一種用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNAs CmiRNAs)是一類在序列上高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，長(zhǎng)約19_25nt (Finnegan EF 等，MicroRNA b1genesis: regulating the regulators.CritRev B1chem Mol B1l, 2013, 48(1): 51-68)。miRNAs在許多基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。每一個(gè)miRNA可以識(shí)別數(shù)百個(gè)靶基因的mRNAs，單個(gè)miRNA的失調(diào)可以影響整個(gè)基因網(wǎng)絡(luò)。miRNAs基因總數(shù)遠(yuǎn)少于mRNAs，是易于篩選和驗(yàn)證的生物標(biāo)志物(Lu J等，MicroRNA express1n profiles classify human cancers.Nature, 2005, 435(7043):834-838)o不同的癌癥類型具有特異miRNAs表達(dá)譜。此外，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療中miRNAs異常變化可以闡明癌癥的演變機(jī)理。因此，越來(lái)越多的研究人員正在將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向miRNA和腫瘤之間的關(guān)系上。
[0003]在世界范圍內(nèi)，食管癌的死亡率高居癌癥死亡率的第六位，而男性的發(fā)病率是女性的3-4 倍(Jemal A 等，Global cancer statistics.Ca Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90)。食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)發(fā)生在食管中部或上部1/3，是亞洲食管癌的主要病理亞型，約占食管癌的90%以上(Song YM等，Identificat1nof genomic alterat1ns in oesophageal squamous cell cancer.Nature, 2014,509(7498): 91-95)。由于我國(guó)地處“食管癌帶”，食管鱗癌的發(fā)病率和死亡率均居世界首位。在臨床上，食管鱗癌的早期診治可以顯著地改善病人的預(yù)后并降低死亡率，但目前尚缺乏食管鱗癌特異性的生物標(biāo)志物及有效的微創(chuàng)早期診斷方法。故食管鱗癌患者在確診時(shí)已有 50% 以上為中晚期(Zhang C 等，Cytoplasmic express1n of the ELAV-1ike proteinHuR as a potential prognostic marker in esophageal squamous cell carcinoma.Tumor B1l, 2014, 35 (I): 73-80)，其5年生存率在淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移時(shí)為20%_30%，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)為13%。盡管傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原、鱗狀細(xì)胞癌抗原已經(jīng)被用來(lái)早期診斷和檢測(cè)某些腫瘤的動(dòng)態(tài)變化，但這些血清腫瘤標(biāo)志物與食管鱗癌之間缺乏足夠的靈敏度和特異性。因此，尋找敏感、特異的食管鱗癌早期檢測(cè)的生物標(biāo)志物既是降低發(fā)病率和死亡率的迫切需求，也成為當(dāng)前研究的一個(gè)活躍領(lǐng)域。
[0004]由于血清miRNA容易獲得，是一個(gè)相對(duì)無(wú)創(chuàng)的采樣方式，同時(shí)由于血清miRNA非常穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可以抵抗RNase A的消化和苛刻的環(huán)境(如反復(fù)凍融、長(zhǎng)時(shí)間室溫放置、過(guò)酉愛過(guò)喊、極端 pH 等)(Chen X 等，Characterizat1n of microRNAs in serum: a novelclass of b1markers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res, 2008,18(10): 997-1006)，所以自2008年首次報(bào)道循環(huán)miRNA可作為潛在的腫瘤診斷工具后，關(guān)于血清miRNAs作為診斷、預(yù)后和早期預(yù)測(cè)人類疾病的科學(xué)文獻(xiàn)呈現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)(Jarry J等，The validity of circulating microRNAs in oncology: five years of challenges andcontradict1ns.Mol Oncol, 2014, 8(4): 819-829)。其中一些研究發(fā)現(xiàn)，血清miRNAs含量具有腫瘤特異性改變，說(shuō)明血清miRNAs具有作為癌癥生物標(biāo)志物的潛能(Komatsu S等，Circulating miR_18a: a sensitive cancer screening b1marker in human cancer.1nVivo, 2014, 28(3): 293-297)。血清miRNA既可來(lái)自癌組織，也可來(lái)自正常組織。在血清中miRNA與蛋白質(zhì)、脂類、外分泌體等形成復(fù)合物，從而保持較高的穩(wěn)定性。有些來(lái)自正常組織的血清miRNA可以作用于腫瘤細(xì)胞，補(bǔ)充癌細(xì)胞內(nèi)下降的miRNA。一旦這種作用不能發(fā)揮，腫瘤細(xì)胞將進(jìn)入轉(zhuǎn)移階段。因此，血清miRNA的高低可以反映腫瘤發(fā)展的動(dòng)力學(xué)變化，對(duì)腫瘤的診斷治療和預(yù)后提供生物標(biāo)志物。
