繼續(xù)加熱至80℃保持4min，迅速在冰水中冷卻至室溫。3500rpm離心20min，取上清。沉淀加5升同樣緩沖液攪拌30min，再次離心，合并兩次離心得到的上清液。
先用50K超濾器超濾取透過液，再用10K超濾器超濾濃縮到500ml左右，調(diào)pH值至7.8，在4℃3500rpm離心10min，上清液上二乙氨基葡聚糖凝膠(DEAE-Sephadex A-50)離子交換層析柱，用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液平衡至基線平穩(wěn)，用含有0.3mol/L氯化鈉的上述緩沖液洗脫，收集各組分。經(jīng)HPLC分析，取保留時間8～10min收集的各組分樣品，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，將出現(xiàn)溶圈具有纖溶活性的組分合并，用10K超濾器濃縮到1升左右，加10升親和層析平衡緩沖液，繼續(xù)超濾濃縮至200～300ml，上實(shí)施例2中的親和層析柱，再用2倍柱床體積Tris-HCl親和層析平衡緩沖液平衡至基線平穩(wěn)后，改用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫，分別收集各洗脫峰。同離子交換層析法鑒定收集到的各組分的纖溶活性。
經(jīng)活性檢測，收集的第2峰具有很高的纖溶活性，取2峰組分適當(dāng)稀釋，用高效液相色譜法檢測，獲得單組分圖譜，其保留時間為9.711min，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量為32000道爾頓。
熱原、異常毒性、過敏檢查，均符合規(guī)定。
實(shí)施例6稱取10kg鮮活鉅齒遠(yuǎn)蚓，用飲用水洗凈泥沙，加300g食鹽攪拌10～20nin，再用水清洗干凈。取出后在膠體磨中加20升0.02mol/L磷酸鹽緩沖液制備勻漿。勻漿液放-20℃冷凍過夜，次日取出置水浴中盡快融化，反復(fù)3次。第3次融化后先加熱至50℃保持30min，再繼續(xù)加熱至80℃保持2min，迅速在冰水中冷卻至室溫。4000rpm離心15min，取上清，沉淀加5升同樣緩沖液攪拌30min，再次離心，合并兩次離心得到的上清液。
先用50K超濾器超濾取透過液，再用10K超濾器超濾濃縮到1升左右，加10升0.02mol/L Tris-HCl離子交換層析緩沖液，繼續(xù)濃縮至500ml左右，在4℃3500rpm離心10min。上清液上瓊脂糖凝膠離子交換層析柱，用0.02mol/LTris-HCl緩沖液平衡至基線平穩(wěn)，用含有0.4mol/L氯化鈉的上述緩沖液洗脫，收集各組分。經(jīng)HPLC分析，取保留時間8～10min收集的各組分樣品，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，將出現(xiàn)溶圈具有纖溶活性的組分合并，用10K超濾器濃縮到1升左右，加10升磷酸鹽親和層析平衡緩沖液，繼續(xù)超濾濃縮至200～300ml，上實(shí)施例3中的親和層析柱，再用2倍柱床體積親和層析平衡緩沖液平衡至基線平穩(wěn)后，改用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫。分別收集各洗脫峰。同離子交換層析法鑒定收集到的各組分的纖溶活性。
經(jīng)活性檢測，收集的第2峰具有很高的纖溶活性，取2峰組分適當(dāng)稀釋，用高效液相色譜法檢測，獲得單組分圖譜，其保留時間為9.693min，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量為32200道爾頓。
熱原、異常毒性、過敏檢查，均符合規(guī)定。
實(shí)施例7稱取10kg鮮活參環(huán)毛蚓(廣地龍)，用飲用水洗凈泥沙，加500g食鹽攪拌10～20nin，再用水清洗干凈。取出后在膠體磨中加30升0.02mol/L磷酸鹽緩沖液制備勻漿。勻漿液放-20℃冷凍過夜，次日取出置水浴中盡快融化，反復(fù)3次。第3次融化后先加熱至50℃保持40min，迅速在冰水中冷卻至室溫。3500rpm離心25min，取上清，沉淀加5升同樣緩沖液后攪拌30min，再次離心，合并兩次離心得到的上清液。
先用50K超濾器超濾取透過液，再用10K超濾器超濾濃縮到500ml左右，調(diào)pH值至8.8。在4℃3500rpm離心10min，上清液上DEAE-Sephadex A-50離子交換層析柱，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液平衡至基線平穩(wěn)，用含有0.5mol/L氯化鈉的上述緩沖液洗脫，收集各組分。經(jīng)HPLC分析，取保留時間8～10min收集的各組分樣品，用瓊脂糖-纖維蛋白平板法檢測，將出現(xiàn)溶圈具有纖溶活性的組分合并。用10K超濾器濃縮到1升左右，加10升親和層析平衡緩沖液，繼續(xù)超濾濃縮至200～300ml，上實(shí)施例3中的親和層析柱，用2倍柱床體積Tris-HCl親和層析平衡緩沖液平衡至基線平穩(wěn)后，改用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫，分別收集各洗脫峰，同離子交換層析法鑒定收集到的各組分的纖溶活性。
