本發(fā)明涉及用于診斷、預(yù)防或治療宮頸癌(cervical cancer)的作為宮頸癌的標(biāo)記蛋白的輔肌動(dòng)蛋白-4(actinin-4)的制藥用途。
背景技術(shù):
上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)是指,上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成間葉細(xì)胞的過(guò)程。亦即,該轉(zhuǎn)化過(guò)程是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有間葉細(xì)胞的特性的變化過(guò)程,已知這是在個(gè)體形成發(fā)育中的重要一環(huán)。此外,根據(jù)最近要就結(jié)果,發(fā)現(xiàn)該過(guò)程與癌細(xì)胞的進(jìn)程(progression)、侵襲(invasion)、轉(zhuǎn)移(metastasis)等有著聯(lián)系。
已知,作為細(xì)胞骨架蛋白(cytoskeletal protein)的輔肌動(dòng)蛋白-4不僅在幾種癌細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)度表達(dá),還會(huì)參與對(duì)細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)的誘導(dǎo)。然而,至今并未證明在宮頸癌中作為標(biāo)記蛋白的輔肌動(dòng)蛋白-4的作用。
因此,本發(fā)明的發(fā)明人是通過(guò)查明多種癌細(xì)胞內(nèi)的輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)水平、在宮頸癌細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)度表達(dá)的輔肌動(dòng)蛋白-4的AKT-Snail信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中所起的作用、細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲以及腫瘤的形成,來(lái)完成了本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明在于,通過(guò)查明作為標(biāo)記蛋白的輔肌動(dòng)蛋白-4的作用來(lái)提供用于診斷、預(yù)防或治療宮頸癌的輔肌動(dòng)蛋白-4的制藥用途。
技術(shù)方案
為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo),本發(fā)明提供宮頸癌診斷用組合物,該組合物包含用于測(cè)定輔肌動(dòng)蛋白-4基因的mRNA或其蛋白質(zhì)水平的制劑。
此外,本發(fā)明提供包含輔肌動(dòng)蛋白-4抑制劑的用于預(yù)防或治療宮頸癌的藥物組合物。
此外,本發(fā)明提供輔肌動(dòng)蛋白-4抑制劑在制備用于預(yù)防或治療宮頸癌的藥物組合物中的用途。
此外,本發(fā)明提供一種治療宮頸癌的方法,其包括:將制藥有效劑量的包含輔肌動(dòng)蛋白-4抑制劑的用于預(yù)防或治療宮頸癌的藥物組合物向?qū)m頸癌患者進(jìn)行給藥的步驟。
此外,本發(fā)明用于預(yù)防或治療宮頸癌的醫(yī)學(xué)篩查方法,該方法包括:將輔肌動(dòng)蛋白-4基因與候選物質(zhì)在體外進(jìn)行接觸,然后判斷所述候選物質(zhì)促進(jìn)或抑制所述基因的表達(dá)。
此外,本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療宮頸癌的篩查方法,該方法包括:將輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)與候選物質(zhì)在體外進(jìn)行接觸,然后判斷所述候選物質(zhì)增強(qiáng)或抑制所述蛋白的功能或活性。
有益效果
本發(fā)明的效果在于,通過(guò)抑制表達(dá)于宮頸癌并參與細(xì)胞的增值、遷移和侵襲以及腫瘤的形成的輔肌動(dòng)蛋白-4來(lái)抑制腫瘤的形成,從而通過(guò)輔肌動(dòng)蛋白-4抑制劑來(lái)應(yīng)用于宮頸癌的診斷、預(yù)防或治療中。
附圖說(shuō)明
圖1展示了各種癌細(xì)胞(前列腺癌:LNCaP、DU145、PC3/乳腺癌:MCF-7、T47D、MDA-MB-231/肺癌:A549、H460/大腸癌:HCT116/肝癌:HepG2/宮頸癌:HeLa)中的輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)量的對(duì)比(A)和宮頸癌系HeLa、SiHa和ME-180細(xì)胞中的輔肌動(dòng)蛋白-4和上皮鈣黏蛋白的表達(dá)圖譜(B)。
圖2展示了在宮頸癌細(xì)胞SiHa細(xì)胞中根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4過(guò)表達(dá)和表達(dá)抑制的AKT-Snail信號(hào)機(jī)制的確認(rèn)結(jié)果(A)和根據(jù)Snail結(jié)合位點(diǎn)的存在與否的上皮鈣黏蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(B和C)。
圖3展示了在宮頸癌細(xì)胞HeLa、SiHa細(xì)胞中輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞和ME-180過(guò)表達(dá)細(xì)胞的制備及其上皮鈣黏蛋白、Snail表達(dá)或細(xì)胞表型的對(duì)比結(jié)果。
圖4展示了宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa細(xì)胞中的根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)的細(xì)胞遷移性。圖5展示了宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa細(xì)胞中的輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞中的遷移性(A)和侵襲性(B)。
圖6為輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞培養(yǎng)基中的遷移性、侵襲性(A)和細(xì)胞增殖(B)的結(jié)果。
圖7為根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)的β-連環(huán)蛋白的表達(dá)增加(A)和輔肌動(dòng)蛋白-4的β-連環(huán)蛋白分解抑制及穩(wěn)定化(B和C)的確認(rèn)結(jié)果。
圖8為根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)的β-連環(huán)蛋白的蛋白酶體分解抑制(A)和β-連環(huán)蛋白的靶細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄活性增加(B)的確認(rèn)結(jié)果。
圖9為根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制的集落形成減少(A和B)及根據(jù)過(guò)表達(dá)的集落形成增加(C)的確認(rèn)結(jié)果。
圖10為比較根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制的細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖11為輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞中的通過(guò)PI染色分析的細(xì)胞增殖抑制的確認(rèn)結(jié)果。
圖12為注射有輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞的小鼠中根據(jù)時(shí)間的腫瘤形成(A)和形成有癌的小鼠的照片(B)。
圖13為注射有輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞的小鼠中提取的癌(A)、癌大小和重量(B)及注射癌細(xì)胞后的小鼠體重(C)的對(duì)比結(jié)果。
具體實(shí)施方式
