本發(fā)明屬于植物病原檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種檢測(cè)日本毛刺線蟲的引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

毛刺線蟲是植物根際重要的植物寄生線蟲，寄生植物的根部，影響根系生長(zhǎng)，甚至造成根部生長(zhǎng)停滯，導(dǎo)致植物根系粗短。屬內(nèi)的許多種還是一些植物病毒的傳播介體，對(duì)許多經(jīng)濟(jì)作物如花卉、果樹等都造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，世界上許多國(guó)家地區(qū)均將此類線蟲列為禁止進(jìn)境的檢疫性有害生物。毛刺線蟲屬（傳毒種類）被列入國(guó)家質(zhì)檢總局頒布的《關(guān)于實(shí)施進(jìn)口羅漢松植物檢疫措施公告有關(guān)事項(xiàng)的通知》（國(guó)質(zhì)檢動(dòng)函〔2011〕88號(hào)）中進(jìn)口日本大型景觀植物重點(diǎn)關(guān)注的有害生物名單，屬于檢疫性有害生物。

日本毛刺線蟲（Trichodorus japonicus Zhao, Xie, Gu & Xu, 2013）已在日本千葉、鹿兒島、東京都的雞爪槭、山茶花、羅漢松、紫薇等寄主多次截獲，截獲的頻率高于雪松毛刺線蟲，屬于日本苗木根際線蟲的優(yōu)勢(shì)種群。近年來(lái)我國(guó)從日本進(jìn)口大量的種苗，日本毛刺線蟲傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)很高。日本毛刺線蟲是2013年從進(jìn)境植物根際發(fā)現(xiàn)的新種，具有潛在的傳毒能力。雪松毛刺線蟲一直被國(guó)際毛刺專家懷疑是復(fù)合種，趙立榮發(fā)現(xiàn)的日本毛刺線蟲就是該復(fù)合種中的隱種，并且很有可能文獻(xiàn)報(bào)道的日本分布的雪松毛刺線蟲大部分是日本毛刺線蟲。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，雪松毛刺線蟲引起日本的松樹等苗圃黃化、萎蔫等癥狀，嚴(yán)重影響苗圃的種植。所以，日本毛刺線蟲的危害應(yīng)引起關(guān)注。

日本毛刺線蟲與雪松毛刺線蟲形態(tài)難區(qū)分，兩者的區(qū)別主要在雌蟲（腹面觀）陰門形狀、交合傘的有無(wú)；陰門孔狀和橫裂的的形狀很難辨別，其形狀又受固定液、體態(tài)等因素影響；毛刺線蟲本身體壁松弛，小小的交合傘更加難以辨認(rèn)。傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定日本毛刺線蟲要需要大量的蟲源，鑒定者具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，容易漏檢、錯(cuò)檢。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，線蟲檢測(cè)鑒定技術(shù)取得了重大突破，線蟲的系統(tǒng)分類不再僅僅依靠形態(tài)學(xué)特征等傳統(tǒng)的方法，已探索出許多線蟲種群分類鑒定的分子診斷方法，利用分子技術(shù)探索不同種群的rDNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS區(qū)）和rDNA 28S D2/D3區(qū)序列特征已成為近年來(lái)線蟲分子診斷的研究熱點(diǎn)。ITS區(qū)序列是一個(gè)多用途的遺傳標(biāo)記，位于和核糖體基因的重復(fù)簇之間，中間被核糖體基因分開。研究ITS 區(qū)域有很多優(yōu)勢(shì)，尤其是在樣品較少而其它方法不能正確地鑒定線蟲時(shí)，分析ITS區(qū)域的序列，可以更有效地鑒定和分辨更多的農(nóng)業(yè)重要線蟲種或近緣種。

目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)基于日本毛刺線蟲的的ITS區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物檢測(cè)日本毛刺線蟲的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有日本毛刺線蟲檢測(cè)技術(shù)的缺陷和不足，以及因日本毛刺線蟲是雪松毛刺線蟲復(fù)合種中的隱種，形態(tài)難以區(qū)分的問(wèn)題，提供一種可以特異性檢測(cè)日本毛刺線蟲，區(qū)分日本毛刺線蟲和雪松毛刺線蟲的引物組。

