檢測(cè)辣椒中黃曲霉毒素b1的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)，具體設(shè)及一種用于檢測(cè)辣椒中黃曲霉毒素B1的 酶聯(lián)免疫試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒是中國(guó)很多地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、口感極佳和飲食習(xí)慣，是餐 桌上最常見的主菜。干辣椒是由成熟的辣椒干制而成的一種重要調(diào)料，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 可制成辣椒油、辣椒醬、辣椒粉、食品添加劑，其在儲(chǔ)運(yùn)和銷售等環(huán)節(jié)中，在溫度、濕度適宜 的環(huán)境條件下，極易滋生各種微生物，而使辣椒發(fā)霉變質(zhì)，致使辣椒品質(zhì)下降，其中W黃曲 霉毒素的污染和危害最為突出，嚴(yán)重制約了干辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT)是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的化合物，主要由黃曲霉 (aspergillusflavus)寄生曲霉（a.parasiti州S))產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，均為二氨巧喃香 豆素的衍生物，黃曲霉毒素（81、82、61、62)是一群結(jié)構(gòu)相似，黃曲霉毒素81含有一個(gè)雙巧 喃環(huán)和一個(gè)氧雜糞鄰酬，前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān)，黃曲霉毒素B1是毒性最 強(qiáng)的一種，可引起內(nèi)臟器官的病變，給人類健康帶來(lái)極大威脅，其毒性是氯化鐘的10倍，祇 霜的68倍，因此受到世界各國(guó)的普遍關(guān)注，世界衛(wèi)生組織（WT0)的癌癥研究機(jī)構(gòu)于1993年 將黃曲霉毒素劃定為I類致癌物質(zhì)。
[0004] 目前，黃曲霉毒素B1的檢測(cè)方法主要有：免疫親和層析凈化高效液相色譜法、免 疫親和層析凈化巧光光度法、薄層色譜等多種檢測(cè)方法。免疫親和層析凈化高效液相色譜 法，樣品前處理過程較為復(fù)雜、耗時(shí)、需純化處理，檢測(cè)需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室大型試驗(yàn)儀器和 設(shè)備，配備專業(yè)檢測(cè)人員進(jìn)行試驗(yàn)操作，難W滿足現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模檢測(cè)。免疫親和層析凈化巧光 光度法，樣品前處理過程較為復(fù)雜、耗時(shí)、需純化處理，檢測(cè)需要巧光光度計(jì)，難W滿足現(xiàn)場(chǎng) 檢測(cè)需要。薄層色譜法樣品前處理繁瑣，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜、耗時(shí)、準(zhǔn)確性差，靈敏度低、特異性 不強(qiáng)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員危害較大。本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)，能 夠滿足現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模檢測(cè)的快速篩選檢驗(yàn)的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)辣椒中黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫試 劑盒，本發(fā)明酶聯(lián)免疫試劑盒操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能對(duì)辣椒及辣椒制品中黃曲霉毒素B1含 量進(jìn)行快速檢測(cè)，特別適合現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的篩選檢測(cè)。
[0006] 本發(fā)明提供一種黃曲霉毒素B1單克隆抗體和生產(chǎn)制備運(yùn)種單克隆抗體的方法。 黃曲霉毒素B1是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng) 答。對(duì)黃曲霉毒素B1分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，獲得黃曲霉毒素B1半抗原，從而制備特異性抗體。 黃曲霉毒素B1與鹽酸徑胺縮合反應(yīng)，引入一個(gè)新的徑基，再與班巧酸酢反應(yīng)得到具有簇基 的黃曲霉毒素B1半抗原（圖2)，該黃曲霉毒素B1半抗原與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到黃曲 霉毒素B1完全抗原（免疫原或包被原）。
[0007] 前述載體蛋白可為卵清蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白常用載體蛋白。
[0008] 本發(fā)明采用混合酸酢法將黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，重點(diǎn)突出黃曲 霉毒素B1的特征結(jié)構(gòu)，增加了黃曲霉毒素B1半抗原的免疫原性。經(jīng)測(cè)定本發(fā)明中黃曲霉 毒素B1與牛血清白蛋白的結(jié)合摩爾比為14-18:1，滿足抗體制備條件。
[0009] 所述黃曲霉毒素B1特異性抗體為黃曲霉毒素B1單克隆抗體，它們均是前述黃曲 霉毒素B1免疫原免疫動(dòng)物制備得到的。
[0010] 所述黃曲霉毒素B1單克隆抗體優(yōu)選為黃曲霉毒素B1鼠單克隆抗體。
[0011] 本發(fā)明過程中原材料制備過程： 1.半抗原的合成 黃曲霉毒素B1半抗原合成技術(shù)路線如圖2。
[0012] 2.黃曲霉毒素B1抗體的制備 (1)免疫原制備 將黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白采用混合酸酢法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。
