Aldoa自身抗體及其在診斷食管鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用
【專利說明】ALDOA自身抗體及其在診斷食管鱗狀細(xì)胞癌中的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，涉及一種能區(qū)分食管鱗狀細(xì)胞癌患者和正常人的標(biāo)志物ALDOA (aldolase A, fructose-bisphosphate)自身抗體及其檢測方法和用途。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]食管癌是一種常見的上消化道惡性腫瘤，在全球范圍的各種癌癥中，其發(fā)病率和死亡率分別排在第八位和第六位。組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，食管癌主要包括食管鱗癌和食管腺癌兩種組織病理類型。我國的食管癌病例90%以上是食管鱗癌；食管腺癌主要發(fā)生在美國等西方國家。目前食管癌總的5年生存率不足15%，嚴(yán)峻情形十分令人擔(dān)憂。找尋新的食管癌早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后預(yù)警的分子標(biāo)志物，特別是血清分子標(biāo)志物，讓食管癌患者能夠及時(shí)有效的早查、早診、早治，是提高食管癌患者生存率、降低死亡率的關(guān)鍵科學(xué)問題。
[0005]關(guān)于食管鱗癌的特異性血清分子標(biāo)志物，長期以來臨床上一直十分缺乏。目前臨床上對可疑食管鱗癌患者所檢測的腫瘤血清分子標(biāo)志物，比如CEA(Carcinoma EmbryonicAntigen,癌胚抗原)和 SCCA (Squamous Cell Carcinoma Antigen,鱗狀細(xì)胞癌抗原)等均不是特異性針對食管鱗癌的，利用這些腫瘤血清分子標(biāo)志物難以對食管鱗癌患者開展準(zhǔn)確的早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后評估。按照腫瘤免疫監(jiān)視理論，正常情況下，人體的免疫監(jiān)視系統(tǒng)可以及時(shí)識別體內(nèi)癌變的細(xì)胞，并進(jìn)行有效的清除或抑制。腫瘤的自身抗體是機(jī)體對腫瘤免疫監(jiān)視反應(yīng)的產(chǎn)物，它在腫瘤患者出現(xiàn)臨床癥狀的前幾年就可能產(chǎn)生，表明癌癥患者腫瘤自身抗體在癌癥發(fā)生的早期階段就已經(jīng)產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等癌癥的患者，在不同病期，尤其是早期，均可以檢測到血清中腫瘤自身抗體水平升高，這突顯出了檢測自身抗體在惡性腫瘤早期診斷方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。在食管癌方面，抗Bm1-1自身抗體、抗ABCC3自身抗體等在食管鱗癌患者的水平顯著高于正常人。這些研究提示，腫瘤自身抗體在食管鱗癌患者的血清中是存在的，并且有希望作為一種有效的食管鱗癌早期診斷方法。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)志物，具體涉及一種能區(qū)分食管鱗癌患者和正常人的蛋白標(biāo)志物ALDOA (aldolase A, fructose-bisphosphate)自身抗體。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供該蛋白標(biāo)志物ALD0A自身抗體的ELISA檢測方法。
[0009]本發(fā)明的另一目的是提供ALD0A自身抗體可作為食管鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)志物的用途，以解決目前對食管鱗癌沒有靈敏有效的無創(chuàng)性診斷方法的問題。
[0010]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明采用血清蛋白質(zhì)組研究技術(shù)(如圖1所示)，通過雙向電泳以及蛋白印跡法，以8個(gè)食管鱗癌患者和8個(gè)正常人的血清為樣本，篩選有用的腫瘤自身抗原，經(jīng)對比分析，僅出現(xiàn)在患者血清中的蛋白點(diǎn)被進(jìn)一步分析(如圖2所示)。
[0011]本發(fā)明采用質(zhì)譜方法對上述蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析，經(jīng)檢測鑒定為AL0DA。
