在天然存在的DNA序列中給定位點處的核苷酸變化是分子生物學中公知的現(xiàn)象，其產(chǎn)生典型地由正常的或‘野生型’等位基因和一種或多種‘突變體’形式組成的多態(tài)形式。這種現(xiàn)象的常見實例(其中產(chǎn)生等位基因的變體是單一核苷酸)是單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點。迄今為止，在人基因組中已經(jīng)鑒定了五萬多種不同的SNPs，并且在多種情形中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與其有關的突變與個體發(fā)展某些疾病的易感性強烈相關；與抗某些感染或不耐受某些藥物強烈相關。這些觀察結果相應導致醫(yī)學診斷領域顯著的發(fā)展；例如，目前可能通過檢測來自受試者的活組織樣品中存在或不存在一種或多種已知的相關突變體等位基因來篩查惡性癌細胞。然而，考慮到在自然中它們相對于野生型的低存在，此類突變體等位基因的檢測通常不是直接的。這可能導致通常是復雜的并且有信噪比問題的檢測方法。因此，仍然存在提高此類篩查方法以及作為它們的基礎的檢測方法的速度、準確性和可靠性的需求。

目前在本領域中使用或者已經(jīng)提議了多種檢測遺傳物質(zhì)中的SNPs的方法。一種涉及對討論的整個等位基因測序，但顯然是昂貴并且非常費時的。另一種涉及使用連接酶鏈式反應擴增等位基因(例如，參見BioTechniques(2004)37(3)pp.392-398)。在限制性片段長度多態(tài)性方法中，將DNA分析物用多種能夠僅在已知發(fā)生SNP的位點處切割多核苷酸鏈的位點特異性限制性內(nèi)切核酸酶處理。然而，通過分析這樣產(chǎn)生的寡核苷酸片段的長度和性質(zhì)，可以推測存在或不存在SNP。然而，該方法具有需要多個費時的分離步驟的缺點。其還受到可得到的內(nèi)切核酸酶的范圍的限制。在另一種方法中，將DNA分析物用一對等位基因特異性的探針處理；例如，用一對各自具有不同的相聯(lián)熒光團的分子信標(molecular beacon)處理。在這種方法中，使分析物與其互補探針退火并雜交，在此過程中引起后者發(fā)出其特征性的熒光。然而，這種方法具有信噪比問題，并且，尤其當突變體等位基因相對于野生型在分析物中的出現(xiàn)頻率非常低時，具有假陽性的可能性。

在該第二種方法的改進中，通過包括在檢測攜帶突變體等位基因的DNA之前，使用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增該攜帶突變體等位基因的DNA的步驟解決信噪比問題。例如，在Genome Res.2001年1月，11(1)第163-169頁和BioTechniques(2003)34第1068-1072頁中，已經(jīng)證明可以使用五種成分的系統(tǒng)擴增并檢測其中存在突變體等位基因的多核苷酸，所述五種成分的系統(tǒng)包括：(1)兩種等位基因-特異性的引物和一種反向引物，用于擴增兩種不同的多態(tài)性，和(2)兩種不同標記的分子信標，它們適合于選擇性地與所產(chǎn)生的兩種類型的擴增子中的一種或另一種雜交。

US 5487972教導了一種使用標記的核苷酸檢測靶核酸的方法，所述方法利用核酸聚合酶的5’到3’核酸酶活性切割來自雜交的雙鏈體的退火的、標記的寡核苷酸，并由此釋放標記的寡核苷酸片段進行檢測。在第28欄，其提到使用包含熒光團和猝滅劑二者的探針。然而，所述的方法涉及使用特定的標記的探針檢測已知序列的核酸靶標，而不是使用一對探針一起在多態(tài)性位點之間進行區(qū)分。

Molecular Biology 513 19-39(2009)中的Appleby方法提供了用于確定植物中的單核苷酸多態(tài)性的多種方法的綜述。然而，沒有公開我們所研發(fā)了利用等位基因選擇性猝滅探針系統(tǒng)(allele selective quenched probes systems)的特定方法。

