專利名稱：內(nèi)切β－1,4－葡聚糖酶的分離提純方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化方法，尤其是涉及一種采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑的等電沉淀技術(shù)分離提純內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶是纖維素酶中的一種。纖維素酶(cellulase)指的是降解纖維素的一類酶的總稱，其最大的用途是把纖維素通過(guò)酶法水解成葡萄糖。纖維素是自然界中含量最豐富的碳水化合物，超過(guò)其他碳水化合物的總和，是一類重要的可再生資源和能源。因而纖維素酶的研究被認(rèn)為是新世紀(jì)開(kāi)發(fā)利用可再生性資源的關(guān)鍵，對(duì)于解決工農(nóng)業(yè)原料來(lái)源、能源危機(jī)、環(huán)境污染等問(wèn)題具有十分重要的意義?，F(xiàn)在纖維素酶應(yīng)用已擴(kuò)展到醫(yī)藥、紡織、日用化工、造紙、食品發(fā)酵、工業(yè)洗滌、煙草、石油開(kāi)采、廢水處理及飼料等許多領(lǐng)域。目前尚未有專門(mén)針對(duì)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純工藝，該酶主要存在于粗纖維素酶之中。作為本方法原料的粗纖維素酶由里氏木霉(菌株3.3006經(jīng)誘變得到，CGMCC菌種目錄，1997第三版)經(jīng)固體培養(yǎng)后，鹽析制得[1]。該提純工藝存在酶活損失較為嚴(yán)重等缺點(diǎn)，且產(chǎn)品一般為多種酶類混合制品，不利于單一酶組分性質(zhì)的研究和單一酶組分的應(yīng)用。
參考文獻(xiàn)[1]Yao Shanjing，Guan Yixin，Yu Lihua，Characterization of crude cellulase fromTrichoderma reesei and purification of cellulase，Chinese Journal of ChemicalEngineering，2002，10(6)，723-725發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純方法。
方法的步驟如下1)首先，將粗纖維素酶溶于乙醇-水溶液中，配制纖維素酶濃度為1～3％(質(zhì)量百分比)，乙醇濃度為10～40％(體積百分比)的溶液，充分振蕩使溶液混合均勻；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到預(yù)熱溫度為20～40℃的高壓釜中，繼而通入預(yù)熱溫度為20～40℃，壓力為3.5～8.0MPa的CO2，調(diào)節(jié)pH為3.8～4.2，并保持25～60分鐘，過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶。
本發(fā)明與傳統(tǒng)等電沉淀方法相比，酶活損失少，同時(shí)又比傳統(tǒng)的等電沉淀體系具有較多的優(yōu)勢(shì)，如乙醇的加入可使水溶性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)也能沉淀，而所加助劑乙醇量較有機(jī)溶劑沉淀法要少很多，采用加壓CO2進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)可以避免用無(wú)機(jī)酸等調(diào)節(jié)溶液pH時(shí)酸過(guò)量或局部pH過(guò)低的情況出現(xiàn)，CO2在溶液中大多以分子形式存在，這使得溶液離子強(qiáng)度不會(huì)因此過(guò)多升高，因而比無(wú)機(jī)酸更適于等電沉淀中的pH調(diào)節(jié)。本發(fā)明還解決了現(xiàn)有沉淀技術(shù)所存在的酶活損失較為嚴(yán)重，親水性蛋白質(zhì)難于沉淀等技術(shù)問(wèn)題，提供了一種可保持較高酶活，親水性蛋白質(zhì)易于形成沉淀的一種纖維素酶的分離提純方法。本發(fā)明還解決了現(xiàn)有等電沉淀技術(shù)所存在的操作條件難以精確控制，操作過(guò)程波動(dòng)較大，沉淀能力不強(qiáng)等技術(shù)問(wèn)題，提供了一種操作參數(shù)可精確控制，操作過(guò)程無(wú)波動(dòng)，沉淀能力較強(qiáng)的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純方法。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)，可以在水溶液中沉淀那些等電點(diǎn)與體系pH相近的蛋白質(zhì)；分離提純步驟包括纖維素酶(粗品)的乙醇-水溶液配制，用加壓CO2將溶液pH調(diào)至所需范圍，內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在體系中沉淀出來(lái)，過(guò)濾沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)，最終內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶被純化。為實(shí)現(xiàn)該過(guò)程，首先配制合適濃度的纖維素酶(粗品)的乙醇-水溶液，然后取合適量的溶液加入到高壓釜中，繼而通入加壓CO2，用來(lái)調(diào)節(jié)溶液的pH至所需范圍，當(dāng)pH接近內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的等電點(diǎn)時(shí)，內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶被沉淀出來(lái)。本發(fā)明所采用的加壓CO2-乙醇-水體系用于等電沉淀蛋白質(zhì)，內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純方法的高壓釜預(yù)熱溫度和CO2預(yù)熱溫度為20～40℃，CO2壓力為3.5～8.0MPa，纖維素酶質(zhì)量百分比濃度為1～3％，乙醇溶液體積百分比濃度為10～40％，CO2壓力維持時(shí)間為25～60分鐘。