[0005]隨著血清miRNA研究的深入，其作為一種疾病特別是腫瘤微創(chuàng)早期診斷方法也日益受到人們的青睞。有研究表明，血清miRNA與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系非常密切，可能成為食管鱗癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。最近的研究表明，血清miRNAs與食管鱗癌診斷和預(yù)后相關(guān)，這表明它們也可作為診斷和預(yù)后分類的潛在標(biāo)志物，有助于在食管鱗癌早期篩選出適當(dāng)?shù)闹委煼椒?。張春妮課題組以miR-25、miR-100、miR-193_3p、miR-194、miR-223、miR-337-5p、miR-483-5p為一組，在111例ESCC病人和111例正常人中檢測(cè)它們的含量變化(Zhang CN等，Express1n profile of microRNAs in serum: a fingerprintfor esophageal squamous cell carcinoma.Clin Chem, 2010, 56(12): 1871-1879)和以 miR-22、miR-100、miR-10a、miR_148b、miR-223、miR_133a、miR-127_3p 為另一組，在290例ESCC病人和140例正常人中檢測(cè)它們的含量變化(Wu CY等，Diagnostic andprognostic implicat1ns of a serum miRNA panel in oesophageal squamous cellcarcinoma.Plos One, 2014, 9(3): e92292)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些血清 miRNAs 在 ESCC 病人中含量均顯著高于正常人，而在其他腫瘤中無(wú)此變化，從而提出這兩種組合可作為食管鱗癌的診斷標(biāo)志物。此外，許多研究對(duì)血清miRNAs受試者工作特征曲線(Receiveroperating characteris-tic curve, ROC)進(jìn)行分析，并計(jì)算 ROC 曲線下面積(Area undercurve, AUC)來(lái)評(píng)估候選的血清/血楽miRNAs對(duì)食管鱗癌的預(yù)測(cè)能力。AUC越接近1，準(zhǔn)確性越高，相關(guān)文獻(xiàn)中AUC大多數(shù)都顯示較高的準(zhǔn)確性(Zou KH等，Receiver-operatingcharacteristic analysis for evaluating diagnostic tests and predictive models.Circulat1n, 2007，115(5): 654—657)。
[0006]—種血清miRNA作為腫瘤診斷標(biāo)志物往往特異性較低，若測(cè)定多種miRNAs組合和miRNA表達(dá)譜可提高診斷的準(zhǔn)確性，但是后者測(cè)定費(fèi)時(shí)且費(fèi)用較高，影響其廣泛應(yīng)用。因此，選擇適當(dāng)?shù)膍iRNA測(cè)定其比率變化則可以用較少的測(cè)定獲得較高的準(zhǔn)確性。Komatsu等研究結(jié)果顯示，用血漿中miR-21和miR-375含量的比率變化作觀測(cè)指標(biāo)，可以改善血漿的miRNA用作診斷的生物標(biāo)志物的靈敏度和特異性。相對(duì)單個(gè)miRNA的AUC，miR-21和miR-375含量比率的AUC值為0.816。在血漿中，miR-21和miR-375含量的比率可以區(qū)分健康人和食管癌患者，具有88%的敏感性和70%的特異性(Komatsu S等，CirculatingmicroRNAs in plasma of patients with oesophageal squamous cell carcinoma.BrJ Cancer, 2011, 105(1): 104-111)。Wang 等用 Meta-analysis 方法進(jìn)行分析后認(rèn)為:食管鱗癌血清miRNAs可以作為一種新的微創(chuàng)、具有優(yōu)越診斷特性的生物標(biāo)志物。相比于唾液miRNAs，血楽/血清miRNAs具有更好的診斷特性(Wang YY等，Identificat1n ofmicroRNAs as novel b1markers for detecting esophageal squamous cell carcinomain Asians: a meta-analysis.Tumor B1l, 2014, 35(11): 11596-11604)。
[0007]血清miRNAs的主要檢測(cè)方法有:芯片技術(shù)、qPCR、Northern雜交、原位雜交、高通量測(cè)序等。當(dāng)用低密度、Solexa、美國(guó)昂飛、安捷倫、Toray 3D_Gene microRNA高通量檢測(cè)食管鱗癌的血清/血漿miRNA表達(dá)譜時(shí)，所檢測(cè)到的miRNAs的差異數(shù)量從11-219個(gè)不等，而且重復(fù)率極低。不同實(shí)驗(yàn)室用相同的芯片技術(shù)或同一實(shí)驗(yàn)室用不同的芯片技術(shù)檢測(cè)時(shí)，miRNAs表達(dá)差異數(shù)量不大，但種類差異較大。而最常用的檢測(cè)方法是qPCR檢測(cè)。雖然大多數(shù)課題組選擇使用TaqMan探針檢測(cè)血清miRNA的表達(dá)水平，但無(wú)可爭(zhēng)議的事實(shí)是探針價(jià)格昂貴，單個(gè)miRNA的探針價(jià)格為1000元(150uL)只能檢測(cè)40多個(gè)樣本，因此，需要尋找經(jīng)濟(jì)、高效和特異的方法檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)的血清miRNAs，為相應(yīng)的與食管鱗癌相關(guān)miRNAs的表達(dá)情況的檢測(cè)以及食管鱗癌的檢測(cè)提供有效途徑，將有助于食管鱗癌的早期篩查與診斷。
[0008]綜上所述，本領(lǐng)域采用莖環(huán)引物qPCR技術(shù)檢測(cè)血清中食管鱗癌的基因標(biāo)志物miRNAs基因很少，因此可開發(fā)該技術(shù)應(yīng)用于食管鱗癌的早期診斷中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒。
[0010]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案，一種用于檢測(cè)食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒，其特征在于包含有用于診斷食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的莖環(huán)引物與RNase-free水配制的檢測(cè)試劑，其中食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因是hsa-miR-10a_5p 基因、hsa-miR-16_5p 基因、hsa-miR-18a_5p 基因、hsa-miR-21_5p 基因、hsa-miR-22_3p 基因、hsa-miR-25_3p 基因、hsa-miR-31_5p 基因、hsa-miR-100_5p 基因、hsa-miR-107 基因、hsa-miR-127_3p 基因、hsa-miR-129_5p 基因、hsa-miR-148b_3p 基因、hsa-miR-155_5p 基因、hsa-miR-194_5p 基因、hsa-miR-200c_