Dj-1蛋白在制備骨肉瘤診斷和治療產(chǎn)品中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種DJ-1蛋白在制備骨肉瘤診斷和治療產(chǎn)品中的應用，該DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo：1所示。本發(fā)明實驗證明DJ-1蛋白在骨肉瘤組織中的表達明顯高于非腫瘤組織；且在骨肉瘤細胞中過表達（敲除）DJ-1蛋白可顯著降低（增加）骨肉瘤細胞對一線治療藥物的敏感性。因此，DJ-1蛋白可作為骨肉瘤診斷和治療的特異性標志蛋白，提高骨肉瘤診斷的準確性和治療的有效性。本發(fā)明DJ-1蛋白為防治骨肉瘤提供了新的治療靶標和有效新藥。
【專利說明】DJ-1蛋白在制備骨肉瘤診斷和治療產(chǎn)品中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種DJ-1蛋白在制備診斷和治療骨肉瘤廣品中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]骨肉瘤是最常見的惡性成骨性腫瘤之一，流行病學研究發(fā)現(xiàn)該病好發(fā)于15-25歲的青少年，且男性發(fā)病率高于女性。骨肉瘤好發(fā)部位是長管狀骨的干骺端，該腫瘤惡性程度高，預后極差，單純截肢后患者的5年生存率低于20%。因此，有效診斷和防治骨肉瘤是目前骨腫瘤研究中的重點和難點。[0003]人DJ-1 蛋白是由 DJ-1 基因(Genebank N0.NM 007262.4)編碼而來，是 Thi j/PfPI家族成員之一。目前該蛋白的功能尚未被完全探明，有研究報道其與人類常染色體隱性遺傳早發(fā)型帕金森病相關(guān)；在腫瘤方面有報道DJ-1在多種腫瘤性病變中異常表達，并可能參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但DJ-1蛋白能否作為骨肉瘤診斷的標記分子和治療靶點尚無研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種DJ-1蛋白在制備治療骨肉瘤的藥物中的應用，該DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:l所示。所述治療骨肉瘤的藥物包括:通過RNA干擾抑制DJ-1基因表達的雙鏈核糖核酸，或用于抑制DJ-1蛋白功能的短肽和小分子化合物。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供一種DJ-1蛋白在制備診斷骨肉瘤產(chǎn)品中的應用，該DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。所述診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括:用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品。
[0006]其中所述用免疫檢測診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括--與DJ-1蛋白特異性結(jié)合的抗體。
[0007]所述用RT-PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴增DJ-1基因的引物:正向引物:5’ -AGACGGTCATCCCTGTAGAT-3’ (SEQ ID No:2)；反向引物:5’ -GCTCCTTCAGTATCTCCTTCAC-3’ (SEQ ID No:3)。
[0008]所述用實時定量PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴增DJ-1基因的引物:正向引物:5，-AGCCGTGATGTGGTCATTT-3，(SEQ ID No:4);反向引物:5，-GTCTTTAGCAAGAGGGTGTGT-3’ (SEQ ID No:5)。
[0009]所述用原位雜交診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括:與DJ-1基因的核酸序列雜交的探針:5’-TCATCCACATTACTGGAGGTAAGTAGT-3’ (SEQ ID No:6)。
[0010]所述用基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括:與DJ-1基因的核酸序列雜交的探針:5’-ACTCGGTTGTCTCGTCATCCTGGACGT-3’ (SEQ ID No:7)。
[0011]在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來制備針對DJ-1蛋白的特異性抗體。例如，將純化的人DJ-1蛋白或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達人DJ-1蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑DJ-1功能的抗體，也可以是不影響人DJ-1蛋白功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人DJ-1蛋白的片斷或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人DJ-1蛋白產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的DJ-1蛋白結(jié)合的抗體，可以利用在原核細胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化DJ-1蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。