下面,具體說(shuō)明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明涉及用于診斷宮頸癌的組合物,該組合物包含用于測(cè)定輔肌動(dòng)蛋白-4基因的mRNA及其蛋白質(zhì)水平的制劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例,輔肌動(dòng)蛋白-4在作為宮頸癌細(xì)胞的HeLa細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)(圖1A),通過(guò)利用宮頸癌細(xì)胞系的HeLa、SiHa和ME-180細(xì)胞來(lái)比較輔肌動(dòng)蛋白-4與上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)量,其結(jié)果,HeLa細(xì)胞中的輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)量更多,而ME-180細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)輔肌動(dòng)蛋白-4。反之,輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)較少的ME-180細(xì)胞中有表達(dá)很多的上皮鈣黏蛋白(圖1B)。
此外,隨著輔肌動(dòng)蛋白-4的增加,顯示出AKT活性化的增加和轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)的增加,但抑制輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)會(huì)帶來(lái)AKT活性化的降低,且還降低Snail的表達(dá)(圖2A)。經(jīng)過(guò)確認(rèn),Snail是通過(guò)與上皮鈣黏蛋白的啟動(dòng)子結(jié)合來(lái)抑制自身的表達(dá),從而通過(guò)測(cè)定上皮鈣黏蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,輔肌動(dòng)蛋白-4會(huì)增加宮頸癌細(xì)胞內(nèi)的Snail,進(jìn)行調(diào)節(jié)上皮鈣黏蛋白的表達(dá)(圖2)。
由于輔肌動(dòng)蛋白-4是相繼HeLa、SiHa、ME-180之后表達(dá)得少,通過(guò)在HeLa和SiHa細(xì)胞中設(shè)計(jì)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞且在幾乎沒(méi)有輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)的ME-180細(xì)胞中設(shè)計(jì)過(guò)表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果確認(rèn),作為輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞的HeLa和SiHa細(xì)胞內(nèi)的Snail表達(dá)會(huì)降低,而上皮鈣黏蛋白反而增加(圖3)。對(duì)HeLa細(xì)胞而言,并不是能表達(dá)表達(dá)上皮鈣黏蛋白的細(xì)胞,即使抑制輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá),也不能使所述HeLa細(xì)胞增加。這相關(guān)于輔肌動(dòng)蛋白-4通過(guò)Snail的表達(dá)來(lái)調(diào)整上皮鈣黏蛋白的表達(dá),可見(jiàn)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)其他各種因子能夠抑制上皮鈣黏蛋白的表達(dá)。此外,其中過(guò)表達(dá)有輔肌動(dòng)蛋白-4的ME-180細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了上皮鈣黏蛋白有減少的模式。經(jīng)過(guò)確認(rèn)這些細(xì)胞的細(xì)胞表型,其結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)從表達(dá)抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化成EMT的相反表型,即MET表型,也就是說(shuō)轉(zhuǎn)化成細(xì)胞-細(xì)胞之間相結(jié)合的表型(圖3的下部)。
此外,經(jīng)過(guò)確認(rèn)通過(guò)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)的細(xì)胞遷移的增加,其結(jié)果顯示,輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)能使宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移增加(圖4)。遷移和侵襲是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中的極其重要的過(guò)程之一,因此為了確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)是否參與癌細(xì)胞的遷移和侵襲而進(jìn)行Trans-well遷移和基質(zhì)膠侵襲,其結(jié)果顯示對(duì)從表達(dá)抑制細(xì)胞中所獲取的培養(yǎng)基而言相比于對(duì)照組培養(yǎng)基細(xì)胞遷移有減少(圖6A)。為了確認(rèn)這種遷移的減少是否由于細(xì)胞增殖所引起的,通過(guò)利用相同培養(yǎng)基進(jìn)行MTT分析,結(jié)果顯示各培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞增殖沒(méi)有出現(xiàn)變化(圖6B)。由此可見(jiàn),輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)是通過(guò)AKT-Snail-MMP-9增加或AKT-snail-上皮鈣黏蛋白抑制的機(jī)制來(lái)起到增加細(xì)胞的EMT和遷移的作用的重要的癌標(biāo)記蛋白。
此外,在作為輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)細(xì)胞的MDCK細(xì)胞中,β-連環(huán)蛋白的表達(dá)在增加,且作為β-連環(huán)蛋白的靶蛋白的波形蛋白(Vimentine)也在增加(圖7A)。β-連環(huán)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖,其通過(guò)與參與細(xì)胞之間結(jié)合的上皮鈣黏蛋白進(jìn)行結(jié)合而存在,然而上皮鈣黏蛋白的減少會(huì)導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的減少。然而,在本發(fā)明的輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi),即使上皮鈣黏蛋白的表達(dá)受到抑制而消失,β-連環(huán)蛋白的表達(dá)卻有增加。由此判斷,輔肌動(dòng)蛋白-4的增加會(huì)影響β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定,經(jīng)過(guò)確認(rèn)當(dāng)利用siRNA來(lái)減少上皮鈣黏蛋白的表達(dá)時(shí)輔肌動(dòng)蛋白-4是否能抑制β-連環(huán)蛋白的分解,結(jié)果顯示,通過(guò)輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)能抑制隨著上皮鈣黏蛋白的減少而減少的β-連環(huán)蛋白(圖7B)。此外,通過(guò)利用作為翻譯抑制劑的環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)進(jìn)行處理,來(lái)抑制蛋白質(zhì)的合成,經(jīng)過(guò)確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4能否抑制β-連環(huán)蛋白隨著時(shí)間的分解,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)輔肌動(dòng)蛋白-4進(jìn)行過(guò)表達(dá)時(shí),與對(duì)照組(mock)相比更會(huì)推遲β-連環(huán)蛋白的分解,且作為β-連環(huán)蛋白的靶蛋白的c-myc也能推遲減少(圖7C)。細(xì)胞內(nèi)的β-連環(huán)蛋白的分解是因蛋白酶體(proteosome)而出現(xiàn)的現(xiàn)象,為了確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4是否能抑制通過(guò)蛋白酶體分解的β-連環(huán)蛋白分解來(lái)誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定,通過(guò)處理作為蛋白酶體抑制劑的ALLN來(lái)確認(rèn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)輔肌動(dòng)蛋白-4進(jìn)行過(guò)表達(dá)時(shí),通過(guò)抑制β-連環(huán)蛋白的蛋白酶體分解來(lái)使β-連環(huán)蛋白更佳穩(wěn)定,進(jìn)而增加β-連環(huán)蛋白的量(圖8A)。