下面通過(guò)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說(shuō)明。
實(shí)施例1首先配制濃度為1％(質(zhì)量百分比)的纖維素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇濃度為25％(體積百分比)，充分振蕩使溶液混合均勻，然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至25℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度25℃的加壓CO2，使壓力增至4.5MPa，調(diào)節(jié)操作溫度至25℃，此時(shí)溶液的pH約為4.0。在該狀態(tài)下保壓40分鐘，其中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在該條件下完全沉淀出來(lái)。過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，對(duì)其純度和酶活進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的純化倍數(shù)為1.65，酶活得率為84.1％。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)。該方法具有分離后所得產(chǎn)品酶活損失較小，親水性蛋白質(zhì)易于形成沉淀等的特點(diǎn)。
實(shí)施例2首先配制濃度為3％(質(zhì)量百分比)的纖維素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇濃度為40％(體積百分比)，充分振蕩使溶液混合均勻，然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至20℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度20℃的加壓CO2，使壓力增至4.5MPa，調(diào)節(jié)操作溫度至20℃，在該狀態(tài)下保壓55分鐘，其中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在該條件下完全沉淀出來(lái)。過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，對(duì)其純度和酶活進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的純化倍數(shù)為1.43，酶活得率為89.2％。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)。該方法具有分離后所得產(chǎn)品酶活損失較小，親水性蛋白質(zhì)易于形成沉淀等的特點(diǎn)。
實(shí)施例3首先配制濃度為1％(質(zhì)量百分比)的纖維素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇濃度為20％(體積百分比)，充分振蕩使溶液混合均勻，然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至20℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度20℃的加壓CO2，使壓力增至3.5MPa，調(diào)節(jié)操作溫度至20℃，在該狀態(tài)下保壓30分鐘，其中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在該條件下完全沉淀出來(lái)。過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，對(duì)其純度和酶活進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的純化倍數(shù)為1.52，酶活得率為73.6％。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)。該方法具有分離后所得產(chǎn)品酶活損失較小，親水性蛋白質(zhì)易于形成沉淀等的特點(diǎn)。
實(shí)施例4首先配制濃度為1％(質(zhì)量百分比)的纖維素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇濃度為10％(體積百分比)，充分振蕩使溶液混合均勻，然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至40℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度40℃的加壓CO2，使壓力增至7.0MPa，調(diào)節(jié)操作溫度至40℃，在該狀態(tài)下保壓25分鐘，其中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在該條件下完全沉淀出來(lái)。過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，對(duì)其純度和酶活進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的純化倍數(shù)為1.45，酶活得率為91.2％。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)。該方法具有分離后所得產(chǎn)品酶活損失較小，親水性蛋白質(zhì)易于形成沉淀等的特點(diǎn)。
