本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及用于食管鱗癌診治的標(biāo)志物，具體地該標(biāo)志物為CKMT2。

背景技術(shù)：

食管癌是人類常見的十大惡性腫瘤之一。全球食管癌每年新增病例超過48萬，死亡病例超過40萬。2014年美國癌癥協(xié)會(ACS)報道的數(shù)據(jù)顯示，在過去二十年中癌癥死亡率穩(wěn)步下降，整個生命期內(nèi)死于癌癥的整體風(fēng)險下降了20％，但食管癌依然是美國40-59歲男性的第五大致死性腫瘤。中國是世界食管癌的高發(fā)地區(qū)，尤以男性高發(fā)，組織類型主要為鱗狀細胞癌(簡稱鱗癌)。國家癌癥中心2014年的最新數(shù)據(jù)顯示，我國食管癌居惡性腫瘤發(fā)病第五位、死亡第四位，對人民的生活質(zhì)量甚至生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

食管鱗癌的發(fā)生經(jīng)歷從正常食管粘膜、炎癥、食管粘膜上皮異型增生、原位癌、粘膜內(nèi)癌、早期浸潤癌、晚期癌的過程。食管癌起病隱匿，許多患者早期階段無任何癥狀，50％以上患者在確診時已無法切除或已出現(xiàn)影像學(xué)可見的轉(zhuǎn)移灶，多年來，中晚期患者術(shù)后5年整體生存率一直徘徊在10％左右。如能找到精確的診斷方法，將能夠指導(dǎo)臨床上的個性化治療，對一定的患者及時進行干預(yù)，并防止對其他患者的過度治療，從而提高患者的生存質(zhì)量?，F(xiàn)有技術(shù)發(fā)現(xiàn)，早期切除食管鱗癌組織的患者，可大大提高患者的5年生存率。因此，早診早治對于降低食管鱗癌的死亡率具有重要的意義。

目前可應(yīng)用于食管癌早期診斷的影像學(xué)方法有食管鋇餐造影、計算機斷層掃描(CT)和核磁共振成像(MRI)，內(nèi)鏡技術(shù)有高放大倍數(shù)高分辨率內(nèi)鏡、色素內(nèi)鏡(盧戈氏碘液染色法、甲苯胺藍染色法和甲苯胺藍一盧戈氏碘液染雙重染色法)、窄譜成像內(nèi)鏡、自體熒光成像內(nèi)鏡、激光共聚焦內(nèi)鏡、光學(xué)連續(xù)X線斷層掃描內(nèi)鏡、以及影像學(xué)與內(nèi)鏡相結(jié)合的內(nèi)鏡超聲(EUS)，病理細胞學(xué)方法有食管拉網(wǎng)脫落細胞學(xué)檢查。這些方法各具優(yōu)點，但同時也各顯示有某方面的不足。由于技術(shù)水平所造成的診斷不明確，很可能會導(dǎo)致部分早期食管癌患者失去最佳的治療機會。

針對食管鱗癌的診斷方法，尤其是對術(shù)后患者的預(yù)后風(fēng)險分層、早期癌精確診斷以及癌前病變癌變風(fēng)險預(yù)警，需要更準(zhǔn)確的指標(biāo)進行補充。運用分子生物學(xué)方法研究鑒定有效的分子標(biāo)志物，是輔助現(xiàn)有臨床診斷、指導(dǎo)臨床干預(yù)和癌前預(yù)警的關(guān)鍵手段。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種診斷產(chǎn)品，從而實現(xiàn)早期食管鱗癌的準(zhǔn)確診斷。

本發(fā)明的目的之二，提供一種分子標(biāo)志物，作為檢測或治療指標(biāo)應(yīng)用于臨床。

本發(fā)明的目的之三，提供一種治療手段和藥物組合物，實現(xiàn)食管鱗癌的精準(zhǔn)分子治療。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測CKMT2基因的試劑在制備診斷食管鱗癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進一步，所述產(chǎn)品通過檢測樣本中CKMT2基因的表達水平來判斷患者是否患有食管鱗癌。其中，CKMT2基因在食管鱗癌患者中表達下調(diào)。