此外,經(jīng)過(guò)確認(rèn)作為β-連環(huán)蛋白的靶蛋白的細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1的轉(zhuǎn)錄活性,結(jié)果顯示所述轉(zhuǎn)錄活性會(huì)根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)濃度而增加(圖8B)。β-連環(huán)蛋白及作為β-連環(huán)蛋白的靶蛋白的細(xì)胞周期蛋白D1的增加可以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,從而判斷輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)會(huì)參與細(xì)胞增殖,進(jìn)行通過(guò)利用集落(colony)形成分析來(lái)確認(rèn)細(xì)胞增殖,結(jié)果顯示作為輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞的HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞會(huì)抑制集落的形成(圖9A和9B),與此相反,在有輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)的ME-180細(xì)胞內(nèi)集落的形成有增加(圖9C)。由此認(rèn)為,輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)是通過(guò)增加細(xì)胞增殖來(lái)誘導(dǎo)癌的形成。在輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞內(nèi),通過(guò)集落形成分析來(lái)確認(rèn)了細(xì)胞增殖在減少。為了確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng),通過(guò)MTT分析來(lái)確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4的少量表達(dá)是否影響細(xì)胞增殖,分析結(jié)果顯示HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)均比對(duì)照組有減少(圖10)。如圖11所示,根據(jù)用于確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的PI染色分析,HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞內(nèi)的S期輔肌動(dòng)蛋白-4過(guò)表達(dá)細(xì)胞的所占比例有降低。根據(jù)上述結(jié)果,可以判斷輔肌動(dòng)蛋白-4能起到促進(jìn)被誘導(dǎo)為癌的細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用。這在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也得到了證明,即將輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)受到抑制的SiHa細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)并確認(rèn)腫瘤形成,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞內(nèi)癌的形成有受到抑制(圖12A),腫瘤大小也比對(duì)照組小(圖12B)。此外,經(jīng)過(guò)比較從注射有輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞的小鼠中摘除的腫瘤的結(jié)果發(fā)現(xiàn),腫瘤大小比對(duì)照組要小(圖13A),癌的大小和重量也明顯減少(圖13B)。
因此,輔肌動(dòng)蛋白-4可被用作用于診斷宮頸癌的生物標(biāo)記。
術(shù)語(yǔ)“診斷”是對(duì)病理狀態(tài)的判斷,根據(jù)本發(fā)明的目的,所述診斷是指通過(guò)確認(rèn)等進(jìn)行區(qū)分并診斷的物質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“診斷用標(biāo)記(diagnosis marker)”是指,能將宮頸癌細(xì)胞與正常細(xì)胞加以區(qū)分并診斷的物質(zhì),包括如在宮頸癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞顯示增加或減少的多肽或核酸(如mRNA等)、脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白、糖(單糖、二塘、寡糖等)等的有機(jī)生物分子等。在本發(fā)明中所提供的宮頸癌診斷用標(biāo)記是,比起正常細(xì)胞,在宮頸癌的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量有增加的輔肌動(dòng)蛋白-4基因中所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的用于診斷宮頸癌的組合物包含用于測(cè)定輔肌動(dòng)蛋白-4基因的mRNA的表達(dá)水平或從所述基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的量的制劑,所述制劑為與輔肌動(dòng)蛋白-4mRNA形成互補(bǔ)序列的寡核苷酸,包括如與輔肌動(dòng)蛋白-4特異性結(jié)合的引物(primer)或核酸探針、或輔肌動(dòng)蛋白-4特異性抗體。
所述引物是指,在適當(dāng)溫度和適當(dāng)緩沖液內(nèi),在適當(dāng)?shù)臈l件(4種不同的核苷三磷酸和聚合酶)下,可作為模板-指示DNA合成的起始點(diǎn)的單鏈寡核苷酸(oligonucleotide)。引物的適當(dāng)長(zhǎng)度可根據(jù)各種因素如溫度、引物用途等而有所不同。此外,引物的序列無(wú)需具有與模板的部分序列完全互補(bǔ)的序列,只要在與模板雜交時(shí)能夠發(fā)揮出引物固有的作用的范圍內(nèi)具有充分的互補(bǔ)性即可。因此,本發(fā)明的引物的序列無(wú)需與作為模板的基因的核苷酸序列完全互補(bǔ),而是與所述基因雜交時(shí)能夠發(fā)揮出引物固有的作用的范圍內(nèi)具有充分的互補(bǔ)性即可。此外,優(yōu)選地,本發(fā)明的引物可用于基因擴(kuò)增反應(yīng)。所述擴(kuò)增反應(yīng)是指用于擴(kuò)增核酸分子的反應(yīng),而這些基因的擴(kuò)增反應(yīng)已知曉于本領(lǐng)域的技術(shù)人員,例如,包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、核酸依賴性擴(kuò)增(NASBA)等。
所述核酸探針是指天然或經(jīng)過(guò)變形的探針或鏈的線型寡聚體,包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸,與靶核苷酸序列進(jìn)行特異性雜交,可以是存天然的或人工合成的。本發(fā)明的探針可以為單鏈,優(yōu)選為寡脫氧核糖核苷酸。本發(fā)明的探針可包括天然dNMP(即dAMP、dGMP、dCMP和dTMP)、核苷酸類似物或衍生物。此外,本發(fā)明的探針可包括核糖核苷酸。例如,本發(fā)明的探針可包括:經(jīng)骨架修飾的核苷酸,如肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯DNA、二硫代磷酸酯DNA、磷酸酰胺DNA、酰胺鏈接的DNA、MMI鏈接的DNA、2'-O-甲基RNA、α-DNA和甲基膦酸酯DNA;經(jīng)糖修飾的核苷酸,例如,2'-O-甲基RNA、2-氟基RNA、2'-氨基RNA、2'-O-烷基DNA、2'-O-烷基DNA、2'-O-烯丙基DNA、2'-O-炔烴DNA、己糖DNA、pyranosylRNA和失水己糖醇DNA;和經(jīng)堿基修飾的核苷酸,例如,C-5取代的嘧啶(取代基包括氟基、溴基、氯基、碘仿基、甲基、乙基、乙烯基、甲?;?、丙醛基、炔基、噻唑基、咪唑基、吡啶基)、具有C-7取代基的7-脫氮嘌呤(取代基包括氟基、溴基、氯基、碘仿基、甲基、乙基、乙烯基、甲酰基、炔基、烯基、噻唑基、咪唑基、吡啶基)、肌苷(Inosine)和二氨基嘌呤。
所述輔肌動(dòng)蛋白-4的特異性抗體可以使用多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體和人源化抗體。
所述抗體片段的例子,包括:Fab,Fab',F(ab')2和Fv片段;雙抗體;線型片段(Zapata etal.,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995));單鏈抗體分子;及由抗體片段所組成的多特異性抗體等。