經(jīng)活性檢測，收集的第2峰具有很高的纖溶活性，取2峰組分適當(dāng)稀釋，用高效液相色譜法檢測，獲得單組分圖譜，其保留時間為9.806min，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量為30500道爾頓。
熱原、異常毒性、過敏檢查，均符合規(guī)定。
實(shí)施例8為注射用蚓激酶與凍干靜脈注射用蚓激酶制劑生產(chǎn)工藝。
圖3為注射用蚓激酶與凍干靜脈注射用蚓激酶制劑生產(chǎn)工藝流程圖。
首先，在局部百級潔凈區(qū)內(nèi)按配制處方將蚓激酶原料藥與白蛋白、磷酸鹽、氯化鈉、右旋糖酐等輔料準(zhǔn)確稱量在配液容器內(nèi)；加注射用水充分溶解或稀釋，攪拌混勻后，得到制劑中間體；除菌過濾，其中過濾前后應(yīng)對除菌過濾系統(tǒng)進(jìn)行完整性測試。然后，將過濾后的中間體按裝量裝入抗生素瓶，在分裝過程中應(yīng)進(jìn)行至少4次裝量檢查，保證每一只瓶內(nèi)裝入的藥量準(zhǔn)確。最后，將裝入藥品的抗生素瓶碼在凍干箱各層的隔板上，按照品種凍干曲線進(jìn)行速凍至零下20～30℃，維持8小時；然后抽真空，在真空狀態(tài)下緩慢升溫至35～40℃，保持一定時間，再降至室溫后取出。壓塞、軋蓋得成品。經(jīng)過成品質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行包裝，入成品庫存放。
實(shí)施例9為蚓激酶注射液與靜脈注射用蚓激酶制劑生產(chǎn)工藝。
圖4為蚓激酶注射液與靜脈注射用蚓激酶制劑生產(chǎn)工藝流程圖。
首先，在局部百級潔凈區(qū)內(nèi)按配制處方將蚓激酶原料藥與白蛋白、磷酸鹽、氯化鈉等輔料準(zhǔn)確稱量在配液容器內(nèi)；加注射用水充分溶解或稀釋，攪拌混勻后，得到制劑中間體；除菌過濾，其中過濾前后應(yīng)對除菌過濾系統(tǒng)進(jìn)行完整性測試。然后，將過濾后的中間體按裝量裝入抗生素瓶同時壓塞、軋蓋即得成品，在分裝過程中應(yīng)進(jìn)行至少4次裝量檢查，保證每一只瓶內(nèi)裝入的藥量準(zhǔn)確。最后，經(jīng)過成品質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行包裝，入成品庫存放。
實(shí)施例10為蚓激酶腸溶膠囊制劑生產(chǎn)工藝。
圖5為蚓激酶腸溶膠囊制劑生產(chǎn)工藝流程圖。
首先，在十萬級潔凈區(qū)內(nèi)將蚓激酶原料藥與淀粉、乳糖、硬酯酸、滑石粉、明膠等輔料準(zhǔn)確稱量在制劑容器內(nèi)，充分混合均勻，得到制劑中間體。然后，取外觀、長度、厚度、臭味、水分、脆碎度、融化時限、熾灼殘渣及微生物學(xué)檢查均符合規(guī)定的膠囊殼，填充中間體藥粉，得到半成品。最后蓋上膠囊上節(jié)、壓平打光，制得成品。經(jīng)過成品質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，用玻璃瓶或塑料瓶密閉包裝，入成品庫，放置在陰涼干燥處，溫度不得超過25℃，相對濕度不得超過45％。
實(shí)施例11為蚓激酶腸溶片生產(chǎn)工藝。
圖6為蚓激酶腸溶片生產(chǎn)工藝流程圖。
首先，在十萬級潔凈區(qū)內(nèi)將蚓激酶原料藥與乳糖、淀粉漿、羧甲基纖維素鈉等輔料準(zhǔn)確稱量在制劑容器內(nèi)，充分混合均勻，得到制劑中間體。然后，進(jìn)行制粒與壓片，在壓片過程中隨時注意片劑的外觀，定時抽查藥片的重量差異、硬度和崩解時限。最后，包腸溶衣得到成品。經(jīng)過成品質(zhì)量檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行包裝，入成品庫，貯存在陰涼、通風(fēng)、干燥處，注意防止受潮、發(fā)霉、變質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種高純度蚓激酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)蚓激酶粗品的提取取鮮活蚯蚓用水洗凈，加入食鹽處理；加入pH6.8～8.3的緩沖液，用膠體磨制備勻漿；將勻漿液反復(fù)凍融；將勻漿液加熱，去除對熱不穩(wěn)定的雜蛋白；將勻漿液離心，取上清液；上清液經(jīng)超濾濃縮，截留分子量為10000～50000道爾頓的組分，冷凍干燥制得蚓激酶粗品；(2)蚓激酶粗品的純化將步驟(1)中獲得的蚓激酶粗品溶于緩沖液中，離心，取上清液用離子交換層析柱分離，得到蚓激酶活性組分；(3)蚓激酶活性組分的再純化將步驟(2)中的蚓激酶活性組分用親和層析平衡緩沖液溶解，用單克隆抗體親合層析柱進(jìn)行再純化，用緩沖液平衡至流出液在蛋白檢測儀上繪出穩(wěn)定的基線后，再用含有洗脫劑的親和層析洗脫液洗脫，收集活性洗脫峰，冷凍干燥得到高純度的蚓激酶。