EP1602733、WO 97/45559和WO2013/009175公開了其他的核酸檢測方法，包括涉及探針連接然后使用聚合酶鏈式反應進行擴增的那些方法。

現(xiàn)在，我們已經(jīng)開發(fā)了不依賴于使用PCR擴增的可靠地鑒定在給定的核苷酸多態(tài)性位點處的變體的替代方法。我們的發(fā)明的一個特征在于其使用連接酶以高準確度區(qū)分等位基因。因此，按照本發(fā)明的第一方面，提供一種用于表征包含特征為核苷酸多態(tài)性位點的一種或多種多核苷酸類型的DNA分析物的方法，每種所述多核苷酸類型包含具有式-X-Y-Z-的靶標區(qū)，其中X和Z分別是第一和第二特征性側翼寡核苷酸區(qū)，并且Y是組成所述位點的變體中的一種，所述方法特征在于下述步驟：(a)在連接酶的存在下，使包含來源于至少一種所述多核苷酸類型的靶標區(qū)的單鏈寡核苷酸與未使用的探針組反應，所述未使用的探針組包含：(i)一種單鏈第一適體，所述單鏈第一適體在其3’端以與–X或–X-Y的序列互補的序列終止，和(ii)一種或多種第二單鏈適體，所述第二單鏈適體在其5’端以與–Z-Y或–Z(當情形可能如此時)的序列互補的序列終止，并且用處在不可檢測狀態(tài)的可檢測元件標記，從而產(chǎn)生包含所述寡核苷酸、第一適體、和第二適體中的一種的雙鏈的使用的探針；(b)使用外切核酸酶或表現(xiàn)出雙鏈外切核酸酶活性的聚合酶將所述使用的探針在3’至5’方向完全或部分消化成其組成的單一核苷酸，它們中的至少一種包含現(xiàn)在處于可檢測狀態(tài)的可檢測元件，并且(c)然后檢測與現(xiàn)在可檢測元件相關的檢測特性，由此鑒定Y變體的性質(zhì)。

另外，按照該方法的鏡像版本和本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于表征包含特征為核苷酸多態(tài)性位點的一種或多種多核苷酸類型的DNA分析物的方法，每種所述多核苷酸類型包含具有式-X-Y-Z-的靶標區(qū)，其中X和Z分別是第一和第二特征性側翼寡核苷酸區(qū)，并且Y是組成該位點的變體中的一種，所述方法特征在于下述步驟：(a)在連接酶的存在下，使包含來源于至少一種所述多核苷酸類型的靶標區(qū)的單鏈寡核苷酸與未使用的探針組反應，所述未使用的探針組包含：(i)一種或多種單鏈第一適體，所述單鏈第一適體在其3’端以與–X或–X-Y的序列互補的序列終止并且用處在不可檢測狀態(tài)的可檢測元件標記，和(ii)一種第二單鏈適體，所述第二單鏈適體在其5’端以與–Z-Y或–Z(當情形可能如此時)的序列互補的序列終止，從而產(chǎn)生包含所述寡核苷酸、第一適體中的一種和第二適體的雙鏈的使用的探針；(b)使用外切核酸酶或表現(xiàn)出雙鏈外切核酸酶活性的聚合酶將所述使用的探針在5’至3’方向完全或部分消化成其組成的單一核苷酸，它們中的至少一種包含現(xiàn)在處于可檢測狀態(tài)的可檢測元件，并且(c)然后檢測與現(xiàn)在可檢測元件相關的檢測特性，由此鑒定Y變體的性質(zhì)。