將抗體通過(guò)木瓜蛋白酶切斷后可獲得兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段,也就是說(shuō),生成具有單價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)的"Fab"片段和剩余的"Fc"片段。通過(guò)處理胃蛋白酶,可生成具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)并仍可與抗原進(jìn)行交叉結(jié)合的F(ab')2片段。Fv片段為包含完整的抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。所述位點(diǎn)是由一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈的可變區(qū)的二聚體組成并通過(guò)非共價(jià)鍵進(jìn)行堅(jiān)固的結(jié)合。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知曉多克隆抗體的制備方法。多克隆抗體可通過(guò)向哺乳動(dòng)物注射一次或以上的免疫化劑來(lái)制備,根據(jù)需要,可通過(guò)與免疫增強(qiáng)劑一起注射進(jìn)行制備。通常,免疫化劑和(或)免疫增強(qiáng)劑是向哺乳動(dòng)物通過(guò)皮下注射或腹腔內(nèi)注射來(lái)進(jìn)行數(shù)次注射。免疫化劑可以為本發(fā)明的蛋白質(zhì)或利用該蛋白質(zhì)的融合蛋白。為了有效性,可向被免疫化的哺乳動(dòng)物同時(shí)注射公知的具有免疫原性的蛋白質(zhì)和所訴免疫化劑。
根據(jù)本發(fā)明的,單克隆抗體是通過(guò)利用文獻(xiàn)(Kohler et al.,Nature,256:495(1975))中記載的雜交瘤方法來(lái)制備,或通過(guò)利用重組DNA重組方法(例如,參考美國(guó)專利第4,816,576號(hào))。此外,單克隆抗體是,例如,通過(guò)文獻(xiàn)(Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991))中記載的技術(shù)來(lái)從噬菌體抗體庫(kù)中分離出的。
具體地,本發(fā)明的單克隆抗體包括,基于欲獲得的活性的重鏈和(或)輕鏈的部分為源自特定種類的抗體,或與屬于特定抗體類別或亞類別的抗體的相應(yīng)序列相同或雖具有同源性、但鏈中的其他部分源自其他種類的抗體屬于其他抗體類別或亞類別的抗體或與該抗體的片段相同或具有同源性的“嵌合(chimeric)”抗體(Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
非人(例如,如鼠的動(dòng)物)抗體的“人源化”形態(tài)為,包含誘導(dǎo)自非人免疫球蛋白(Immunoglobulin)的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如,F(xiàn)ab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結(jié)合序列)。通常,人源化抗體包括由具有需要受體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基的特異性、親和性和能力的的小鼠、老鼠或兔子等除人之外的種類(供者抗體)的CDR殘基所取代的人免疫球蛋白(受體抗體)。在一些情況下,人免疫球蛋白的Fv框架殘基會(huì)被相應(yīng)的非人殘基所取代。此外,人源化抗體包括受體抗體、或被導(dǎo)入的CDR或框架序列中未被發(fā)現(xiàn)的殘基。通常,人源化抗體實(shí)質(zhì)上包含一個(gè)或以上,一般為兩個(gè)或以上的可變區(qū),其中所有的或?qū)嵸|(zhì)上所有的CDR區(qū)與非人免疫球蛋白區(qū)相對(duì)應(yīng),而所有的或?qū)嵸|(zhì)上所有的FR區(qū)與人免疫球蛋白區(qū)相對(duì)應(yīng)。此外,人源化抗體包括免疫球蛋白不變區(qū)(Fc)中的至少一部分,一般包括人免疫球蛋白區(qū)的部分(Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))。
本發(fā)明的宮頸癌診斷用組合物可被包含為套件形式。
所述套件包括用于測(cè)定輔肌動(dòng)蛋白-4基因的表達(dá)水平或蛋白質(zhì)的量的引物、探針或抗體,且它們的定義為如上所述。
當(dāng)所述套件在PCR擴(kuò)增過(guò)程中使用時(shí)可選擇性地包含所述PCR擴(kuò)增中所需要地試劑,例如,緩沖液、DNA聚合酶(例如,Thermus aquaticus(Taq),Thermus thermophilus(Tth),Thermusfiliformis,Thermis flavus,Thermococcus literalis或Pyrococcus furiosus(Pfu)中獲得具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶)、DNA聚合酶輔助因子和dNTPs,而當(dāng)所述套件使用于免疫分析時(shí),本發(fā)明的套件可選擇性地包含二抗和標(biāo)記的基質(zhì)。進(jìn)一步,本發(fā)明的套件可制備成包含所述試劑成分的多個(gè)另外的包裝或隔間。
此外,本發(fā)明的宮頸癌診斷用組合物可被包含為微陣列形式。
根據(jù)本發(fā)明的微陣列,用于測(cè)定所述輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)或?qū)υ摰鞍踪|(zhì)進(jìn)行編碼的基因的表達(dá)水平的引物、探針或抗體被用作雜交陣列元素(hybridizable array element)并固定于基質(zhì)(substrate)上。優(yōu)選地,所述基質(zhì)作為具有適合的堅(jiān)固性或半堅(jiān)固性的支撐體,例如,包括膜、過(guò)濾器、載玻片、晶片,纖維、磁性珠或非磁性珠、凝膠、管、板、聚合物、微粒和毛細(xì)血管。所述雜交陳列元素被排列在所述基質(zhì)上進(jìn)行固定,而這種固定是通過(guò)化學(xué)結(jié)合法或如UV的共價(jià)鍵結(jié)合方法來(lái)進(jìn)行的。例如,所述雜交陣列元素被結(jié)合在經(jīng)過(guò)修飾的玻璃表面,以包含環(huán)氧化合物或醛基。此外,通過(guò)UV結(jié)合在聚賴氨酸涂層表面。此外,所述雜交陣列要素是通過(guò)接頭(linker,如乙二醇低聚物和二胺)與基質(zhì)結(jié)合。
此外,當(dāng)適用于本發(fā)明的微陣列的樣本為核酸時(shí)可以進(jìn)行標(biāo)記,并與微陣列上的陣列要素進(jìn)行雜交。雜交條件可以多種多樣,雜交程度的檢測(cè)和分析可根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)而進(jìn)行實(shí)施。
此外,本發(fā)明通過(guò)所述輔肌動(dòng)蛋白-4基因的表達(dá)水平或其所表達(dá)的蛋白質(zhì)的水平的測(cè)定方法來(lái)診斷宮頸癌的方法,更具體地,所述方法包括:(1)從宮頸癌疑似患者的生物學(xué)樣本中測(cè)定輔肌動(dòng)蛋白-4基因的表達(dá)水平或其所表達(dá)的蛋白質(zhì)的量的步驟;和(2)通過(guò)從正常對(duì)照組樣本中測(cè)定所述基因的表達(dá)水平或其所表達(dá)的蛋白質(zhì)的量來(lái)與所述(1)步驟中的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較的步驟。
所述的基因的表達(dá)水平或蛋白的量的測(cè)定方法包括:通過(guò)利用公知技術(shù),從生物學(xué)樣本中分離mRNA或蛋白質(zhì)的公知過(guò)程。
所述生物學(xué)樣本是指,從活體采集的根據(jù)宮頸癌的發(fā)生或進(jìn)行程度的所述基因的表達(dá)水平或蛋白質(zhì)的水平與正常的對(duì)照組不同的樣本,例如,包括組織、細(xì)胞、血液、血清、唾液和尿液等,但不限于此。
優(yōu)選地,所述基因的表達(dá)水平的測(cè)定是測(cè)定mRNA的水平,且所述mRNA的水平的測(cè)定方法可以為反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、實(shí)時(shí)RT-PCR、RNA酶保護(hù)測(cè)定法、Northern印跡和DNA芯片等,但不限于此。
在測(cè)定所述蛋白質(zhì)水平時(shí)可以利用抗體,此時(shí),生物學(xué)樣本內(nèi)的所述輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)及其特異性抗體可以形成結(jié)合物,即抗原-抗體復(fù)合物,所述抗原-抗體復(fù)合物的合成量可通過(guò)檢測(cè)標(biāo)簽(detection label)的信號(hào)大小進(jìn)行定量測(cè)定。所述檢測(cè)標(biāo)簽可選自酶、熒光物質(zhì)、配體、發(fā)光物質(zhì)、微粒(microparticle)、氧化還原分子和放射性同位素,但不限于此。用于測(cè)定蛋白質(zhì)水平的方法可以為Western印跡、ELISA、放射免疫分析、放射免疫擴(kuò)散、免疫雙擴(kuò)散(Ouchterlony)、免疫火箭電泳、組織免疫染色、免疫沉淀分析、補(bǔ)體結(jié)合分析、FACS、蛋白質(zhì)芯片等,但不限于此。