所述“樣本”包括細胞、組織、臟器、體液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支氣管清洗液、尿、糞便等。優(yōu)選的，所述樣本為組織、血液。在本發(fā)明的具體實施方式中，所述樣本為組織。

進一步，所述產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測CKMT2基因的表達水平以診斷食管鱗癌。

其中，所述用RT-PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CKMT2基因的引物；所述用實時定量PCR診斷食管鱗癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增CKMT2基因的引物；所述用免疫檢測診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括：與CKMT2蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括：與CKMT2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷食管鱗癌的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中蛋白芯片包括與CKMT2蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與CKMT2基因的核酸序列雜交的探針。

進一步，所述用實時定量PCR診斷食管癌的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴增CKMT2基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本發(fā)明提供了一種診斷食管鱗癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測樣本中CKMT2基因的表達水平來診斷食管鱗癌。

進一步，所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述試劑盒包括基因檢測試劑盒、蛋白免疫檢測試劑盒。所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測CKMT2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對CKMT2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的CKMT2蛋白的特異性抗體；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測CKMT2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括CKMT2蛋白的特異性抗體。

本發(fā)明中基因檢測試劑盒或基因芯片可用于檢測包括CKMT2基因在內(nèi)的多個基因(例如，與食管鱗癌相關(guān)的多個基因)的表達水平。所述蛋白免疫檢測試劑盒或蛋白質(zhì)芯片可用于檢測包括CKMT2蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)(例如與食管鱗癌相關(guān)的多個蛋白質(zhì))的表達水平。將食管鱗癌的多個標(biāo)志物同時進行檢測，可大大提高食管鱗癌診斷的準(zhǔn)確率。

本發(fā)明提供了CKMT2基因和/或其表達產(chǎn)物在制備治療食管鱗癌的藥物組合物中的應(yīng)用。

進一步，所述藥物組合物包括增加CKMT2基因表達、增強CKMT2表達功能、和/或增強CKMT2表達產(chǎn)物活性的試劑。所述試劑包括：含有能編碼功能性CKMT2蛋白的核酸的試劑、CKMT2蛋白的激活劑、含有CKMT2蛋白質(zhì)的試劑。

其中，所述含有能編碼功能性CKMT2蛋白的核酸的試劑可以是在有利條件下翻譯成活性形式的CKMT2蛋白的單鏈核酸(如mRNA)或雙鏈核酸(如DNA)，所述的核酸可以連接在表達載體上或重組到宿主細胞里，只要能編碼成活性CKMT2蛋白，任何一種CKMT2基因的攜帶方式均可。所述的CKMT2蛋白激活劑是指刺激CKMT2蛋白活性、增加CKMT2蛋白活性、促進CKMT2蛋白活性、增強CKMT2蛋白激活、使CKMT2蛋白活性敏感化或上調(diào)CKMT2蛋白活性的試劑，如去甲基化試劑、CKMT2啟動子和/或增強子特異性的轉(zhuǎn)錄激活劑、CKMT2蛋白的激動劑(如激活抗體)等。

本發(fā)明提供了一種治療食管鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括增加CKMT2基因表達、增強CKMT2表達功能、和/或增強CKMT2表達產(chǎn)物活性的試劑。