本發(fā)明的方法可以應用于從生物來源獲得的任意DNA分析物。例如，DNA可以來源于微生物、病毒、植物或動物；尤其是人和其他哺乳動物。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述分析物來源于人來源，諸如那些在日常醫(yī)學實踐中常規(guī)收集的樣本，諸如組織的活組織檢查、血液樣品、皮膚、毛發(fā)、尿和痰。在一個實施方案中，所述DNA分析物包含血液樣品中發(fā)現(xiàn)的游離的DNA。在任意需要的純化和預處理(例如，細胞裂解)之后，該分析物將包含已知或懷疑包含核酸多態(tài)性位點的原始DNA片段的形式的多核苷酸。換言之，那么目的多核苷酸將是那些僅區(qū)別在它們是包含野生型還是突變體等位基因的多核苷酸類型。

在本發(fā)明的一個方面中，多核苷酸中的多態(tài)性位點將是已知與遺傳病癥或癌癥相關的位點，以致突變體等位基因的存在將是所述疾病存在或發(fā)展所述疾病的傾向性的指征。在另一方面，該突變體等位基因的存在將與癌細胞的存在相關或提示癌細胞的存在，這允許將所述方法用于患者篩查目的。在另一方面，所述多核苷酸將來源于病毒或微生物的DNA，并且突變體等位基因的存在將表示親本生物體對一種或多種藥物或疫苗的抗性或易感性。在另一方面，突變體等位基因的存在將提供關于疾病流行病學的深入了解。在一個優(yōu)選的實施方案中，多核苷酸中的多態(tài)性位點將是一種或多種SNP，并且所述多核苷酸由兩種多核苷酸型組成，所述兩種多核苷酸型分別對應于關于每個SNP的野生型核苷酸或突變體核苷酸的存在。

通過本發(fā)明的方法表征的多核苷酸類型適當?shù)匕?X-Y-Z-的靶標區(qū)，其中X和Z分別是第一和第二特征性側翼寡核苷酸區(qū)，并且Y是產(chǎn)生多態(tài)性的變體中的一種。通常來說，從之前的測序研究已知側翼區(qū)–X-和-Z-的核苷酸序列。為了該方法的目的，這兩個區(qū)域長度大于兩個核苷酸；優(yōu)選地是2-50個核苷酸，最優(yōu)選地是6-50個核苷酸長。

在所述方法的一個實施方案中，包含該靶標區(qū)的單鏈寡核苷酸通過變性來源于其對應的雙鏈多核苷酸。用于實施所述變性的方法在本領域中是公知的，并且可以包括將所述多核苷酸加熱至其解鏈溫度。

在它們的未使用狀態(tài)(即，直到通過選擇性進行與多核苷酸的反應‘使用’給定的探針)，在本發(fā)明的方法的步驟(a)中使用的探針組包含一對單鏈適體類型。術語‘適體’用在本文中意指可以與上文提及的多核苷酸分子中的一種結合的單鏈的核酸分子。在上述第一種方法中，第一適體類型是在其3’端以與–X或–X-Y的序列互補的序列終止的適體類型。在第一種方法中，該適體類型未被標記；在第二種方法中，其被標記。該適體類型的功能是與多態(tài)性位點的3’側的寡核苷酸雜交。在一個實施方案中，一種或多種第一適體多至100個核苷酸長，優(yōu)選10-50個，最優(yōu)選10-20個核苷酸長。在另一個實施方案中，其僅由與–X或–X-Y互補的序列組成。在第一種方法的一個優(yōu)選的實施方案中，位于或接近第一適體的3’端的核苷酸中的至少一個進一步特征在于包含抗核酸外切降解的區(qū)域。例如，這可以通過修飾最后的核苷酸、優(yōu)選最后兩個核苷酸之間的連接使其包含抗性基團(諸如硫代磷酸酯)替代常規(guī)的磷酸二酯而實現(xiàn)。由此，硫代磷酸酯連接以兩種異構形式存在；本發(fā)明的一個實施方案包括僅使用這兩個形式中的更抗降解的那個。