因此,通過(guò)上述檢測(cè)方法,本發(fā)明可確認(rèn)作為對(duì)照組的mRNA表達(dá)量或蛋白質(zhì)的量和宮頸癌患者或疑似宮頸癌患者的mRNA表達(dá)量或蛋白質(zhì)的量,且通過(guò)將所述表達(dá)量的程度與對(duì)照組作比較,從而可以診斷宮頸癌的發(fā)病與否、發(fā)展階段等。
此外,通過(guò)上述檢測(cè)方法,本發(fā)明可確認(rèn)作為對(duì)照組的mRNA表達(dá)量或蛋白質(zhì)的量和宮頸癌患者或疑似宮頸癌患者中的mRNA表達(dá)量或蛋白質(zhì)的量,且通過(guò)將所述表達(dá)量的程度與對(duì)照組作比較,從而可以診斷宮頸癌的發(fā)病與否、發(fā)展階段等。
此外,根據(jù)本發(fā)明的宮頸癌的診斷方法,本發(fā)明的輔肌動(dòng)蛋白-4基因的表達(dá)水平或其表達(dá)蛋白質(zhì)的量比正常對(duì)照組樣本增加時(shí),可判斷宮頸癌被誘發(fā)。
此外,本發(fā)明涉及包含輔肌動(dòng)蛋白-4抑制劑的用于預(yù)防或治療宮頸癌的藥物組合物。
此外,本發(fā)明涉及輔肌動(dòng)蛋白-4抑制劑在制備用于預(yù)防或治療宮頸癌的藥物組合物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明,如上所述,輔肌動(dòng)蛋白-4是在宮頸癌細(xì)胞中進(jìn)行過(guò)表達(dá),輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)會(huì)通過(guò)AKT-Snail-MMP-9增加或AKT-snail-上皮鈣黏蛋白的抑制基質(zhì)來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的EMT或遷移并抑制參與細(xì)胞增殖的β-連環(huán)蛋白分解,從而推遲靶蛋白的c-myc減少,增加細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄活性,增加細(xì)胞增殖,來(lái)誘導(dǎo)癌的形成,然而,通過(guò)抑制輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá),會(huì)顯示MET表型,即細(xì)胞-細(xì)胞結(jié)合的表型,從而降低細(xì)胞的遷移和侵襲,降低細(xì)胞增殖,抑制動(dòng)物模型中的腫瘤形成,腫瘤大小也比對(duì)照組小。因此,輔肌動(dòng)蛋白-4的抑制劑可以用于宮頸癌的治療。
因此,本發(fā)明的用于預(yù)防或治療宮頸癌的組合物包含可減少輔肌動(dòng)蛋白-4基因的mRNA表達(dá)或其蛋白質(zhì)的表達(dá)、或降低蛋白質(zhì)的功能或活性的制劑。
所述輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)的抑制劑可以為通過(guò)與輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)分化路徑的信號(hào)的肽或化合物等。這種抑制劑可通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析等的如下所示的篩查方法來(lái)進(jìn)行選取,是通過(guò)本領(lǐng)域公知方法可進(jìn)行設(shè)計(jì)的。
此外,所述蛋白質(zhì)抑制劑可以使用輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)的多克隆抗體、單克隆抗體,人抗體和人源化抗體,所述抗體的定義如上所述。
通過(guò)利用所述抗體來(lái)抑制細(xì)胞內(nèi)輔肌動(dòng)蛋白-4的功能,從而預(yù)防或治療宮頸癌。
本發(fā)明的輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)的功能或活性抑制劑可以通過(guò)脂質(zhì)體、病毒、基因槍、聚合物、超聲波,電擊來(lái)進(jìn)行傳送,但不限于此。
所述輔肌動(dòng)蛋白-4基因可以為從編碼所述基因的DNA或從其中轉(zhuǎn)錄的mRNA。因此,所述基因的抑制劑是一種通過(guò)與基因本身結(jié)合來(lái)阻礙轉(zhuǎn)錄或與從所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)合來(lái)阻礙mRNA的翻譯的抑制劑。
因此,所述輔肌動(dòng)蛋白-4的抑制劑包括用于抑制輔肌動(dòng)蛋白-4基因的表達(dá)的所有抑制劑。例如,所述抑制劑可以為與所述基因集合的肽、核酸或化合物等。這種抑制劑是通過(guò)基于細(xì)胞的篩查等如下所述的篩查方法進(jìn)行選取,且根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
在一個(gè)具體實(shí)施例,所述抑制劑可以為輔肌動(dòng)蛋白-4基因的反義寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA或包含它們的載體。所述反義寡核苷酸、siRNA、miRNA或包含它們的載體是可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行制備。
在本發(fā)明中,“siRNA”為通過(guò)切斷靶基因的mRNA來(lái)誘導(dǎo)基因干擾現(xiàn)象的雙鏈RNA,由具有如靶基因的mRNA等的序列的正義序列的RNA鏈和具有與之互補(bǔ)的序列的反義序列的RNA鏈構(gòu)成。
所述siRNA可包括,將試管內(nèi)合成的siRNA本身或編碼siRNA的堿基序列插入到表達(dá)載體中來(lái)進(jìn)行表達(dá)的形態(tài)。
在本發(fā)明中,所述“載體(vector)”是指,包含被插入于用于編碼多肽的基因組內(nèi)的外源DNA的基因結(jié)構(gòu)。
與本發(fā)明相關(guān)的載體是將用于抑制所述基因的核酸序列插入到基因組內(nèi)的載體,例如有DNA載體、質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、酵母載體或病毒載體。
此外,所述反義可以具有與輔肌動(dòng)蛋白-4基因或其片段中轉(zhuǎn)錄的mRNA序列整體或部分之間互補(bǔ)的序列,通過(guò)與所述mRNA結(jié)合來(lái)抑制所述輔肌動(dòng)蛋白-4或其片段的表達(dá)。
此外,所述shRNAi(short hairpin RNAi)是將人或小鼠的shRNA重復(fù)序列部位作為靶并根據(jù)常用方法進(jìn)行制備。
此外,本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體。
所述藥學(xué)上可接受的載體包括在醫(yī)藥領(lǐng)域中通常使用的載體和賦形劑(vehicle),具體地包括離子交換樹(shù)脂、鎂、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(例如,人血清白蛋白)、還重物質(zhì)(如各種磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物)、水、堿或電解質(zhì)(如,硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉及鋅鹽)新、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮,纖維素基質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯乙二醇或羊毛蠟等,但不限于此。
此外,本發(fā)明的組合物可除了上述成分之外還可以添加潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、懸浮劑、或保存劑等。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施例,本發(fā)明的組合物可制成用于口服給藥的水溶性溶液,優(yōu)選地可以使用緩沖液,如Hank溶液、Ringer溶液或緩沖生理鹽水。在水溶性注入緩沖液中可以添加如羧甲基纖維素、山梨醇或葡聚糖等能提高懸浮液粘度的基質(zhì)。
本發(fā)明的組合物可通過(guò)全身或局部進(jìn)行給藥,可通過(guò)利用公知技術(shù)制備是大昂的劑型。例如,當(dāng)口服給藥時(shí),通過(guò)與沒(méi)有活性的稀釋劑或使用載體進(jìn)行混合,或通過(guò)封裝于硬膠明膠囊或軟明膠膠囊或制成片劑來(lái)進(jìn)行給藥。當(dāng)口服給藥時(shí),活性化合物與賦形劑進(jìn)行混合來(lái)制成攝取型片劑、頰部給藥片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿、薄片(wafer)等劑型。