[0012]本發(fā)明為進(jìn)一步確認(rèn)AL0DA自身抗體是否可作為食管鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)志物，應(yīng)用ELISA分析，檢測患者血清中AL0DA自身抗體的表達(dá)水平，其包括步驟:用大腸桿菌表達(dá)該蛋白并進(jìn)行純化，用該純化蛋白包被96孔板，并檢測95例食管鱗癌患者和57例正常人在內(nèi)的152例臨床樣本，結(jié)果顯示，AL0DA自身抗體在食管鱗癌患者血清中的表達(dá)水平高于正常人，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.001，如圖4所示)。
[0013]為檢測AL0DA自身抗體對于食管鱗癌的診斷能力，本發(fā)明通過食管鱗癌患者組對于正常人組進(jìn)行R0C分析，結(jié)果顯示(圖5)，曲線下面積為0.718 (95%C1: 0.636-0.800),診斷敏感度和特異度分別為45.3%和89.5%。
[0014]結(jié)果表明，本發(fā)明提供ALD0A自身抗體標(biāo)志物可作為食管鱗癌標(biāo)志物，本發(fā)明提供了所述ALD0A自身抗體標(biāo)志物的ELISA檢測方法；本發(fā)明提供的ALD0A自身抗體可用于食管鱗癌的診斷。
[0015]
【附圖說明】
[0016]圖1篩選和鑒定食管鱗狀細(xì)胞癌ALD0A自身抗體的技術(shù)路線。
[0017]圖2血清標(biāo)本的雙向電泳-免疫印跡檢測結(jié)果，其中A為EC109食管癌細(xì)胞系經(jīng)雙向電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果，B為食管鱗癌患者血清的雙向電泳-免疫印跡結(jié)果，C為正常人血清的雙向電泳-免疫印跡結(jié)果。
[0018]圖3 ALD0A肽段的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
[0019]圖4 ELISA檢測食管癌患者和正常人血清中ALD0A自身抗體的滴度水平。
[0020]圖5 R0C分析ALD0A自身抗體對食管鱗癌的診斷效能。
[0021]
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例和附圖做進(jìn)一步說明。
[0023]1.食管鱗癌患者和正常人血清收集
食管鱗癌患者和正常人血清樣本收集來自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，此項(xiàng)研究獲得了汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會認(rèn)可。血液標(biāo)本于125(k離心5分鐘，收集血清，所有樣本均于_80°C冰箱保存。所有患者均經(jīng)病理學(xué)診斷為食管鱗狀細(xì)胞癌，正常人樣本來自醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員，年齡與性別與食管鱗癌患者相匹配。采用血清蛋白質(zhì)組研究技術(shù)(如圖1所示)，8例食管鱗癌患者血清和8例正常人血清被用于篩選自身抗體。使用95例食管鱗癌患者和57例正常人，共152例臨床樣本來檢測和驗(yàn)證ALD0A自身抗體的存在及用途。
[0024]2.雙向電泳-蛋白印跡分析
使用單去污裂解劑(8M尿素，4% CHAPS, 2%兩性載體Pharmalyte溶液，40 mM DTT，100Pg/ml PMSF)充分裂解EC109食管癌細(xì)胞并收集，再測定蛋白濃度。取5微克蛋白稀釋于水化上樣緩沖液(8M尿素，4% CHAPS, 65mM DTT,0.2% B1-Lyte，0.001%溴酚藍(lán))，并裝置于IPG膠條上(7cm pH 3-10)。使用Protein IEF Cell (B1-Rad)進(jìn)行第一向等電聚焦。聚焦結(jié)束的膠條，立即進(jìn)行平衡及第二向SDS-PAGE電泳。分離出來的蛋白采用Thermo ScientificImperial蛋白試劑(即用型考馬斯亮藍(lán)染料)染色顯示或者用60v電壓1小時(shí)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液在4°C過夜封閉，洗膜后，再用患者或正常人血清(1:250稀釋)作為一抗孵育1.5小時(shí)。再洗膜，用1:6000稀釋的goat ant1-humanIgG-HRP conjugated (Santa Cruz)作為二抗進(jìn)行檢測。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
[0025]3.質(zhì)譜鑒定
通過對比經(jīng)Thermo Scientific Imperial蛋白試劑染色的2D膠和免疫印跡的PVDF膜確定蛋白點(diǎn)的相應(yīng)位置。將僅出現(xiàn)在患者血清中的蛋白點(diǎn)進(jìn)行挖點(diǎn)，酶切，肽段提取，點(diǎn)靶，質(zhì)譜儀檢測。
[0026]挖點(diǎn):取一塊棉花用75%乙醇潤濕后擦干凈針備用。從4°C冰箱中拿出膠，挖出相應(yīng)的點(diǎn)，挖點(diǎn)時(shí)用針