本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及miRNA-4512在骨肉瘤診斷中的應用。
背景技術：
：骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，由惡性增殖的肉瘤細胞直接產(chǎn)生腫瘤性骨樣組織或不成熟骨，也稱成骨肉瘤，其組織學特點是增生的梭形腫瘤細胞直接產(chǎn)生骨樣基質或不成熟骨，顯微鏡下可見許多腫瘤細胞，細胞及細胞核大小、形狀不一，有小型多核巨細胞，梭形細胞，不成熟的軟骨細胞及惡性成骨細胞，細胞核大，染色很深。幾乎所有骨肉瘤轉移均經(jīng)血液轉移至肺，少數(shù)轉移至腦、腎等內臟器官以及經(jīng)淋巴結轉移。骨肉瘤可分為不同的亞型，軟骨母細胞型骨肉瘤作為普通型骨肉瘤的一個亞型和其他普通型骨肉瘤的臨床治療和預后并無大的差別，但因影像學表現(xiàn)及病理組織學上與軟骨肉瘤有相互重疊之處,容易誤診為軟骨肉瘤，故主要應與軟骨肉瘤進行鑒別。軟骨母細胞型骨肉瘤以產(chǎn)生軟骨基質為主，大多為高級別透明軟骨，除了頜骨和盆骨的軟骨母細胞型骨肉瘤以外，腫瘤內的軟骨基質很少有明顯黏液變性或出現(xiàn)其他形式的軟骨肉瘤成分。軟骨母細胞型骨肉瘤的瘤組織中，1/2以上呈軟骨肉瘤樣結構，在此基礎上可化生形成腫瘤骨。骨肉瘤總發(fā)病率約占人類惡性實體腫瘤的0.2％，發(fā)病年齡多在15-25歲之間，男性多于女性，好發(fā)部位是長管狀骨的干髓端，股骨遠端和脛骨近端最多見，其次是肱骨和腓骨近端，其他部位如股骨近端、脊椎、骼骨等骨組織均可發(fā)生。該腫瘤的惡性程度甚高，預后極差，特點是局部和遠處轉移發(fā)生早，臨床做出骨肉瘤診斷時，其中大部分患者已經(jīng)出現(xiàn)肺的微小轉移灶，5年生存率低。近年來由于新輔助化療和化療方案的進步以及手術技術的不斷提高，明顯提高了骨肉瘤患者的生存率。目前采用手術聯(lián)合化療的綜合治療方案，骨肉瘤病人5年生存率為55-68％，仍然不令人滿意，其預后不良的主要原因早期發(fā)生轉移，當前的抗轉移治療尚不能獲得滿意效果。骨肉瘤的侵襲及轉移嚴重影響著患者的生活質量和預后，基因水平的治療成為廣大學者研究的熱點，但其具體機制以及治療方案仍有待進一步研究，而基因治療中尋求有效的治療靶點成為需要解決的關鍵問題之一。最近的研究表明microRNA(miRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。miRNAs是一種內源性非編碼的單鏈小分子RNA，約有18-26個核若酸，主要作用機制是通過與目標靶基因的mRNA分子的3'端非編碼區(qū)域特異結合來抑制靶基因的mRNA轉錄后的翻譯，從而參與了人體內多個生理和病理過程。尋找與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展相關的miRNA對骨肉瘤的科學研究和臨床上的應用就有重要的意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種miRNA診斷標志物，該診治標志物為miRNA-4512。本發(fā)明的目的之二，提供一種產(chǎn)品，能夠實現(xiàn)骨肉瘤的早期診斷，提高骨肉瘤患者的生存率和生活質量。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：本發(fā)明提供了miRNA-4512或其同源物在制備診斷骨肉瘤的產(chǎn)品中的應用。進一步，所述骨肉瘤為軟骨母細胞型骨肉瘤。進一步，所述產(chǎn)品通過測定樣本中miRNA-4512或其同源物的表達水平以診斷骨肉瘤。進一步，所述產(chǎn)品包括通過使用qRT-PCR、印記雜交、原位雜交、陣列雜交、基因芯片或新一代測序來檢測miRNA-4512或其同源物的水平以診斷骨肉瘤的產(chǎn)品。其中，miRNA-4512或其同源物在骨肉瘤組織中表達下調，與對照相比，當患者血液中的miRNA-4512顯著降低時，可以判斷患者患有骨肉瘤或者有患骨肉瘤的風險。進一步，所述產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒。其中，所述芯片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應于上面所述的miRNA-4512的部分或全部序列。所述試劑盒包括用于檢測上面所述的miRNA-4512的表達水平的試劑。進一步，所述試劑盒包括擴增miRNA-4512的引物對，序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。本發(fā)明提供了一種診斷骨肉瘤的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測樣本中miRNA-4512或其同源物的水平來診斷骨肉瘤。進一步，所述樣本包括血液、尿液、腦脊液、組織液、汗液、唾液、淚液。在本發(fā)明的具體實施方式中，所述樣本為血液。進一步，所述產(chǎn)品包括芯片和/或試劑盒。其中，所述芯片包括固相載體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應于上面所述的miRNA-4512的部分或全部序列。所述試劑盒包括用于檢測上面所述的miRNA-4512的表達水平的試劑。