所述試劑包括但不限于含有能編碼功能性CKMT2蛋白的核酸的試劑、CKMT2蛋白的激活劑、含有CKMT2蛋白質(zhì)的試劑。

進一步，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，如緩沖劑、乳化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、生理食鹽等。作為緩沖劑，能夠使用磷酸鹽、甘氨酸，山梨酸，山梨酸鐘，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)例如硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽，膠態(tài)二氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基于纖維素的物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，聚乙二醇和羊毛脂等。作為乳化劑，能夠使用阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、西黃芪膠等。作為懸浮劑，能夠使用單硬脂酸甘油、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為穩(wěn)定劑，能夠使用丙二醇、二亞乙基亞硫酸鹽、抗壞血酸等。作為防腐劑，能夠使用疊氮化鈉、苯扎氯銨、對羥苯甲酸、氯丁醇等。本發(fā)明的藥物組合物還可以包括離子交換劑如礬土，硬脂酸鋁，卵磷脂，半乳化藥物遞送系統(tǒng)(SEDDS)例如dα一生育酚聚乙二醇1000琥珀酸鹽，在藥物劑型中使用的表面活性劑例如吐溫或其它類似聚合遞送基質(zhì)，血清蛋白例如人血清白蛋白，也可以使用環(huán)糊精例如α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、和γ-環(huán)糊精，或化學(xué)修飾的衍生物例如是羥基烷基環(huán)糊精，包括2-和3-羥基丙基-β-環(huán)糊精、或其它增溶衍生物來促進本發(fā)明化合物的遞送。本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。

本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、填充劑、凝結(jié)劑與調(diào)和劑，如含水乳糖或無水乳糖、淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、硅酸、微晶纖維素、羥甲基纖維素鈉、淀粉甘醇酸鈉及其衍生物等。

本發(fā)明的藥物組合物還包含界面活性劑、乳化劑、擴散劑、消泡劑等。任何藥學(xué)上或醫(yī)學(xué)上可接受的界面活性劑、乳化劑、擴散劑、消泡劑等皆可被使用。

本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的涂層材料包括(但不限于)，快速分解涂層材料、染色劑、腸溶性聚合物、增塑劑、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散劑。常見快速分解涂層材料包括OPADRY；腸溶性聚合物包括甲基內(nèi)烯酸聚合物、磷羥丙甲基纖維素苯二甲酸酯、羥丙甲基纖維素乙酸酯、羥丙甲基纖維素琥珀酸酯、羥甲乙基纖維素、乙酰磷苯二甲酸纖維素；增塑劑包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

在本發(fā)明中，“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術(shù)語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標(biāo)記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

所述探針具有與靶點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。這里，所謂“互補”，只要是雜交即可，可以不是完全互補。這些多核苷酸通常相對于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注冊商標(biāo)，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交聯(lián)化核酸)、ENA(注冊商標(biāo)，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

本發(fā)明中所述CKMT2蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段、組合抗體等，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。

本發(fā)明中“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。

克隆抗體在本發(fā)明中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性。

“完整抗體”在本發(fā)明中指包含兩個抗原結(jié)合區(qū)及Fc區(qū)的抗體。優(yōu)選的是，完整抗體具有功能性Fc區(qū)。

“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)²和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。

本發(fā)明中檢測CKMT2基因表達產(chǎn)物的抗體，可以選擇適當(dāng)?shù)墓姆椒▉碇苽洌珉s交瘤法、重組DNA法、噬菌體法等單克隆抗體的制作方法等。使用結(jié)合有標(biāo)記物質(zhì)的抗體時，通過檢測該標(biāo)記，能夠直接檢測靶點蛋白質(zhì)。作為標(biāo)記物質(zhì)，只要是能夠與抗體結(jié)合、能夠檢測的物質(zhì)即可，沒有特別限定，例如，可以為過氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、微過氧化物酶、辣根過氧化物酶(HRP)、異硫氰酸熒光素(FITC)、若丹明異硫氰酸鹽(RITC)、堿性磷酸酶、生物素及放射性物質(zhì)。另外，除使用結(jié)合有標(biāo)記物質(zhì)的抗體直接檢測靶點蛋白質(zhì)的方法以外，也能夠利用使用結(jié)合有標(biāo)記物質(zhì)的二次抗體、蛋白質(zhì)G或蛋白質(zhì)A等間接地檢測靶點蛋白質(zhì)的方法。