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，蚯蚓包括雙胸蚓、赤子愛勝蚓、鋸齒遠(yuǎn)蚓或參環(huán)毛蚓。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中步驟(2)中離子交換層析采用羧甲基葡聚糖凝膠柱或二乙氨基葡聚糖凝膠柱或瓊脂糖凝膠柱層析，先用緩沖液平衡脫洗，再用含有0～0.5mol/LNaCl的緩沖液進(jìn)行梯度洗脫。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，其中所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中步驟(3)中單克隆抗體親和層析柱是由蚓激酶抗體偶聯(lián)到經(jīng)過溴化氰活化處理的羧甲基葡聚糖凝膠、二乙氨基葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠的多糖基質(zhì)上制得的。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，蚓激酶抗體由如下步驟制備得到用高效液相色譜純化并經(jīng)定性的蚓激酶與等體積完全佐劑混合乳化作為刺激物，對小鼠皮下注射免疫；取經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠骨髓瘤細(xì)胞混合，加入分子量為40000～60000的聚乙二醇作用后，將細(xì)胞混合液分別接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)；將接種細(xì)胞混合液的細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時間階段選擇不同的培養(yǎng)基；收集細(xì)胞分泌液，對單克隆抗體進(jìn)行篩分得到穩(wěn)定的蚓激酶抗體。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，經(jīng)免疫的小鼠脾B淋巴細(xì)胞懸液與鼠骨髓瘤細(xì)胞的混合比例按5～10∶1。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)基的選擇按照第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培養(yǎng)基，第5～10天改用HT培養(yǎng)基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基。
9.一種由權(quán)利要求1中所述方法制得的高純度蚓激酶，其特征在于，所述蚓激酶的比活達(dá)到每毫克蛋白20萬單位以上；經(jīng)高效液相色譜測試為單一組分；在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳上呈現(xiàn)一條帶，分子量為32000±2000道爾頓；氨基酸序列分析，N-末端10個氨基酸序列為Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr
10.一種由權(quán)利要求1所述方法制得的或權(quán)利要求10所述的高純度蚓激酶制得的藥物制劑，其特征在于，其包含治療有效量的權(quán)利要求1所述方法制得的或權(quán)利要求10所述的高純度蚓激酶、藥學(xué)上可接受的藥用輔料。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高純度蚓激酶的制備方法及以其為原料藥的制劑。本發(fā)明通過采用單克隆抗體技術(shù)實(shí)現(xiàn)蚓激酶活性組分的再純化，從而得到高純度蚓激酶，該方法的特點(diǎn)是所獲酶的專一性強(qiáng)，活性高，達(dá)到每毫克蛋白20萬單位以上；經(jīng)高效液相色譜測試為單一組分；在SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳上呈現(xiàn)一條帶，分子量為32000±2000道爾頓；氨基酸序列分析，N－末端10個氨基酸序列為Ile－Val－Gly－Gly－Ile－Glu－Ala－Arg－Pro－Tyr，以所述高純度蚓激酶為原料藥可以制成可供口服、肌注、以及靜脈注射與靜脈輸液多種途徑給藥的制劑，用于血栓性疾病的治療。
文檔編號A61K38/48GK1603405SQ03134768
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者馬骉, 魏化偉, 吳丹, 宋夢薇, 張穎 申請人:北京賽生藥業(yè)有限公司