進一步，所述試劑盒包括miRNA-4512的引物和/或探針。所述試劑盒還包括針對現(xiàn)有技術中已經(jīng)報道的診斷骨肉瘤miRNA的引物和/或探針。將多種miRNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種miRNA指標聯(lián)合診斷骨肉瘤的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內。所述芯片(即微陣列)包含針對miRNA-4512特異性的一組寡核苷酸(如寡脫氧核苷酸)探針。通過使用該微陣列，可通過逆轉錄RNA以產(chǎn)生一組靶寡脫氧核苷酸，然后使其與微陣列上的探針寡脫氧核苷酸雜交，從而產(chǎn)生雜交或表達譜，來測定生物樣品中多種微小RNA的表達水平。miRNA特異性的探針寡核苷酸或對miRNA特異性的探針寡核苷酸是指具有經(jīng)選擇與特定miRNA基因產(chǎn)物雜交或與該特定miRNA基因產(chǎn)物的逆轉錄物雜交的序列的探針寡核苷酸。在本發(fā)明的具體實施方式中，所述miRNA-4512是成熟miRNA-4512，核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO.1所示。應當知道，本發(fā)明的miRNA-4512包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，“變體”是指，與對應野生型miRNA基因產(chǎn)物具有少于100％的同一性并且具有對應野生型miRNA基因產(chǎn)物的一個或多個生物活性的miRNA。此類生物活性的實例包括但不限于，與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的細胞過程(例如，細胞分化、細胞生長、細胞死亡)的抑制。這些變體包括物種變體和由于miRNA基因的一個或多個突變(例如，置換、缺失、插入)而產(chǎn)生的變體。在某些實施方案中，變體與對應野生型miRNA基因產(chǎn)物具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性。其顯示完整miRNA-4512核酸分子相同的功能，它們可能通過核苷酸殘基的缺失、置換或者插入而突變。本領域人員熟知，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可以在miRNA的一端或者兩端增加保護性堿基，如TT，也可對miRNA堿基進行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領域技術人員熟知，在不影響miRNA-4512功能的條件下，對miRNA-4512進行堿基修飾或者在兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā)明的miRNA-4512核酸分子可以以單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的miRNA-4512主要呈單鏈形式，而miRNA-4512前體是部分自互補的，以形成雙鏈結構。本發(fā)明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。根據(jù)SEQIDNO.1所示的核酸序列，可以生成用于給定miRNA基因產(chǎn)物的RNA印記雜交的合適探針，包括但不限于，與目標miRNA基因產(chǎn)物具有至少約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或完全互補的探針。標記的DNA和RNA采用常規(guī)方法制備，例如核酸探針用下述物質標記，如放射性核素3H、32P、33P、14C或35S，重金屬，能起到標記配體的特異性結合對成員功能的配體如生物素、抗生物素蛋白或抗體等，熒光分子，化學發(fā)光分子、酶等。通過切口平移法或隨機引物法，可以將探針標記成高比放射性，后者是從單鏈DNA或從RNA模板合成高比放射性的32P-標記的探針的選擇方法。例如，通過根據(jù)切口平移法用高效放射性的核苷酸替換現(xiàn)有的核苷酸，可以制備比放射性大大超過108cpm/微克的32P-標記的核酸探針。然后通過使雜交的濾膜曝光于照相膠片，可以進行雜交的放射自顯影檢測。對雜交的濾膜曝光的照相膠片的光密度掃描，會提供miRNA基因轉錄產(chǎn)物水平的精確測量。本發(fā)明所述的寡核苷酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術中已經(jīng)報道的可用于診斷骨肉瘤的miRNA的寡核苷酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同一芯片上通過檢測多種miRNA指標聯(lián)合診斷骨肉瘤的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內。上面所述試劑還包括針對現(xiàn)有技術中已經(jīng)報道的診斷骨肉瘤miRNA的引物和/或探針。將多種miRNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種miRNA指標聯(lián)合診斷骨肉瘤的情況也包含在本發(fā)明的保護范圍之內。