3p 基因、hsa-miR-223_3p 基因、hsa-miR-337_5p 基因、hsa-miR-375 基因、hsa-miR-483_5p 基因、hsa_miR-548k 基因、hsa-miR-1246基因或hsa-miR-1322基因，用于診斷食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的莖環(huán)引物為以下22種莖環(huán)引物中的至少一種:
(1)針對hsa-miR-10a-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.1所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAA-3’ ；
(2)針對hsa-miR-16-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.2所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCGCCAAT-3’ ；
(3)針對hsa-miR-18a-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.3所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTATCT-3’ ；
(4)針對hsa-miR-21-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.4所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAACA-3’ ；
(5)針對hsa-miR-22-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.5所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAGTT-3’ ；
(6)針對hsa-miR-25-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.6所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCAGAC-3’ ；(7)針對hsa-miR-31-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.7所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCTAT-3’ ；
(8)針對hsa-miR-100-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.8所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCACAAG-3’ ；
(9)針對hsa-miR-107基因的核苷酸序列如SEQID N0.9所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGATAG-3’ ；
(10)針對hsa-miR-127-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.10所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCCAA-3’ ；
(11)針對hsa-miR-129-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.11所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACGCAAGC-3’ ；
(12)針對hsa-miR-148b-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.12所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACAAAG-3’ ；
(13)針對hsa-miR-155-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.13所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACACCCCT-3’ ；
(14)針對hsa-miR-194-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.14所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCACA-3’ ；
(15)針對hsa-miR-200c-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.15所示的莖環(huán)引物；
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCCATC-3’ ；
(16)針對hsa-miR-223-3p基因的核苷酸序列如SEQID N0.16所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTGGGGT-3’ ；
(17)針對hsa-miR-337-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.17所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAACTCC-3’ ；
(18)針對hsa-miR-375基因的核苷酸序列如SEQID N0.18所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACTCACGC-3’ ；
(19)針對hsa-miR-483-5p基因的核苷酸序列如SEQID N0.19所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCTCCCT-3’ ；
(20)針對hsa-miR-548k基因的核苷酸序列如SEQID N0.20所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACAGCAAA-3’ ；