根據(jù)本領(lǐng)域的公知方法或通用方法制備注射劑型、局部給藥劑型等的各種劑型。輔肌動(dòng)蛋白-4可易溶解于生理鹽水或緩沖液,因此保存在冷凍干燥狀態(tài)后,將有效劑量的輔肌動(dòng)蛋白-4適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行靜脈注射、皮下注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、經(jīng)皮注射等,在與生理鹽水或緩沖液內(nèi)投入之前先制成溶液再進(jìn)行給藥。
本發(fā)明的藥物組合物的活性成分的有效劑量是指,具有預(yù)防、抑制或緩解疾病的效果的量。
因此,根據(jù)疾病的種類、嚴(yán)重性、包含在組合物中的活性成分劑其他成分的種類劑含量、劑型的種類和患者的年齡、體重、通常的健康狀態(tài)、性別和飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑和組合物的分泌率、治療時(shí)間、同時(shí)使用的藥物等因素,進(jìn)行調(diào)節(jié)。然而,例如,對(duì)于成年人,當(dāng)給藥劑量為一天1次至幾次時(shí),本發(fā)明的抑制劑可以一天給藥1次至幾次,化合物可以給藥0.1ng/kg~10g/kg,多肽、蛋白質(zhì)或抗體可以給藥0.1ng/kg~10g/kg,反義寡核苷酸、siRNA、shRNAi、miRNA可以給藥0.01ng/kg~10g/kg,但不限于此。
此外,本發(fā)明提供用于治療宮頸癌的方法,該方法包括:將藥學(xué)有效劑量的包含輔肌動(dòng)蛋白-4抑制劑的用于預(yù)防或治療宮頸癌的藥物組合物向?qū)m頸癌受試者進(jìn)行給藥的步驟。
所述宮頸癌的治療方法中所使用的藥物組合物和給藥方法已在上面說(shuō)明,為了避免重復(fù)敘述,省略了兩者之間的共同內(nèi)容。
此外,用于預(yù)防或治療宮頸癌的藥物組合物的給藥受試者可以包括所有的動(dòng)物。例如,可以為狗、貓、小鼠等除了人之外的動(dòng)物。
此外,本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療宮頸癌的醫(yī)藥篩查方法,該方法包括:通過(guò)將輔肌動(dòng)蛋白-4基因與候選物質(zhì)在體外進(jìn)行接觸,來(lái)判斷所述候選物質(zhì)是否增強(qiáng)或抑制所述基因的表達(dá)。
此外,本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療宮頸癌的醫(yī)學(xué)篩查方法,該方法包括:通過(guò)將輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)與候選物質(zhì)在體外進(jìn)行接觸,來(lái)判斷所述候選物質(zhì)是否增強(qiáng)或抑制所述蛋白質(zhì)的功能或活性。
根據(jù)本發(fā)明的篩查方法,首先,將待分析的包含所述基因或蛋白質(zhì)的宮頸癌細(xì)胞與候選物質(zhì)進(jìn)行接觸。
所述候選物質(zhì)可以為,通過(guò)常用選取方式來(lái)在輔肌動(dòng)蛋白-4基因堿基序列中促進(jìn)或抑制向mRNA、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄、翻譯的物質(zhì),或能增強(qiáng)或抑制輔肌動(dòng)蛋白-4蛋白質(zhì)的功能或活性的被推定為具有作為醫(yī)藥可能性的或隨機(jī)選定的單獨(dú)的核酸、蛋白質(zhì)、肽、其他提取物或天然物質(zhì)、化合物等。
然后,經(jīng)過(guò)處理候選物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)測(cè)定所述基因的表達(dá)量、蛋白質(zhì)的量或蛋白質(zhì)的活性,根據(jù)測(cè)定結(jié)果來(lái)測(cè)定所述基因的表達(dá)量、蛋白質(zhì)的量或蛋白質(zhì)的活性的增加或減少程度,從而判斷所述候選物質(zhì)是否為用于治療或預(yù)防共計(jì)能改的物質(zhì)。
所述基因的表達(dá)量、蛋白質(zhì)的量或蛋白質(zhì)的活性的測(cè)定方法是根據(jù)本領(lǐng)域公知的各種方法進(jìn)行的,例如,逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)、實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)、Western印跡法、Northern印跡法、ELISA、放射免疫測(cè)定、徑向免疫擴(kuò)散法和免疫沉淀測(cè)定法等,但不限于此。
通過(guò)本發(fā)明的篩查方法獲得的展示能抑制基因表達(dá)或用于抑制蛋白質(zhì)功能的活性的候選物質(zhì)可以為宮頸癌治療劑的候選物質(zhì)。
所述宮頸癌治療劑的候選物質(zhì)可在日后的宮頸癌治療劑研發(fā)過(guò)程中起到主導(dǎo)化合物的作用,這種主導(dǎo)化合物可通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾并最優(yōu)化,以具有能促進(jìn)或抑制輔肌動(dòng)蛋白-4基因或從中表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能的效果,從而研發(fā)出新的宮頸癌治療劑。
在本發(fā)明中,為了清楚性,關(guān)于遺傳工程技術(shù)相關(guān)的內(nèi)容可參考文獻(xiàn)[Sambrook,et al.Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)]和文獻(xiàn)[Frederick M.Ausubel et al.,Current protocols in molecular biology volume 1,2,3,John Wiley&Sons,Inc.(1994)]中所公開(kāi)的內(nèi)容。
下面,根據(jù)實(shí)施例,具體說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)、以及實(shí)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)的方法。然而,本發(fā)明不限于以下公開(kāi)的實(shí)施例內(nèi),可以進(jìn)行各種變型。然而,本發(fā)明的實(shí)施例用于本發(fā)明的說(shuō)明完整,以讓本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)行完整的理解,本發(fā)明的范圍限定于權(quán)利要求書(shū)內(nèi)。
具體實(shí)施方式
下面,用于實(shí)驗(yàn)的試劑、培養(yǎng)基等的出處為如下所述。
從Invitrogen(Carlsbad,CA)中購(gòu)買(mǎi)獲得DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素、脂質(zhì)體2000試劑(Lipofectamine 2000reagent)。
抗-ACTN4抗體、抗-波形蛋白抗體、抗-N-鈣粘蛋白抗體、抗-β-肌動(dòng)蛋白抗體和抗-AKT1抗體是從Santa Cruz Biotechnology公司(Santa Cruz,CA)中購(gòu)得,抗-p-GSK3β抗體、抗-snail抗體及抗-p-AKT(S473)抗體是從Cell Signaling Technology中購(gòu)得,抗-上皮鈣黏蛋白、抗-β-連環(huán)蛋白抗體是從BD Biosceinces中購(gòu)得。單克隆抗體,即抗-Flag-M2抗體是從Aligent Technology中購(gòu)得。
sh-ACTN4質(zhì)粒是從Open-biosystem中購(gòu)得。
Tryphan blue和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)是從Sigma(St,Louis,MO)中購(gòu)得。
【實(shí)施例1】各種癌細(xì)胞中的輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)及宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)的比較
為了比較各種癌細(xì)胞中的輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)量,通過(guò)利用Western印跡來(lái)比較蛋白質(zhì)表達(dá)量。