關于第二適體類型，這是在其5’端以與–Z或–Z-Y的序列互補的序列終止的適體。在第一種方法中，第二適體類型被標記；在第二種方法中，其未被標記。這些適體的功能是與多態(tài)性位點的5’側的寡核苷酸雜交。在一個實施方案中，第二適體適當?shù)囟嘀?00個核苷酸長，優(yōu)選10-50個，最優(yōu)選10-20個核苷酸長。在另一個實施方案中，其僅由與–Z或–Z-Y互補的序列組成。在第二種方法的一個優(yōu)選的實施方案中，位于或接近第二適體的5’端的核苷酸中的至少一個進一步特征在于包含抗核酸外切降解的區(qū)域。例如，這也可以通過修飾最后的核苷酸、優(yōu)選最后兩個核苷酸之間的連接使其包含抗性基團(諸如硫代磷酸酯)替代常規(guī)的磷酸二酯而實現(xiàn)。

在第一和第二種方法的一個實施方案中，所述未使用的探針將由作為第一適體和上文定義的相關類型的第二適體的兩種成分組成，其中Y對應于組成多態(tài)性位點的等位基因中的一種。然而，在更優(yōu)選的實施方案中，所述未使用的探針將包含三種成分：(a)在第一種方法的情形中，第一適體和一對第二適體類型，所述一對第二適體類型對應于組成多態(tài)性位點的兩個不同的Y變體，或(b)一對第一適體類型和第二適體(在第二種方法的情形中)，所述一對第一適體類型對應于分析物上組成多態(tài)性位點的兩個不同的Y變體。在這一情形中，所述成對的第一和第二適體類型(當情形可能如此時)用下文討論的兩種不同類型的可檢測元件標記；具體地，用在不同頻率下發(fā)熒光的兩種不同的熒光團標記。最后，在兩種方法中，考慮未使用的探針類型的混合物可以用于同時鑒定多個多態(tài)性位點；例如，在來源于兩種以上表現(xiàn)出不同多態(tài)性的多核苷酸的寡核苷酸的混合物中。

原則上，可檢測元件本身可以包含具有可以容易地被檢測或測量的特征性檢測特性的任意元件。它們也布置在第一和第二適體類型(當情形可能如此時)上，以使與相同數(shù)量的可檢測元件與相應數(shù)量的游離單核苷酸結合相比，它們相關的可檢測特性較不可檢測。

在一個優(yōu)選的實施方案中，可檢測元件包含布置的熒光團，以使在步驟(b)中消化之前，第二適體和使用的探針在那些設計以檢測所述熒光團的典型的波長基本上不發(fā)出熒光。因此，盡管熒光團可以在寬的電磁譜部分表現(xiàn)出一般的、低水平的背景熒光，但是通常將存在一種或少量的特定波長或波長封套(wavelength envelope)(在此處，這種熒光的強度最大)。處在或接近這些最大值中的一個或多個，基本上沒有熒光應該發(fā)生。在本發(fā)明的情形中，術語‘基本上沒有熒光’或等價的詞語意指在相關的特征性波長或波長封套由連接到給定的適體類型或使用的探針上的熒光團總數(shù)得到的熒光的強度小于相當述量的游離熒光團的相對應的熒光強度的25％；優(yōu)選小于10％；更優(yōu)選小于1％，并且最優(yōu)選小于0.1％。

原則上，可以使用任何方法來確保在探針的未使用狀態(tài)，熒光團發(fā)出的熒光低于當分別結合到它們自身的游離單一核苷酸時的熒光。一種方法是另外在與其鄰近處連接猝滅劑。另一種方法是基于這樣的觀察：當多種熒光團彼此緊密鄰近連接到同一種探針上時，它們傾向于彼此充分地猝滅，由此可以實現(xiàn)前段所述的標準而無需猝滅劑。在本專利的情形中，什么組成熒光團之間或熒光團與猝滅劑之間的‘緊密鄰近’取決于所用的特定的熒光團和猝滅劑以及可能地所述寡核苷酸的結構特征。因此，意欲參考需要的結果來解釋該術語，而不是在第二適體上的任意特定的結構步驟。然而，并且僅為了提供示例的目的，指出當鄰近的熒光團或鄰近的熒光團和猝滅劑通過對應于它們的特征性距離(典型地小于5nm)分開時，將獲得充分的猝滅。