所述的miRNA芯片的制備可采用本領域已知的生物芯片的常規(guī)制造方法，例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或硅片上，排列成預定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修飾，則其制備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolofgeneexpressiononagenomicscale.Science，1997；278：680和馬立人，蔣中華主編.生物芯片.北京：化學工業(yè)出版社，2000，1-130。本發(fā)明的miRNA-4512可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表達miRNA-4512的DNA片段的載體轉染細胞獲得。真核表達載體可以是任何適當?shù)谋磉_載體，包括但不限于pCMV-Myc表達載體、pcDNA3.0表達載體、pcDNA3.1表達載體、pEGFP表達載體、pEFBos表達載體、pTet表達載體、pTRE表達載體、或者在公知表達載體的基礎上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301等?？梢员磉_miRNA-4512的DNA片段可以通過如下方式獲取：從miRNA數(shù)據(jù)庫中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)尋找miRNA-4512在基因組上的位置及具體序列信息，根據(jù)基因組序列確定miRNA-4512初始miRNA的位置，在miRNA-4512初始miRNA位置的上下游500-800bp區(qū)間內設計特異性引物，擴增引物中間的序列即可獲得表達miRNA-4512的DNA片段。在本發(fā)明中，“陣列”或“微陣列”是雜交陣列原件有序排列在基質上，所述雜交陣列原件諸如聚核苷酸探針(例如寡核苷酸)或結合劑(例如抗體)。所述基質可以是固體基質，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纖維光學粘結劑或半固態(tài)基質，例如硝酸纖維素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。微陣列可從產(chǎn)生自已知miRNA序列的基因-特異的寡核苷酸探針來制備。陣列可含有每個miRNA的2種不同的寡核苷酸探針，一種含有活性的成熟序列，而另一種特異于miRNA的前體。陣列還可含有對照，諸如與人類直向同源物僅幾個堿基不同的一種或多種小鼠序列，其可作為雜交嚴緊條件的對照。來自兩個物種的tRNA也可印在微芯片上，提供了特異雜交的內部、相對穩(wěn)定的陽性對照。非特異雜交的一個或多個適當?shù)膶φ找部砂ㄓ谖⑿酒?。miRNA基因產(chǎn)物的“生物活性片段”是指，具有對應野生型miRNA基因產(chǎn)物的一個或多個生物活性的miRNA基因產(chǎn)物的RNA片段。如上文中所述，此類生物活性的實例包括但不限于，骨肉瘤的細胞增殖過程的抑制。在某些實施方案中，生物活性片段在長度上為至少約5、7、10、12、15或17個核苷酸。在具體的實施方案中，可將分離的miRNA基因產(chǎn)物與一種或多種另外的抗癌治療組合來給受試者施用。適當?shù)目拱┲委煱ǖ幌抻冢瘜W療法、放射療法以及組合(例如，放化療)。術語“miRNA基因產(chǎn)物”或“同源物”可以是任何從miRNA基因轉錄得到的產(chǎn)物，包括初級轉錄產(chǎn)物、初級miRNA、pre-miRNA、miRNA*、成熟miRNA或其變體。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了miRNA-4512的表達水平與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展相關，通過檢測miRNA-4512的水平，可以判斷患者是否患有骨肉瘤或者患骨肉瘤的風險。本發(fā)明提供了一種診斷骨肉瘤的產(chǎn)品，該產(chǎn)品能夠在骨肉瘤發(fā)病早期進行診斷，指導醫(yī)生進行早期干預，提高患者的生存率和生活質量。附圖說明圖1顯示利用高通量測序檢測miRNA-4512在骨肉瘤患者血液中的表達情況；圖2顯示利用qPCR檢測miRNA-4512在骨肉瘤患者血液中的表達情況。具體實施方式下面結合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1與骨肉瘤相關的miRNA的篩選1、樣本獲?。菏占?0例軟骨母細胞型骨肉瘤患者及10名正常人。受試者要求空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室溫下，抽取10ml靜脈血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，提取外周血單個核細胞PBMCs，加入1mlTrizol試劑(Invitrogen公司)，充分混勻，-80℃保存標本，以用于RNA提取。所有的血樣和病理結果應真實可靠，研究經(jīng)倫理委員會批準，患者知情同意。2、血液單核細胞RNA的提取使用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒提取總RNA。