本發(fā)明所述藥物組合物可口服給藥、非胃腸道給藥、通過吸入噴霧給藥、局部給藥、直腸給藥、鼻給藥、頰給藥、陰道給藥或通過植入的貯藥裝置給藥。優(yōu)選口服給藥或注射給藥。本發(fā)明藥物組合物可含有任何常用的無毒可藥用載體、輔料或賦形劑。在某些情況下，藥用酸、堿或緩沖劑可用來調(diào)節(jié)制劑的pH以提高所配制的化合物或其給藥劑型的穩(wěn)定性。本文所用術(shù)語非胃腸道包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞠內(nèi)、損傷部位內(nèi)、和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。只要能達到目標(biāo)組織，本發(fā)明所述藥物組合物可以通過任何途徑給予受體。

本發(fā)明藥物組合物可以以任何口服劑型的形式口服給藥，包括但不限于膠囊、片劑、乳劑和水懸浮液、分散劑和溶液。對于口服片劑，常用載體包括乳糖和玉米淀粉。一般還加入潤滑劑例如硬脂酸鎂。為了以膠囊形式口服給藥，適用的稀釋劑包括乳糖和無水玉米淀粉。當(dāng)口服施用水懸浮液和/或乳液時，可將活性組分懸浮或溶解在油相中，并與乳化劑和/或懸浮劑合并。如果需要的話，可加入一些甜味劑和/或矯味劑和/或著色劑。適當(dāng)時，可將用于口服給藥的劑量單位制劑包微囊。例如，通過在聚合物、蠟等中將顆粒物質(zhì)包衣或包埋，也可制備所述制劑已延長或維持釋放。本發(fā)明的藥物組合物可以用于補充內(nèi)源性的CKMT2蛋白的缺失或不足，通過提高CKMT2蛋白的表達或增強CKMT2蛋白的功能，從而治療因CKMT2蛋白減少導(dǎo)致的食管鱗癌。

本發(fā)明的藥物還可與其他治療食管鱗癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴(yán)重程度、復(fù)發(fā)的頻率和治療方案的生理應(yīng)答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

本發(fā)明所述的藥物組合物也可以脂質(zhì)體輸送系統(tǒng)形式給藥，如小單層囊泡、大單層囊泡和多層囊泡。脂質(zhì)體可有多種磷脂形成，如膽甾醇、硬脂基胺或磷脂酰膽堿。

本發(fā)明藥物組合物可以局部給藥的藥物組合物，可以配制成軟膏、乳膏劑、混懸劑、洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標(biāo)志物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，標(biāo)志物基因可具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2指定的編碼序列或氨基酸序列。在一些實施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，諸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。

在本發(fā)明的上下文中，CKMT2基因表達產(chǎn)物包括人CKMT2蛋白以及CKMT2蛋白的部分肽。所述CKMT2蛋白的部分肽含有與食管鱗癌病相關(guān)的功能域。

“CKMT2蛋白”包括CKMT2蛋白以及CKMT2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括CKMT2蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物或其突變體。突變體包括等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、其氨基酸序列通過缺失、替代、增加和/或插入發(fā)生變異的突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人CKMT2的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。

通常，一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。

氨基酸序列的修飾可以源自自發(fā)突變或遺傳后修飾，也可以人工誘導(dǎo)天然基因產(chǎn)生。通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是CKMT2蛋白的融合蛋白。對于與CKMT2蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒有限制，只要所得的融合蛋白保留CKMT2蛋白的生物學(xué)活性即可。

本發(fā)明的藥物組合物可以按藥劑學(xué)上有效的量進行給藥，本發(fā)明的用語“藥劑學(xué)上有效的量”指的是以可適用于醫(yī)學(xué)治療或預(yù)防的合理的受惠/危險比率足以治療或預(yù)防疾病的量，可根據(jù)包括疾病的嚴(yán)重程度、藥物的活性、患者的年齡、體重、健康、性別、患者對藥物的敏感度、所使用的本發(fā)明組合物的給藥時間、給藥途徑及排出比率、治療時間、與所使用的本發(fā)明的組合物配合或同時使用的藥物的要素及其它醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中公知的要素來決定有效用量水平。本發(fā)明的藥物組合物可作為單獨的治療劑進行給藥，或是與其它治療劑并用地進行給藥，可以與以往的治療劑依次地或同時地進行給藥。此外，可單次或多次地進行給藥。重要的是，需要對上述要素均加以考慮，并且以無副作用的最少的量可取得最大效果的量進行給藥。