優(yōu)選地，每種第一或第二適體(當情形可能如此時)用多至20個、優(yōu)選多至10個且最優(yōu)選多至5個熒光團標記。為了獲得最大的優(yōu)點，優(yōu)選地，將其用至少2個、優(yōu)選至少3個熒光團標記。因此，特別考慮由這些最大值和最小值的任意排列構成的范圍并且因此在本文中公開。如果使用猝滅劑，其同樣優(yōu)選第一或第二適體用多至20個、優(yōu)選多至10個且最優(yōu)選多至5個猝滅劑標記。

關于熒光團本身，它們原則上可以選自本領域常規(guī)使用的那些中的任一種，包括，但不限于，呫噸結構部分，例如，熒光素，羅丹明及其衍生物，諸如異硫氰酸熒光素、羅丹明B等；香豆素結構部分(例如，羥基-、甲基-和氨基香豆素)和花菁結構部分，諸如Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。具體的實例包括來源于下述常用的染料的熒光團：Alexa染料，花菁染料，Atto Tec染料，和羅丹明染料。實例還包括：Atto 633(ATTO-TEC GmbH)，Texas Red，Atto 740(ATTO-TEC GmbH)，Rose Bengal，Alexa Fluor^TM 750 C₅-馬來酰亞胺(Invitrogen)，Alexa Fluor^TM532 C₂-馬來酰亞胺(Invitrogen)和羅丹明紅(Rhodamine Red)C₂-馬來酰亞胺和羅丹明綠(Rhodamine Green)以及亞磷酰胺染料(phosphoramadite dyes)，諸如Quasar 570。備選地，可以使用量子點或近紅外染料，諸如由LI-COR Biosciences供應的那些。典型地使用本領域已知的化學方法經(jīng)由核苷酸堿基將熒光團連接到第一或第二適體上。

適當?shù)拟鐒┦峭ㄟ^共振能轉(zhuǎn)移(FRET)機制起作用的那些猝滅劑?？梢耘c上文提及的熒光團連接使用的可商購的猝滅劑的非限制性的實例包括，但不限于，DDQ-1，Dabcyl，Eclipse，Iowa Black FQ和RQ，IR Dye–QC1，BHQ-1、-2和-3以及QSY-7和-21。

在本發(fā)明的方法中所用的第一和第二適體原則上可以通過本領域已知的任一種核苷酸組裝方法制備，所述方法包括H-膦酸酯法、磷酸二酯合成、磷酸三酯合成和亞磷酸三酯合成。優(yōu)選的是基于它們的反應性使用核苷酸亞磷酰胺結構單元。在這些方法中，通過以包括去封閉、偶聯(lián)、加帽和氧化的循環(huán)四步方法在5’位置向生長的核苷酸鏈上順序添加所選的核苷酸亞磷酰胺而發(fā)生合成。該方法的循環(huán)性質(zhì)使得其特別適合自動化，并且進行該方法的機器容易在市場上得到。

步驟(a)適當?shù)赝ㄟ^在10-100℃的范圍、優(yōu)選在10-60℃的范圍的溫度和在連接酶的存在下使寡核苷酸、第一和第二適體反應來進行?？梢允褂贸Ｒ?guī)用于本領域的這種類型的那些酶中的任一種實例。連接酶優(yōu)選是熱穩(wěn)定的連接酶。在一個實施方案中，步驟(a)產(chǎn)生的使用的探針將是雙鏈體的形式，其在核酸外切活性起始的位點具有單鏈突出端區(qū)域。

在步驟(b)中，通過外切核酸酶的作用或聚合酶的外切核酸酶活性(其可以以3’到5’(第一種方法)或5’到3’方向(第二種方法)起作用)從使用的探針釋放單一核苷酸一磷酸酯，其至少一種包括處在可檢測狀態(tài)的可檢測元件。這樣進行時，重要的是，在任意未使用的標記的適體中存在的可檢測元件不是同時釋放。在該步驟中使用的外切核酸酶或等價物因此應該是具有雙鏈外切核酸酶活性的外切核酸酶或等價物，從而，由于使用的探針比未使用的探針更長并且因此具有更高的解鏈溫度的事實，只有使用的探針可以被消化。