[0012]在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其他衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要能夠完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任何長度都可以。所述探針的長度可以短至25、20、15或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0013]人DJ-1蛋白是由DJ-1基因(Genebank N0.NM 007262.4)編碼而來，目前研究報道DJ-1在多種腫瘤性病變中異常表達，并可能參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但DJ-1蛋白能否作為骨肉瘤診斷的標記分子和治療靶點尚無研究報道。本發(fā)明實驗證明DJ-1蛋白在骨肉瘤組織中的表達明顯高于非腫瘤組織；且在骨肉瘤細胞中過表達(敲除)DJ-1蛋白可顯著降低(增加)骨肉瘤細胞對一線治療藥物的敏感性。因此，DJ-1蛋白可作為骨肉瘤診斷和治療的特異性標志蛋白， 提高骨肉瘤診斷的準確性和治療的有效性。本發(fā)明DJ-1蛋白為防治骨肉瘤提供了新的治療靶標和有效新藥。
[0014]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1是本發(fā)明通過免疫組化法驗證DJ-1在人骨肉瘤組織中的表達。
[0015]圖2是本發(fā)明通過免疫組化法檢測骨肉瘤中DJ-1蛋白水平。
[0016]圖3是采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在骨肉瘤細胞KHOS中過表達DJ-1蛋白后對體外骨肉瘤細胞藥物敏感性的影響。
[0017]圖4是采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在骨肉瘤細胞U20S中過表達DJ-1蛋白后對體外骨肉瘤細胞藥物敏感性的影響。
[0018]圖5是采用SiRNA特異性敲除骨肉瘤細胞KHOS中的DJ-1蛋白后對體外骨肉瘤細胞藥物敏感性的影響。
[0019]圖6是采用SiRNA特異性敲除骨肉瘤細胞U20S中的DJ-1蛋白后對體外骨肉瘤細胞藥物敏感性的影響。
【具體實施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0021]實施例1:
選取骨肉瘤臨床樣本51例，用10%甲醛溶液固定7天，隨后制備石蠟包埋的組織塊。將樣本制備厚度為8微米的石蠟切片，并采用免疫組化法檢測DJ-1蛋白(氨基酸序列如SEQID No:1所示)的表達情況，與此同時選取另一張切片進行H&E染色。在正置顯微鏡下觀察DJ-1蛋白的表達情況，以及H&E染色的情況。參見圖1，樣本癌組織中DJ-1蛋白的表達高于同一張片子中非腫瘤組織。
[0022]實施例2:
對前述實施例1中的51例骨肉瘤臨床樣本中DJ-1蛋白的表達情況進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)強陽性為24例，陽性為15例，弱陽性為7例，陰性為5例(圖2)。
[0023]在傳代培養(yǎng)的骨肉瘤細胞KHOS和U20S中分別轉(zhuǎn)染DJ-1基因(DJ-1組)，并設置空白對照(PCMV6組)。待轉(zhuǎn)染24小時后，分別給予順鉬、紫杉醇、阿霉素和甲氨蝶呤，檢測藥物對轉(zhuǎn)染細胞的生長抑制作用。參見圖3和圖4，過表達DJ-1基因后，骨肉瘤細胞KHOS和U20S對藥物敏感性顯著降低。
[0024]實施例4:
在傳代培養(yǎng)的骨肉瘤細胞KHOS和U20S中分別采用SiRNA特異性敲除DJ-1基因(SiRNADJ-1組)，并設置空白對照(NC組)。待轉(zhuǎn)染24小時后，分別給予順鉬、紫杉醇、阿霉素和甲氨蝶呤，檢測藥物對細胞的生長抑制作用。參見圖5和圖6，敲除DJ-1基因后，骨肉瘤細胞KHOS和U20S對藥物敏感 性顯著增加。
【權(quán)利要求】
1.一種DJ-1蛋白在制備治療骨肉瘤的藥物中的應用，其特征在于，該DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.—種DJ-1蛋白在制備診斷骨肉瘤產(chǎn)品中的應用，其特征在于，該DJ-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括:用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DJ-1蛋白在制備診斷骨肉瘤產(chǎn)品中的應用，其特征在于，所述用免疫檢測診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括與DJ-1蛋白特異性結(jié)合的抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DJ-1蛋白在制備診斷骨肉瘤產(chǎn)品中的應用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴增DJ-1基因的引物:正向引物:5’ -AGACGGTCATCCCTGTAGAT-3’，反向引物:5’ -GCTCCTTCAGTATCTCCTTCAC-3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DJ-1蛋白在制備診斷骨肉瘤產(chǎn)品中的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一對特異性擴增DJ-1基因的引物:正向引物:5’ -AGCCGTGATGTGGTCATTT-3’，反向引物:5’ - GTCTTTAGCAAGAGGGTGTGT-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DJ-1蛋白在制備診斷骨肉瘤產(chǎn)品中的應用，其特征在于，所述用原位雜交診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括--與DJ-1基因的核酸序列雜交的探針:5’-TCATCCACATTACTGGAGGTAAGTAGT-3，。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DJ-1蛋白在制備診斷骨肉瘤產(chǎn)品中的應用，其特征在于，所述用基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括:與DJ-1基因的核酸序列雜交的探針:5’-ACTCGGTTGTCTCGTCATCCTGGACGT-3’。
【文檔編號】A61K38/17GK103585619SQ201310528113
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】楊波, 何俏軍, 曹戟, 謝楠, 張俊 申請人:浙江大學