為此,對(duì)作為普通細(xì)胞的人胚腎細(xì)胞(human embryonic kidney,HEK-293T),各種癌細(xì)胞(前列腺癌:LNCaP、DU145、PC3/乳腺癌:MCF-7、T47D、MDA-MB-231/肺癌:A549、H460/大腸癌:HCT116/肝癌:HepG2/宮頸癌:HeLa)中的輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)進(jìn)行了對(duì)比。使用30μg的各細(xì)胞的蛋白質(zhì)和10%SDS-PAGE凝膠。為了檢測(cè)各蛋白質(zhì),在暗室內(nèi)通過(guò)利用West Pico ECL(Thermo scientific,Rockford,IL)進(jìn)行確認(rèn)。微管蛋白(tubulin)抗體(SantaCruz)作為對(duì)照組,可用于確認(rèn)各細(xì)胞的蛋白質(zhì)是否以相同量進(jìn)行的對(duì)比,會(huì)以1:3000比例進(jìn)行處理。
如圖1A所示,與其他癌細(xì)胞相比,在宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了過(guò)量的輔肌動(dòng)蛋白-4。
基于上述結(jié)果,通過(guò)利用宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa和ME-180細(xì)胞來(lái)比較輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)量,并確認(rèn)根據(jù)表達(dá)量的上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)。
為此,從子宮癌細(xì)胞內(nèi)包含的三種子宮癌細(xì)胞(HeLa,SiHa,ME-180)中獲得的30μg蛋白質(zhì)通過(guò)利用Western印跡來(lái)比較了上皮鈣黏蛋白(BD Biosceinces)的蛋白質(zhì)表達(dá)量。使用1:5000比例的上皮鈣黏蛋白抗體。
如圖1B所示,HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較多的輔肌動(dòng)蛋白-4,而ME-180細(xì)胞內(nèi)幾乎沒(méi)有表達(dá)輔肌動(dòng)蛋白-4。反之,輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)較少的ME-180細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較多的上皮鈣黏蛋白。
上述結(jié)果是由根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4過(guò)表達(dá)的上皮鈣黏蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)引起的。
【實(shí)施例2】在宮頸癌細(xì)胞內(nèi)根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)的AKT-Snail信號(hào)機(jī)制及上皮鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)錄活性的研究
在現(xiàn)有研究報(bào)告中,已確認(rèn)MDCK細(xì)胞內(nèi)根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)的AKT-Snail信號(hào)機(jī)制。因此,欲確認(rèn)在宮頸癌細(xì)胞中是否也產(chǎn)生相同的機(jī)制。
為此,通過(guò)利用脂質(zhì)體2000(Invitrogen)來(lái)將flag-輔肌動(dòng)蛋白-4DNA(1μg)或sh-輔肌動(dòng)蛋白-4(1.5μg)轉(zhuǎn)染到SiHa細(xì)胞。使用比例為1:2的DNA和脂質(zhì)體2000,方法采用制造上的手冊(cè)。從Open-biosystem購(gòu)得sh-輔肌動(dòng)蛋白-4并使用。在相應(yīng)細(xì)胞中,通過(guò)利用RIPA裂解液(lysis buffer)來(lái)提取蛋白質(zhì)后,再通過(guò)Western印跡分別使用抗體(FLAG:Aligent Technology,p-AKT:Cell Signaling Technology,AKT:Santa Cruz,p-GSK3β,snail:Cell Signaling Technology和β-肌動(dòng)蛋白:Santa Cruz)來(lái)確認(rèn)30μg蛋白質(zhì)的表達(dá),且各抗體的使用比列為1:3000。
此外,在12孔板上接種HEK-293T細(xì)胞,每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞,然后同時(shí)將0.5μg上皮鈣黏蛋白啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)體(全長(zhǎng):-427~+53,Del-mutant:-78~+53)和Flag-ACTN4(0.5μg)或sh-ACTN4(0.5μg)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。缺失突變體(Deletion mutant)是在全長(zhǎng)啟動(dòng)子內(nèi)通過(guò)對(duì)包含snail結(jié)合位點(diǎn)的除-207~-194部分的-78~+53進(jìn)行克隆來(lái)制備的。對(duì)相應(yīng)的細(xì)胞用冰冷PBS進(jìn)行清洗并用reporter裂解液(Promega,Madison,WI)以每孔80來(lái)粉碎細(xì)胞,然后在4℃下10,000×g內(nèi)進(jìn)行離心分離10分鐘,取上清,測(cè)定熒光素酶的活性。使用Luminometer20/20n(Turner Biosystems,Sunnyvale,CA)。為了標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization),一起轉(zhuǎn)染pSV40-β-半乳糖苷酶(galactosidase)。通過(guò)對(duì)收集的上清測(cè)量β-半乳糖苷酶的活性并對(duì)該活性進(jìn)行矯正,來(lái)展示活性值的圖表。其中,使用β-半乳糖苷酶的酶分析系統(tǒng)(Promega,Madison,WI),并通過(guò)利用DU530分光光度計(jì)(Beckman Instruments,Palo Alto,CA)進(jìn)行分析。
如圖2A中所示,隨著輔肌動(dòng)蛋白-4的增加,顯示AKT的活性化有增加且Snail表達(dá)也有增加,而輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)的抑制會(huì)降低AKT的活性化且Snail表達(dá)也有降低。
轉(zhuǎn)錄因子Snail是與上皮鈣黏蛋白啟動(dòng)子相結(jié)合來(lái)起抑制上皮鈣黏蛋白表達(dá)的作用。因此,對(duì)包含Snail的結(jié)合位點(diǎn)或去除的兩種上皮鈣黏蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行測(cè)定結(jié)果,發(fā)現(xiàn)包含Snail的結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄活性有降低,而對(duì)于去除Snail的結(jié)合位點(diǎn)而言,轉(zhuǎn)錄活性沒(méi)有隨輔肌動(dòng)蛋白-4的存在與否而有變動(dòng)(圖2B)。此外,在抑制輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)時(shí),上皮鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)錄活性有增加(圖2C)。
由此結(jié)果可見(jiàn),輔肌動(dòng)蛋白-4是通過(guò)在宮頸癌細(xì)胞內(nèi)增加Snail來(lái)調(diào)節(jié)上皮鈣黏蛋白的表達(dá)。
【實(shí)施例3】宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa和ME-180細(xì)胞中根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞及過(guò)表達(dá)細(xì)胞制備的Snail和上皮鈣黏蛋白表達(dá)的圖譜研究
在實(shí)施例1中,輔肌動(dòng)蛋白-4是按HeLa、SiHa和ME-180這一順序其表達(dá)在減少。因此,HeLa和SiHa細(xì)胞中制備輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞,而在幾乎不表達(dá)輔肌動(dòng)蛋白-4的ME-180細(xì)胞中制備過(guò)表達(dá)細(xì)胞。