步驟如下：(1)先加1mlTrizol于1×107細胞中，若凍存細胞直接加入Trizol，不需解凍，吹打裂解后室溫靜置5-10min。(2)加入0.2ml氯仿(三氯甲脘)，劇烈震蕩15s，室溫靜置2-3min。(3)在4℃下12000g離心15min。(4)小心吸出上清水相約500μl移入另一離心管(注意不要抽到蛋白層)，加入500μl異丙醇(專用)，顛倒混勻，室溫靜置10min。(5)4℃12000g離心10min，倒去上清液，底部可見針尖大小白色物質。(6)加入1ml70％乙醇旋轉洗滌，清洗異丙醇。(7)4℃7500g離心5min，去除乙醇(盡量用槍頭吸干凈)后晾5-10min，不要太干，否則難以溶解，放置于-70℃保存。3、RNA樣品的質量分析(NanoDrop1000分光光度計)NanoDrop2000分光光度計檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280≧1.8。將上述提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，Agilent2100(RNA6000Nanokit)檢測RNA樣品質量，在凝膠成像儀上觀測、拍照，保存圖像，要求28S:18S≥1；RIN值≧7.0。4、SRNA文庫構建實驗采用IlluminaTruSeqSmallRNA試劑盒構建文庫，在總RNA中回收長度18-30ntRNA，通過RT-PCR逆轉錄成單鍵cDNA，cDNA擴增后，回收cDNA產(chǎn)物，建成小RNAs文庫。5、測序運用lluminaHiseq2500/Miseq第二代高通量測序技術對mRNA和miRNA進行測序，通過去接頭、去低質量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。6、結果：通過轉錄組數(shù)據(jù)分析軟件對miRNA原始數(shù)據(jù)進行背景校正后進行t-test得到P值，然后利用Fisher檢驗合并P值，篩選差異表達的miRNA。設定p值＜0.01且log2(Fold_change)normalized的絕對值≥3作為顯著性閾值。如圖1所示，miRNA-4512在正常人和骨肉瘤患者中差異表達，在軟骨母細胞型骨肉瘤患者血液中顯著下調(P<0.05)。實施例2QPCR驗證差異表達的miRNA-45121、根據(jù)miRNA芯片的檢測結果選擇miRNA-4512進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇正常人和軟骨母細胞型骨肉瘤樣本各60例。2、RNA提取過程同實施例1。3、逆轉錄：1)將10pg-1μg的總RNA模板與2μl10×緩沖液、2μldATP(10mM)、0.5μlpolyA多聚酶、0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制劑和無核糖核酸酶水(RNasefreewater)混合，體積最后為20μl，37℃孵育1h。2)反應管中加入1μl0.5μg/μlOligo(dT)特異性RT引物，70℃孵育5min。3)立即冰上孵育至少2min，打斷RNA和引物的二級結構。4)將上述20μl反應混合物與4μl5×緩沖液、1μldNTP(10mM)，0.5μlM-MLV逆轉錄酶，0.5μl核糖核酸酶(RNase)抑制劑，10μlpolyA反應混合液和4μl無核糖核酸酶水(RNasefreewater)混合，42℃孵育1h。4、QPCR反應：1)引物設計擴增miRNA-4512的引物正向引物：CAGGGCCTCACTGTATCGCCCA(SEQIDNO.2)反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQIDNO.3)擴增U6snRNA的引物正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQIDNO.4)反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT(SEQIDNO.5)2)按照表1配制PCR反應體系：其中，SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。表1PCR反應體系體積SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系12.5μl正向引物1μl反向引物1μlcDNA模板2μlddH2O8.5μl總體積25μl3)PCR反應條件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45個循環(huán)。以SYBRGreen作為熒光標記物，在LightCycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應，以U6snRNA作為參照基因，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進行相對定量。5、結果如圖2所示，與正常人血液相比，骨肉瘤患者血液中的miRNA-4512的表達水平顯著降低，與高通量測序結果一致(P<0.05)。上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內。當前第1頁1 2 3