步驟(b)還適當?shù)卦?0-100℃的范圍、優(yōu)選30-100℃、更優(yōu)選50-100℃、甚至更優(yōu)選60-100℃的范圍、并且最優(yōu)選在使用的探針和任意退火但不反應的產(chǎn)物的解鏈溫度之間的溫度進行。在一個實施方案中，步驟(b)在50-90℃的范圍、優(yōu)選50-85℃的范圍進行。可以用在該步驟中的外切核酸酶或聚合酶的實例包括KOD、KOD HS、KOD Xstreme Hot Start、Q5、Q5Hot Start、Phusion、Phusion HS、DNA酶I(不含RNA酶)、外切核酸酶I或III(大腸桿菌外切核酸酶(ex E.coli))、外切核酸酶T、外切核酸酶V(RecBCD)、λ外切核酸酶、微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease)、綠豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)、核酸酶BAL-31、RecJ_f、T5外切核酸酶和T7外切核酸酶。優(yōu)選地，用于該步驟的外切核酸酶或聚合酶是熱啟動的外切核酸酶或聚合酶，從而，在該步驟發(fā)生之前，已經(jīng)與靶寡核苷酸退火但是還沒有連接到第一適體上的任意第二適體變性。步驟(b)的一種凈效應是釋放用可檢測元件標記的游離的單一核苷酸一磷酸酯的級聯(lián)，其中可以測量特征性的檢測特性。因此，當使用的探針包含多種猝滅的熒光團時，這導致用熒光團標記的單一核苷酸的‘級聯(lián)’，由于它們彼此和/或與任意相聯(lián)的猝滅劑分開，現(xiàn)在它們是游離的，以正常的方式發(fā)熒光。因此，觀察者觀察到熒光信號隨時間的增加。

假定用于本發(fā)明的方法中的第一和第二適體(當情形可能如此時)僅針對一種等位基因類型是選擇性的，則普通技術人員將容易理解，僅當反應介質(zhì)中存在包含標記的適體類型選擇性針對的特定的Y等位基因的寡核苷酸時，可檢測元件將被釋放。這使得本發(fā)明的方法特別適合可靠地檢測較少的等位基因。

在所述方法的一個優(yōu)選的實施方案中，連續(xù)進行步驟(b)，直到使用的探針與第一和第二適體成分相聯(lián)的整條鏈的核酸外切降解完成，或者優(yōu)選地，如果另一種適體被設計為抗外切核酸水解(見上文)，它與標記的適體相聯(lián)的部分的核酸外切降解結束。然后，可以發(fā)生剛標記的適體的連接，從而單獨的步驟(a)或步驟(a)和(b)可以成為循環(huán)的，每次循環(huán)導致游離的熒光團的進一步釋放。以這種方式，即使在反應介質(zhì)中僅存在低水平的或單分子的攜帶相關等位基因的寡核苷酸，也可以獲得強烈的特征性信號。

此后，并且在步驟(c)中，檢測與單一核苷酸上的可檢測元件相關的檢測特性。進行此的方法在本領域中是公知的；例如，可以使用刺激輻射源(例如，激光器)和光檢測器或調(diào)諧到多種熒光團的特征性熒光波長或波長封套的等效裝置來檢測熒光。這相應引起光檢測器產(chǎn)生所述變體并且因此存在的特定等位基因所特有的電信號。

在本發(fā)明的第三方面，上文定義的方法完全或部分以小滴進行；適當?shù)匾晕⒌芜M行。這種方法的優(yōu)點在于其允許計數(shù)個體靶分子數(shù)，并且因此檢測非常低的拷貝數(shù)并得到準確的等位基因比率。在本發(fā)明的第三方面的方法中，則步驟(c)優(yōu)選地包括依次檢驗每個小滴，從而鑒定釋放的可檢測元件，并且因此鑒定與初始多核苷酸類型關聯(lián)的等位基因的性質(zhì)。