術(shù)語“治療”是指不以治愈為目的，而是減緩(減少)靶定的病理狀況或病癥或防止復(fù)發(fā)。如果接受治療有效量的治療劑之后,患者成功地被“治療”，患者顯示出可觀測到的和/或可度量的一種或多種特定疾病的跡象和癥狀的減少或消失。例如，癌細胞數(shù)目顯著減少或癌細胞消失，減少腫瘤尺寸；抑制(即，在某種程度上減緩，及優(yōu)選地停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；某種程度上抑制腫瘤生長；使在一定程度上減少和/或減輕與特定癌癥相關(guān)聯(lián)的一種或多種癥狀的時間增加；減少的發(fā)病率和死亡率，以及改善生活質(zhì)量。疾病的跡象或癥狀的減輕能夠為患者感知。治療可以實現(xiàn)完全反應(yīng)—定義為癌癥的所有跡象消失，或部分反應(yīng)—腫瘤尺寸減小，優(yōu)選減小的比例超過50％、更優(yōu)選75％。如果患者感受到疾病穩(wěn)定，患者也被視為得到治療。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了CKMT2在食管鱗癌患者組織中差異表達，通過檢測CKMT2的表達水平可以判斷患者是否患有食管鱗癌或者患病風(fēng)險的高低。

本發(fā)明提供了一種食管鱗癌的精準(zhǔn)醫(yī)療手段，通過提高患者中CKMT2的表達水平，從而治療食管鱗癌患者。

本發(fā)明提供了一種食管鱗癌的分子標(biāo)記物，為食管鱗癌的機理研究以及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1顯示利用QPCR檢測CKMT2基因在食管鱗癌組織中的表達情況；

圖2顯示利用QPCR檢測CKMT2基因在食管細胞中的表達情況；

圖3顯示利用QPCR檢測轉(zhuǎn)染CKMT2基因在食管鱗癌細胞中的轉(zhuǎn)染效率；

圖4顯示利用利用軟瓊脂克隆形成實驗檢測CKMT2基因表達對食管鱗癌細胞增殖能力的影響；

圖5顯示利用transwell小室檢測CKMT2基因?qū)κ彻荀[癌細胞侵襲的影響。

具體的實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1篩選與食管鱗癌相關(guān)的基因標(biāo)志物

1、樣品收集

各收集6例周圍正常食管粘膜組織和食管鱗癌組織，患者均知情同意，上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、RNA樣品的制備(利用QIAGEN的組織RNA提取試劑盒進行操作)

取出凍存于液氮中的組織樣本，把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進行研磨，按照試劑盒中的說明書提取分離RNA。具體如下：

1)加入Trizol，室溫放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5-10min；

3)12000rpm離心15min，將上層水相移到另一新的離心管中(注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì))，加入等體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10min；

4)12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入

75％DEPC乙醇洗滌沉淀(4℃保存)，洗滌沉淀物，振蕩混勻，4℃，12000rpm離心5min；

5)棄去乙醇液體，室溫下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70℃冰箱。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時用Cy3分別標(biāo)記實驗組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達譜芯片,每張芯片包括45015個寡核苷酸，其中有43376個人基因探針和1639個實驗控制探針。按芯片使用說明書的步驟進行，溫度在65℃，經(jīng)17h 10r/min滾動雜交，37℃洗片。

5、數(shù)據(jù)處理

雜交后芯片用Agilent掃描儀掃描,分辨率為5μm，掃描儀自動以100％和10％PMT各掃描1次，2次結(jié)果Agilent軟件自動合并。掃描圖像數(shù)據(jù)采用FeatureExtraction進行處理分析，得到的原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Bioconductor程序包進行后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后Ratio值為實驗組和對照組。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：ratio≥4為上調(diào)基因，ratio≤0.25為下調(diào)基因。