[0013] (2)黃曲霉毒素B1鼠單克隆抗體的制備 a)免疫：選取Ba化/c小鼠作為免疫動(dòng)物，黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為 免疫原，血清效價(jià)大于1 : 10000后，取脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0014]b)細(xì)胞融合與克隆化：取免疫Ba化/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選 細(xì)胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[001引 3.抗抗體的制備 羊抗鼠抗抗體是W羊作為免疫動(dòng)物，W鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病菌體羊進(jìn)行免疫，得 到羊抗鼠抗抗體； 4.本發(fā)明所提供的黃曲霉毒素B1檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)辣椒黃曲霉毒素B1含量。
[0016] 所述試劑盒還包括黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗涂液、 濃縮復(fù)溶液。
[0017] 所述黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液：6瓶，濃度分別為0,0. 02,0. 05,0. 15,0. 60和 1. 8μg/Lo
[0018] 所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶或堿性憐酸醋酶，其中優(yōu)選辣根過氧化 物酶；酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體是采用戊二醒法或過艦酸鋼法將標(biāo)記酶與抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得 到的。
[0019] 當(dāng)標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶時(shí)，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液 A液為過氧化氨或過氧化脈，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1~ 2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當(dāng)標(biāo)記酶為堿性憐酸醋酶時(shí)，顯色液為對(duì)硝基憐酸鹽緩沖 液、終止液為1~2mol/L氨氧化鋼溶液。
[0020] 所述濃縮洗涂液為抑值為7. 2-7. 5、含有0. 8-1. 2 %吐溫-20、0. 3-0. 6%〇疊氮化 鋼，0. 1-0. 2mol/L的憐酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積比。
[0021] 所述濃縮復(fù)溶液為抑7. 5-7. 8,含有2-4 %酪蛋白，0. 1-0. 2mol/L的憐酸鹽緩沖 液，所述百分比為重量體積百分比。
[0022] 其中酶標(biāo)板在制備過程中所用的包被緩沖液為抑值為9. 2-9. 6、0. 1-0. 2mol/L的 碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為含有5-8%脫脂奶粉，抑值7. 2-7. 6、0. 1-0. 2mol/L的憐酸鹽 緩沖液，所述百分比為重量體積比。
[0023] 本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為：用包被緩沖液將黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原、抗體或 抗抗體稀釋成0. 15-0. 25μg/ml，每孔加入100μ1，37°C溫育化或4°C過夜，傾去包被液，用 稀釋的濃縮洗涂液洗涂2次，每次30秒，甩掉孔中液體，W吸水紙吸除殘余水分后，向每孔 中加入200μ1封閉液，37°C溫育化，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用侶膜真空密封，4°C干燥處保 存?zhèn)溆谩?br>[0024] 5.本發(fā)明的檢測(cè)原理為： 當(dāng)在酶標(biāo)板上預(yù)包被黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，再加 入黃曲霉毒素B1特異性抗體溶液，樣本中殘留的黃曲霉毒素B1藥物與酶標(biāo)板上包被的黃 曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)黃曲霉毒素B1特異性抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行放大作用，用 顯色液顯色，樣本吸光值與黃曲霉毒素B1藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出 樣本中黃曲霉毒素B1的殘留量。同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中黃曲霉毒素B1殘留量的濃度范圍。
[00巧]當(dāng)在酶標(biāo)板上預(yù)包被黃曲霉毒素B1特異性抗體時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液 后，再加入酶標(biāo)記黃曲霉毒素B1半抗原溶液，樣本中殘留的黃曲霉毒素B1藥物與酶標(biāo)記抗 原競(jìng)爭(zhēng)包被在酶標(biāo)板上的黃曲霉毒素B1特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與黃曲霉 毒素B1藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素B1的殘留含量。 同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色的比較可粗 略判斷樣品中黃曲霉毒素B1殘留量的濃度范圍。
[0026] 當(dāng)在酶標(biāo)板上預(yù)包被黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后， 再加入酶標(biāo)記黃曲霉毒素B