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)日本毛刺線蟲的引物組。

本發(fā)明另一目的是提供上述檢測(cè)日本毛刺線蟲的引物組的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種檢測(cè)日本毛刺線蟲的引物組，所述引物組包括上游引物TjF和下游引物TjR，序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示（PCR擴(kuò)增片斷大小為400bp）。

上述檢測(cè)日本毛刺線蟲的引物組在檢測(cè)日本毛刺線蟲方面的應(yīng)用，以及在鑒定區(qū)分日本毛刺線蟲和雪松毛刺線蟲方面的應(yīng)用，也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種特異性檢測(cè)日本毛刺線蟲的方法，是以待測(cè)樣品DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果判斷樣品中是否日本毛刺線蟲，判斷標(biāo)準(zhǔn)是：當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性的400bp條帶時(shí)，表明待測(cè)樣品DNA中含有日本毛刺線蟲DNA。

其中，優(yōu)選地，所述PCR的反應(yīng)體系為： PCR反應(yīng)緩沖液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH₂O 補(bǔ)齊，總體積25μL。

優(yōu)選地，所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min； 98℃10s， 50℃15s，68℃1.5min，40個(gè)循環(huán)；16℃保溫。

另外，進(jìn)一步優(yōu)選地，還需要在PCR反應(yīng)體系中加入引物D2A和D3B，即所述PCR的反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)緩沖液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，引物D2A和D3B各0.5~0.75μL，模板DNA 2μL，ddH₂O補(bǔ)齊，總體積25μL；其中，引物D2A和D3B的序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

此時(shí)，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)兩條特異性的400bp和800bp條帶時(shí)，表明待測(cè)樣品DNA中含有日本毛刺線蟲DNA；如果擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有出現(xiàn)800bp條帶，表明待測(cè)樣品DNA有問(wèn)題。

一種檢測(cè)日本毛刺線蟲的試劑盒，包含有上述的上游引物TjF和下游引物TjR。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包含有PCR擴(kuò)增所需的PCR反應(yīng)緩沖液和DNA聚合酶。

優(yōu)選地，所述試劑盒的使用方法為：以待測(cè)樣品的DNA為模板，利用上游引物TjF和下游引物TjR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果判斷樣品中是否日本毛刺線蟲，判斷標(biāo)準(zhǔn)是：當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性的400bp條帶時(shí)，表明待測(cè)樣品DNA中含有日本毛刺線蟲DNA。

優(yōu)選地，所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min； 98℃10s， 50℃15s，68℃1.5min，40個(gè)循環(huán)；16℃保溫。

優(yōu)選地，所述PCR的反應(yīng)體系為： PCR反應(yīng)緩沖液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH₂O 補(bǔ)齊，總體積25μL。

另外，更優(yōu)選地，還需要在PCR反應(yīng)體系中加入引物D2A和D3B，即所述PCR的反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)緩沖液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，引物D2A和D3B各0.5~0.75μL，模板DNA 2μL，ddH₂O補(bǔ)齊，總體積25μL；其中，引物D2A和D3B的序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

此時(shí)，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)兩條特異性的400bp和800bp條帶時(shí)，表明待測(cè)樣品DNA中含有日本毛刺線蟲DNA；如果擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有出現(xiàn)800bp條帶，表明待測(cè)樣品DNA有問(wèn)題。

而應(yīng)用于鑒別區(qū)分日本毛刺線蟲與雪松毛刺線蟲時(shí)，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性的400bp擴(kuò)增條帶時(shí)為日本毛刺線蟲，無(wú)400bp擴(kuò)增條帶時(shí)為雪松毛刺線蟲。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種特異性檢測(cè)鑒定日本毛刺線蟲的PCR引物組，可以特異性地鑒定區(qū)分日本毛刺線蟲與雪松毛刺線蟲，特異性更好，不需要測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)快速鑒定。