6、結(jié)果

與正常食管粘膜組織相比，CKMT2基因在食管鱗癌組織中的表達量顯著低于正常食管粘膜組織中的表達量。

實施例2QPCR測序驗證CKMT2基因的差異表達

1、對CKMT2基因差異表達進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇周圍正常食管粘膜組織和食管鱗癌組織各50例。

2、RNA提取步驟同實施例1。

3、逆轉(zhuǎn)錄：

采用25μl反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分：DEPC水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

(3)QPCR擴增檢驗

引物設(shè)計

管家基因GAPDH的引物序列為：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)

CKMT2基因的引物序列為：

正向引物：5’-CTGGATAAATGAGGAGGAT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-TTGGATTAACCGTTCTACT-3’(SEQ ID NO.6)

采用25μl反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

配制以下反應(yīng)體系：SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系 12.5μl，正反向引物(5μM)各1μl，模板cDNA 2.0μl，無酶水8.5μl。各項操作均于冰上進行。

擴增程序為：95℃10min，(95℃15s，60℃45s)×30個循環(huán)。

以SYBR Green作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光實時定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進行相對定量。

3、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與周圍正常食管粘膜組織相比，CKMT2基因在食管鱗癌組織中表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實施例3CKMT2基因在食管癌細胞系中的差異表達

1、細胞培養(yǎng)

人食管鱗癌細胞株KYSE 150、KYSE450購自中科院腫瘤研究所，正常食管上皮細胞株Het-1a購自于廣州吉尼歐公司。以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO₂、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、RNA的提取

1)胰酶消化貼壁細胞，吹打獲得的細胞經(jīng)離心、重懸、清洗后，以1640培養(yǎng)基(10％小牛血清)重懸；

2)將重懸的細胞轉(zhuǎn)移至6孔板(/孔)，添加培養(yǎng)基至2m1/孔，輕搖6孔板使細胞均勻重懸；

3)細胞貼壁生長48h，去培養(yǎng)基；

4)以1mlTrizol試劑裂解細胞，反復(fù)吹打6孔板壁，盡量使細胞完全裂解；

5)轉(zhuǎn)移細胞裂解液至1.5ml DEPC處理過的EP管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步驟同組織中RNA提取過程。

3、逆轉(zhuǎn)錄

具體步驟同實施例2.

4、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與食管上皮細胞相比，CKMT2基因在食管鱗癌細胞KYSE150、KYSE450中表達均下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，同RNA-sep結(jié)果一致。

實施例4CKMT2基因的過表達

細胞培養(yǎng)

人食管鱗癌細胞株KYSE 150，以含10％胎牛血清和1％P/S的培養(yǎng)基DMEM在37℃、5％CO2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

2、CKMT2基因的過表達

2.1CKMT2基因表達載體的構(gòu)建

根據(jù)CKMT2基因的編碼序列(如SEQ ID NO.1所示)設(shè)計擴增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGGAATTCGCCACCATGGCCAGTA TCTTTTCTAA-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-CGGCTCGAGCTTTTTGCCAAACTGAGGCAGAGG-3’(SEQ ID NO.8)

從成人胎腦的cDNA文庫(clontech公司，貨號：638831)中擴增全長的CKMT2基因的編碼序列，上述cDNA序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切后插入到經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切的真核細胞表達載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-CKMT2用于后續(xù)實驗。

2.2轉(zhuǎn)染

將食管鱗癌細胞分為兩組，分別為對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體)、和CKMT2過表達組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CKMT2)。使用脂質(zhì)體2000進行載體的轉(zhuǎn)染，具體轉(zhuǎn)染方法按照說明書的指示進行。pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-CKMT2的轉(zhuǎn)染濃度均為0.5μg/ml。

2.3RT-PCR檢測

具體步驟同實施例2。

3、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4、結(jié)果

如圖3所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CKMT2的細胞中CKMT2的含量顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