實(shí)施例5首先配制濃度為2％(質(zhì)量百分比)的纖維素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇濃度為30％(體積百分比)，充分振蕩使溶液混合均勻，然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至35℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度35℃的加壓CO2，使壓力增至3.5MPa，調(diào)節(jié)操作溫度至35℃，在該狀態(tài)下保壓60分鐘，其中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在該條件下完全沉淀出來(lái)。過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，對(duì)其純度和酶活進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的純化倍數(shù)為1.35，酶活得率為76.3％。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)。該方法具有分離后所得產(chǎn)品酶活損失較小，親水性蛋白質(zhì)易于形成沉淀等的特點(diǎn)。
實(shí)施例6首先配制濃度為1％(質(zhì)量百分比)的纖維素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇濃度為20％(體積百分比)，充分振蕩使溶液混合均勻，然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至30℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度30℃的加壓CO2，使壓力增至6.5MPa，調(diào)節(jié)操作溫度至30℃，在該狀態(tài)下保壓50分鐘，其中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在該條件下完全沉淀出來(lái)。過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，對(duì)其純度和酶活進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的純化倍數(shù)為1.30，酶活得率為94.2％。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)。該方法具有分離后所得產(chǎn)品酶活損失較小，親水性蛋白質(zhì)易于形成沉淀等的特點(diǎn)。
實(shí)施例7首先配制濃度為3％(質(zhì)量百分比)的纖維素酶的乙醇-水溶液，其中乙醇濃度為35％(體積百分比)，充分振蕩使溶液混合均勻，然后取20mL的溶液加入到預(yù)熱至25℃的高壓釜中。繼而通入預(yù)熱溫度25℃的加壓CO2，使壓力增至8.0MPa，調(diào)節(jié)操作溫度至25℃，在該狀態(tài)下保壓35分鐘，其中的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶在該條件下完全沉淀出來(lái)。過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶沉淀，對(duì)其純度和酶活進(jìn)行測(cè)定，此時(shí)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的純化倍數(shù)為1.32，酶活得率為97.9％。本方法采用加壓CO2作為揮發(fā)性酸，乙醇作為助沉淀劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質(zhì)等電沉淀技術(shù)。該方法具有分離后所得產(chǎn)品酶活損失較小，親水性蛋白質(zhì)易于形成沉淀等的特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純方法，其特征在于方法的步驟如下1)首先，將粗纖維素酶溶于乙醇-水溶液中，配制粗纖維素酶質(zhì)量百分比濃度為1～3％，乙醇體積百分比濃度為10～40％的溶液，充分振蕩使溶液混合均勻；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到預(yù)熱溫度為20～40℃的高壓釜中，繼而通入預(yù)熱溫度為20～40℃，壓力為3.5～8.0MPa的CO2，調(diào)節(jié)pH為3.8～4.2，并保持25～60分鐘，過(guò)濾得內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純方法，其特征在于所說(shuō)的高壓釜預(yù)熱溫度和CO2預(yù)熱溫度為25～30℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純方法，其特征在于所說(shuō)的CO2壓力為4.5～7.0MPa。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純方法，其特征在于所說(shuō)的乙醇溶液體積百分比濃度為20～30％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的分離提純方法，其特征在于所說(shuō)的CO2壓力維持時(shí)間為30～50分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶的分離提純方法。方法的步驟如下1)首先，將粗纖維素酶溶于乙醇－水溶液中，配制粗纖維素酶質(zhì)量百分比濃度為1～3％，乙醇體積百分比濃度為10～40％的溶液，充分振蕩使溶液混合均勻；2)然后，取20mL上述混合溶液加入到預(yù)熱溫度為20℃～40℃的高壓釜中，繼而通入預(yù)熱溫度為20℃～40℃，壓力為3.5～8.0MPa的CO
文檔編號(hào)C12N9/42GK1587396SQ20041005404
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者姚善涇, 關(guān)怡新, 齊祥明 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)