(21)針對hsa-miR-1246基因的核苷酸序列如SEQID N0.21所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCCTGCT-3’ ；
(22)針對hsa-miR-1322基因的核苷酸序列如SEQID N0.22所示的莖環(huán)引物:
5’ -GTCGTATCCATGGCAGGGTCCGAGGTATTCGCCATGGATACGACCAGCAT-3’。
[0011]進一步限定，所述的 hsa-miR-10a_5p 基因、hsa-miR-18a_5p 基因、hsa-miR-21_5p基因、hsa-miR-22_3p 基因、hsa-miR-25_3p 基因、hsa-miR-31_5p 基因、hsa-miR-100_5p基因、hsa-miR-127_3p 基因、hsa-miR-148b_3p 基因、hsa-miR-194_5p 基因、hsa-miR-200c_3p 基因、hsa-miR-223_3p 基因、hsa-miR-337_5p 基因、hsa-miR-483_5p 基因、hsa_miR-548k 基因、hsa-miR-1246 基因和 hsa-miR-1322 基因為上調(diào)基因，hsa-miR-107基因、hsa-miR-129-5p基因、hsa-miR-155_5p基因和hsa-miR-375基因為下調(diào)基因，has-miR-16-5p基因為內(nèi)參基因。
[0012]本發(fā)明所述的用于檢測食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的試劑盒的使用方法，其特征在于包括如下步驟:
(O提取待檢測血清樣本的總RNA，使用微量分光光度計測量RNA的濃度和純度；
(2)用待測莖環(huán)引物反轉(zhuǎn)錄待測樣品進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為20μ L，將上述混合液于42°C反應(yīng)50min，70°C加熱15min反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA ；
(3)用正向引物和通用引物添加qPCR體系為15yL;
(4)qPCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性階段，溫度為95°C，時間為5min ;循環(huán)反應(yīng)階段，變性溫度為95°C，時間為10s，退火溫度為60°C，時間為34s，40個循環(huán)；溶解曲線階段，變性溫度950C，時間15s，退火溫度600C，時間60s，變性溫度95°C，時間15s。
[0013]進一步限定，步驟(I)的具體過程為:將新鮮收集到的血液在37°C恒溫水浴鍋中溫浴20min ;室溫3000rpm離心5min，取上清，去沉淀；在4°C、12000rpm離心lOmin，去除沉淀，分裝上清，存儲在-80 °C;取出樣品，待樣品溶解后，于4°C將12000g離心1min，留上清；取100 μ L血清，加入300 μ L RNase-free水，渦旋混勻；加入400 μ L TRIzol，震蕩混勻，室溫放置5min，于4°C將12000g離心lOmin，去除沉淀;每ImL的TRIzol試劑加入0.2mL氯仿，渦旋15s，室溫放置2-3min，于4°C將12000g離心15min，取上清；每ImL TRIzol試劑加入0.5mL異丙醇，充分混勾，室溫放置lOmin，于4°C將12000g離心15min，去上清；加入ImL體積分數(shù)為75%的乙醇，渦旋混勻，于4°C將7500g離心5min，留沉淀，并干燥RNA沉淀；加Λ 20 μ L RNase-free 水溶解 RNA，并且在 55_60°C溫浴 15min。
[0014]相比于現(xiàn)有的檢測方法，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢:現(xiàn)有技術(shù)中，最常采用TaqMan探針qPCR法對食管鱗癌組織的miRNAs進行檢測，不可否認的事實是TaqMan探針價格昂貴，增加患者的負擔，同時采集樣本會對患者造成創(chuàng)傷性，且不能早期診斷，給患者帶來痛苦；本試劑盒直接采用莖環(huán)引物qPCR法對血清中多種與食管鱗癌相關(guān)miRNAs基因進行檢測，即可直接經(jīng)濟的檢測樣本，又可做到微創(chuàng)食管鱗癌早期診斷、大規(guī)模篩查和預(yù)后評估。由于食管鱗癌患者血清中多種miRNAs存在高表達，可作為其診斷食管鱗癌和預(yù)后評估的基因標志物，因此采用本發(fā)明的技術(shù)方案通過血清對于食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因表達的檢測可達到易采集、微創(chuàng)傷和快速經(jīng)濟檢測等優(yōu)點。另外，采用本發(fā)明的方案能同時對多種與食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的表達情況進行檢測，技術(shù)實踐中，如何使多種莖環(huán)引物的組合物在qPCR反應(yīng)中表現(xiàn)出良好的有效性和特異性是一項很大的篩選工程，而本發(fā)明的莖環(huán)引物組合物中包含多種莖環(huán)引物能夠高效、特異性明顯地與各自針對的目的基因進行特異性結(jié)合，并高效、快捷、經(jīng)濟地通過顯示出正確的檢測結(jié)果，大大提高檢測效率，降低檢測成本，為相應(yīng)的與食管鱗癌相關(guān)血清miRNAs基因的表達情況的檢測以及食管鱗癌的檢測提供了一種有效途徑。
【附圖說明】
[0015]圖1、2、3是本發(fā)明實施例中莖環(huán)引物檢測19例食管鱗癌患者手術(shù)前后血清樣品中與食管鱗癌相關(guān)miRNAs基因表達的實驗結(jié)果，圖1為食管鱗癌患者手術(shù)前后血清中miR-129-5p相對表達，圖2為食管鱗癌患者手術(shù)前后血清中miR-223_3p相對表達，圖3為食管鱗癌患者手術(shù)前后血清中miR-483-5p相對表達。
【具體實施方式】
[0016]為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0017]實施例1
莖環(huán)引物的設(shè)計與合成
通過在