適當?shù)?，所用的微滴具有小?00微米的直徑，優(yōu)選小于50微米，更優(yōu)選小于20微米，甚至更優(yōu)選小于15微米的直徑。它們所有的直徑中最優(yōu)選的是在2-20微米的范圍內(nèi)。例如，所述方法的微滴版本可以在微流體芯片上進行。

現(xiàn)在將通過下述實施例舉例說明本發(fā)明的方法。

總述

為了這些實施例的目的，制備包含下述成分的反應混合物：

1等分部分的緩沖液；

10nM每種探針適體；

1nM靶分子；

80U Taq連接酶；

0.8U Phusion II外切核酸酶

在該實驗中，等分部分的緩沖液包含：

40mM Trizma鹽酸鹽，pH 8.0；

2.75mM MgCl₂；

100mM KCl；

0.5mM DTT(二硫蘇糖醇)；

400uM NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)；

0.01％吐溫-20(表面活性劑)

所用的探針成分包含下述適體：

5′-TCGTGCCTCATCGAACATG*A-3′(第一適體)

5′-PCGAGGFFQFFGGTTTGTGGT-3′(第二適體)

其中*是硫代磷酸酯連接，F(xiàn)是Atto-655標記的胸腺嘧啶堿基，Q是BHQ-2標記的胸腺嘧啶堿基，并且P是5’磷酸。

還制備了下述單鏈寡核苷酸，其表示特征為自5’端第26個核苷酸處的SNP的一對等位基因：

5′-GTAGGTCCCACAAACCAAAAACCTCGTCATGTTCGATGAGGCACGATAA-3′(G等位基因)

5′-GTAGGTCCCACAAACCAAAAACCTCTTCATGTTCGATGAGGCACGATAA-3′(T等位基因)

由于對應于第二適體5’端的單個核苷酸錯配，選擇這兩種適體以完全的互補性與G等位基因退火，而不與T等位基因退火。

實施例1

將包含作為靶分子的G等位基因的反應混合物用多個50℃的溫度循環(huán)溫育30分鐘，然后在70℃的15分鐘。在每個循環(huán)結束時，測量用氦-氖激光器刺激后Atto-655熒光團在629nm發(fā)射的熒光，并將結果圖示在圖1中(實線–‘沒有錯配’)。

實施例2

使用T等位基因作為靶分子重復實施例1。結果圖示在圖1中(虛線–‘錯配’)。

關于G等位基因而非T等位基因的熒光信號的增長表示探針的選擇性，并且說明了本發(fā)明的方法可靠地區(qū)分它們的基礎。

序列表

<110> 貝斯4創(chuàng)新公司

<120> 核苷酸多態(tài)性檢測方法

<130> P60761WO

<150> EP14170832.1

<151> 2014-06-02

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一適體

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> 硫代磷酸酯連接

<400> 1

tcgtgcctca tcgaacatga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二適體

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> 5'磷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(7)

<223> Atto-655標記的胸腺嘧啶堿基

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> BHQ-2標記的胸腺嘧啶堿基

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(10)

<223> Atto-655標記的胸腺嘧啶堿基

<400> 2

cgaggttttt ggtttgtggt 20

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> G等位基因 – 單鏈寡核苷酸，在5'端第26個核苷酸處的SNP

<220>

<221> 等位基因

<222> (26)..(26)

<223> SNP

<400> 3

gtaggtccca caaaccaaaa acctcgtcat gttcgatgag gcacgataa 49

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> T等位基因 – 單鏈寡核苷酸，在5'端第26個核苷酸處的SNP

<220>

<221> 等位基因

<222> (26)..(26)

<223> SNP

<400> 4

gtaggtccca caaaccaaaa acctcttcat gttcgatgag gcacgataa 49