而且，該引物組的PCR擴(kuò)增片段大小為400bp，靈敏度高，容易擴(kuò)增，對(duì)于日本毛刺線蟲的檢測(cè)以及日本毛刺線蟲和雪松毛刺線蟲的鑒定區(qū)分方面，具有很好的推廣應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為PCR特異性檢測(cè)結(jié)果電泳圖，其中，M為Marker 2000，泳道1-10分別為Tj-1、Tj-2、Tj3、Tj4、Tc-1、Tc-2、Tc-3、P、Pp、陰性對(duì)照。

圖2為靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其中M為Marker 2000，泳道1-6分別為稀釋0倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍的DNA、陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1 引物設(shè)計(jì)和PCR體系構(gòu)建

1、引物設(shè)計(jì)

針對(duì)設(shè)計(jì)日本毛刺線蟲的檢測(cè)引物，經(jīng)過(guò)了大量的篩選和研究，最終得到引物組TjF/TjR，在ITS2片段的392-412位置。

上游引物TjF和下游引物TjR（ITS2區(qū)引物）的序列如下所示：

SEQ ID NO.1（上游引物TjF）：5'-ATCGATGAAGAACGCAGC-3'

SEQ ID NO.2（下游引物TjR）：5'-tacaacgttgagcgaacgaag-3'

該引物對(duì)的PCR擴(kuò)增片段大小為400bp，以日本毛刺線蟲DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，電泳片斷符合預(yù)期。

2、經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化篩選，利用上述引物對(duì)擴(kuò)增日本毛刺線蟲DNA的PCR條件如下：

（1）PCR體系：PCR反應(yīng)緩沖液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，引物D2A和D3B各0.5~0.75μL，模板DNA 2μL，ddH₂O補(bǔ)齊，總體積25μL。

其中，引物D2A和D3B（D2D3區(qū)引物）是所有毛刺線蟲的通用檢測(cè)引物，序列如下：

SEQ ID NO.3（上游引物D2A）：5'-acaagtaccgtgagggaaagttg-3',

SEQ ID NO.4（下游引物D3B）：5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'?。

（2）PCR程序如下：98℃2min； 98℃10s， 50℃15s，68℃1.5min，40個(gè)循環(huán)；16℃保溫。

擴(kuò)增結(jié)果顯示4種引物均為0.5μL，PCR保存4年的DNA模板沒(méi)問(wèn)題，兩條帶都能擴(kuò)增。但是PCR保存5年的DNA模板只能擴(kuò)增400bp短片段，不能擴(kuò)增800bp的D2D3片段，當(dāng)增加D2A、D3B引物時(shí)就能擴(kuò)增兩條帶。因此，當(dāng)待測(cè)樣品DNA模板保存時(shí)間在4年以內(nèi)時(shí)，四條引物均使用0.5μL即可；當(dāng)待測(cè)樣品DNA模板保存時(shí)間大于4年時(shí)，需將引物D2A和D3B的量增加至0.75μL。

當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)兩條特異性的400bp和800bp條帶時(shí)，表明待測(cè)樣品DNA沒(méi)有問(wèn)題，且其中含有日本毛刺線蟲DNA。如果擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有出現(xiàn)800bp條帶，表明待測(cè)樣品DNA本身有問(wèn)題，需要重新提樣進(jìn)行檢測(cè)。

實(shí)施例2 日本毛刺線蟲與雪松毛刺線蟲的特異性檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)材料如表1所示

表1

2、抽提DNA

在200μL Eppendorf管中加入8μL預(yù)冷的PCR Buffer。在平玻片上滴20μL ddH₂O，挑入一條線蟲，用手術(shù)刀將線蟲切成2至多段，然后迅速吸取含盡量多的這些線蟲片段的懸浮液10μl，加入含有8μ L PCR Buffer液的Eppendorf管中，再向管中加入2μL預(yù)冷的1mg/mL蛋白酶K，使總體積為20μL。迅速將管放入-70℃冰箱至少10min，而后將Eppendorf管置于PCR儀中65℃恒溫60min，以降解DNase，接著95℃恒溫10min，以變性蛋白酶K，此時(shí)即可取此DNA懸浮液2μL直接做PCR或-20℃保存。