實施例5CKMT2基因?qū)κ彻荀[癌細胞凋亡的影響

使用流式細胞儀檢測CKMT2基因?qū)毎蛲龅挠绊憽?/p>

1、細胞培養(yǎng)步驟同實施例3。

2、細胞轉(zhuǎn)染步驟同實施例3。

3、步驟

細胞轉(zhuǎn)染72h后，使用預(yù)冷PBS洗滌細胞，然后用0.25％胰酶消化細胞，中止消化，將離心收集的細胞使用PBS重懸，將細胞定量為1×10⁶個/ml，取200μl上述細胞懸液放置到Eppendorf管中，加入10μl Annexin-V-FITC混勻，室溫暗處孵育染色15min，上機前5min加入10mg/L碘化丙錠(PI)染色5μl。未轉(zhuǎn)染siRNA的細胞分別用Annexin-V-FITC和PI染色用于標(biāo)準(zhǔn)定量。用FACS流式細胞儀進行雙色熒光細胞流式計數(shù)，觀察凋亡細胞百分比。

3、統(tǒng)計學(xué)方法

實驗都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗，認為當(dāng)P<0.05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4、結(jié)果：

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CKMT2組的細胞凋亡率為(17.23±0.012)％，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體組的細胞凋亡率為(6.41±0.013)％，上述差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果表明，CKMT2基因的過表達促進食管鱗癌細胞的凋亡。

實施例6軟瓊脂克隆形成實驗

1、用0.25％胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞，輕輕吹打使之成為單細胞懸液，離心收集細胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基重懸，適當(dāng)稀釋后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×10³個/ml。

3、制備兩個濃度分別為1.2％和0.7％的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃水浴中。

4、1.2％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直徑6cm平皿中放置5min冷卻凝固，作為底層瓊脂置于CO2溫箱中備用。

5、在無菌試管中1:1混合0.7％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基，再向管中加入0.2ml濃度為5×10³個/ml的穩(wěn)定感染細胞懸液，充分混勻，注入上述平皿中，逐漸形成雙瓊脂層，每個實驗組重復(fù)4個樣本。

6、待上層瓊脂凝固后，置入37℃5％CO₂溫箱中培養(yǎng)，每3天加培養(yǎng)基1.5ml。7、培養(yǎng)14天后取出培養(yǎng)皿，用1ml濃度為0.005％的龍膽紫染色90min。把平皿放置在倒置顯微鏡下觀察，每組細胞隨機選取10個低倍視野，鏡下技術(shù)形成的細胞克隆數(shù)。

8、結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與其他組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CKMT2的細胞組單細胞克隆集落形成數(shù)顯著降低。

實施例7Transwell細胞體外侵襲實驗

1、向Transwell小室的上孔中加入100μl的無血清培養(yǎng)液Matrigel浸泡30min。

2、用胰酶消化處于對數(shù)生長期的穩(wěn)定感染后各組細胞，PBS清洗細胞3次，用含有10％血清的培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10⁵/ml。

3、向包被有Matrigel的Transwell小室的上室中加入細胞懸液200μl。

4、Transwell小室的下室中加入600μl含20％FBS的DMEM培養(yǎng)液。

5、37℃，5％CO₂溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

6、除去上室和下室中的培養(yǎng)液，用棉簽刮除上室中的Matrigel和存留的細胞，用PBS清洗2次。

7、用1％結(jié)晶紫染色液染色45min，PBS清洗1次。

8、隨機選取4個100倍視野，在顯微鏡下分別計數(shù)侵襲細胞數(shù)，每種不同類型的細胞設(shè)3個復(fù)孔，共重復(fù)3次。

9、數(shù)據(jù)處理

用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為顯著差異。

10、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，KYSE150、pcDNA3.1空載、pcDNA3.1-CKMT2組細胞在transwell小室中培養(yǎng)24h后，pcDNA3.1-CKMT2組聚碳酸酯膜下室面的細胞數(shù)顯著減少。上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。