3、PCR檢測(cè)體系和程序如實(shí)施例1所述。PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓10V/cm，取PCR產(chǎn)物5μL上樣。電泳30min后，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

結(jié)果如附圖1所示，只有Tj-1、Tj-2、Tj-3、Tj-4四個(gè)日本毛刺線蟲樣品擴(kuò)增出了特異性的400bp（日本毛刺線蟲ITS2特異條帶）和800bp（所有毛刺線蟲D2D3片段）兩條帶。而其他線蟲樣品，包括雪松毛刺線蟲，均只有800bp一條擴(kuò)增條帶。

同時(shí)，上述結(jié)果也顯示了，本發(fā)明的上游引物TjF和下游引物TjR對(duì)日本毛刺線蟲的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1條線蟲的靈敏性。

實(shí)施例3 檢測(cè)靈敏度

1、按照實(shí)施例2的方法，提取一條日本毛刺線蟲樣品的DNA，進(jìn)行梯度稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，方法參照實(shí)施例2。

2、結(jié)果如附圖2所示，泳道1-6分別為稀釋0倍、10倍、100倍、1000倍、10000倍的DNA、陰性對(duì)照。

結(jié)果顯示，利用本發(fā)明的上游引物TjF和下游引物TjR，可以檢測(cè)到稀釋1000倍的DNA，即可以檢測(cè)到0.001條日本毛刺線蟲的DNA。

實(shí)施例4 日本毛刺線蟲檢測(cè)試劑盒

1、日本毛刺線蟲檢測(cè)試劑盒，包含有上述的上游引物TjF和下游引物TjR，以及PCR擴(kuò)增所需的PCR反應(yīng)緩沖液和DNA聚合酶。

更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述試劑盒還包含上述引物D2A和D3B。

2、所述試劑盒的使用方法為：以待測(cè)樣品的DNA為模板，利用上游引物TjF和下游引物TjR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果判斷樣品中是否日本毛刺線蟲，判斷標(biāo)準(zhǔn)是：當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性的400bp條帶時(shí)，表明待測(cè)樣品DNA中含有日本毛刺線蟲DNA。

所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min； 98℃10s， 50℃15s，68℃1.5min，40個(gè)循環(huán)；16℃保溫。

所述PCR的反應(yīng)體系為： PCR反應(yīng)緩沖液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，模板DNA 2μL，ddH₂O 補(bǔ)齊，總體積25μL。

另外，更進(jìn)一步地，還需要在PCR反應(yīng)體系中加入引物D2A和D3B，即所述PCR的反應(yīng)體系為：PCR反應(yīng)緩沖液12.5μL，DNA 聚合酶 0.5μL，上游引物TjF和下游引物TjR各0.5μL，引物D2A和D3B各0.5~0.75μL，模板DNA 2μL，ddH₂O補(bǔ)齊，總體積25μL。

此時(shí)，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物同時(shí)出現(xiàn)兩條特異性的400bp和800bp條帶時(shí)，表明待測(cè)樣品DNA中含有日本毛刺線蟲DNA；如果擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有出現(xiàn)800bp條帶，表明待測(cè)樣品DNA有問(wèn)題。

應(yīng)用于鑒別區(qū)分日本毛刺線蟲與雪松毛刺線蟲時(shí)，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)特異性的400bp擴(kuò)增條帶時(shí)為日本毛刺線蟲，無(wú)400bp擴(kuò)增條帶時(shí)為雪松毛刺線蟲。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心

<120> 一種檢測(cè)日本毛刺線蟲的引物組及其應(yīng)用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物TJF

<400> 1

atcgatgaag aacgcagc 18

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 下游引物TJR

<400> 2

tacaacgttg agcgaacgaa g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 上游引物D2A

<400> 3

acaagtaccg tgagggaaag ttg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物D3B

<400> 4

tcggaaggaa ccagctacta 20