為了制備輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制穩(wěn)定化細(xì)胞,將shACTN4質(zhì)粒(1.5μg)轉(zhuǎn)染到HeLa和SiHa細(xì)胞后,用嘌呤霉素(puromycin)(2μg/mL)進(jìn)行選取2周。在相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)提取蛋白質(zhì)后,通過(guò)利用Western印跡,來(lái)確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4和Snail的蛋白質(zhì)表達(dá)量。此外,為了在ME-180細(xì)胞內(nèi)制備輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)穩(wěn)定化細(xì)胞,轉(zhuǎn)染Flag-ACTN4質(zhì)粒后,通過(guò)處理G-418(400μg/mL;Sigma)兩周,來(lái)進(jìn)行選取。為了確認(rèn)相應(yīng)細(xì)胞的表型(細(xì)胞的表現(xiàn)形式),通過(guò)顯微鏡進(jìn)行拍照(Zeiss Axiovert100;放大倍數(shù)×10)。
如圖3所示,在作為輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞的HeLa和SiHa細(xì)胞內(nèi),Snail表達(dá)有減少,上皮鈣黏蛋白反而有增加。HeLa細(xì)胞是不會(huì)表達(dá)上皮鈣黏蛋白的細(xì)胞,即使抑制輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)也不會(huì)有增加。想必這是因?yàn)?,輔肌動(dòng)蛋白-4會(huì)參與通過(guò)Snail表達(dá)的上皮鈣黏蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié),細(xì)胞內(nèi)其他各種因子的上皮鈣黏蛋白的表達(dá)抑制也在發(fā)生。
然后,有過(guò)表達(dá)輔肌動(dòng)蛋白-4的ME-180細(xì)胞中顯示了上皮鈣黏蛋白有減少的圖譜。在確認(rèn)細(xì)胞表型的結(jié)果,確認(rèn)了表達(dá)抑制細(xì)胞中表現(xiàn)形式轉(zhuǎn)變?yōu)镋MT的相反表型,即MET表型,也就是說(shuō)轉(zhuǎn)變成細(xì)胞-細(xì)胞間結(jié)合的表型(圖3下部)。
【實(shí)施例4】宮頸癌細(xì)胞中根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)的細(xì)胞遷移性的研究
為了確認(rèn)宮頸癌細(xì)胞內(nèi)根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)的細(xì)胞遷移性,進(jìn)行傷口愈合試驗(yàn)(wound healing assay)。
為了進(jìn)行傷口愈合試驗(yàn),在6孔板上分別接種各5×105的HeLa和SiHa細(xì)胞,轉(zhuǎn)染輔肌動(dòng)蛋白-4(1μg),然后利用200p tip來(lái)直線刮取細(xì)胞,來(lái)比較向去除細(xì)胞的位置上各表面的細(xì)胞的遷移程度(HeLa 24h,SiHa 48h)。
如圖4所示,輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)會(huì)增加細(xì)胞的遷移性。
遷移性和侵襲性對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)是極其重要的過(guò)程之一。因此,為了確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)是否影響癌細(xì)胞的遷移性和侵襲性,輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行Transwell遷移和基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)(matrigel invasion assay)。
為了測(cè)定細(xì)胞的遷移性,通過(guò)利用輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞(HeLa-KD,SiHa-KD)進(jìn)行Transwell遷移。在具有直徑為8μm的孔的Transwell小室(BD Biosciences)內(nèi)用膠原I(20μg)涂層1小時(shí)。然后,將HeLa細(xì)胞(對(duì)照組和KD細(xì)胞:3×105)和SiHa細(xì)胞(對(duì)照組和KD細(xì)胞:5×105)細(xì)胞接種于小室內(nèi),待36小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞從一面穿到另一面上的數(shù)量并用圖表顯示。
如圖5A顯示,輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞的遷移比對(duì)照組細(xì)胞有減少。
基質(zhì)膠侵襲分析是一種為了顯示癌組織的細(xì)胞遷移到其他活體器官時(shí)所需要的滲透至血管或組織的能力的實(shí)驗(yàn)。測(cè)量那些穿過(guò)基質(zhì)膠而向膜的相反方向遷移的細(xì)胞數(shù)量。
為此,在具有直徑為8μm的孔的Transwell小室(BD Biosciences)內(nèi)用基質(zhì)膠(2mg/mL,BD Biosciences)涂層1小時(shí)。然后,將HeLa細(xì)胞(對(duì)照組和KD細(xì)胞:5×105)和SiHa細(xì)胞(對(duì)照組和KD細(xì)胞:5×105)接種于小室板上,待36小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞從一面穿到另一面上的數(shù)量并用圖表顯示。
如圖5A顯示,輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞的遷移比對(duì)照組細(xì)胞有減少。
此外,
輔肌動(dòng)蛋白-4可通過(guò)Snail增加MMP-9的表達(dá),從而認(rèn)為從輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基也能抑制細(xì)胞的遷移性,因此通過(guò)利用從作為輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞的SiHa細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基來(lái)確認(rèn)通過(guò)Transwell遷移的細(xì)胞遷移性。
為此,用從輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞獲得的調(diào)整培養(yǎng)基(conditioned medium;CM)處理HeLa和SiHa細(xì)胞,通過(guò)Transwell遷移法測(cè)試細(xì)胞的移動(dòng)性(migration)。CM是如下獲得的:將抑制輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)的SiHa細(xì)胞接種于6孔板上(每孔5×105個(gè)細(xì)胞)后,處理無(wú)血清DMEM48小時(shí),然后收集其中的培養(yǎng)基,以500×g離心分離5分鐘,去除細(xì)胞并回收培養(yǎng)基。細(xì)胞遷移性實(shí)驗(yàn)方法與上述遷移性實(shí)驗(yàn)相同。
此外,為了確認(rèn)相應(yīng)的培養(yǎng)基(CM)是否影響細(xì)胞的生長(zhǎng),將各1×104數(shù)量的HeLa和SiHa細(xì)胞接種于96孔板上,然后用從SiHa-輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞中獲得的CM(對(duì)照組CM或ACTN4-KD CM)進(jìn)行處理,測(cè)定根據(jù)時(shí)間變化(0-48h)的細(xì)胞數(shù)并用圖表展示,分別重復(fù)測(cè)試3次。每個(gè)孔中用100的MTT溶液(5mg/mL,Sigma)處理6小時(shí)后,為了停止反應(yīng),添加100mL二甲基亞砜(DMSO)。通過(guò)利用ELISA測(cè)讀儀(Bio-Rad Laboratories,Inc),在590nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量。
如圖6A所示,表達(dá)抑制細(xì)胞中獲得的培養(yǎng)基的細(xì)胞遷移性比對(duì)照組培養(yǎng)基有減少。
為了確認(rèn)這種遷移性的減少是否由細(xì)胞增殖引起,通過(guò)利用相同的培養(yǎng)基進(jìn)行MTT分析,結(jié)果顯示,并沒(méi)有根據(jù)各培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖(圖6B)。
因此,可確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)是一種能通過(guò)AKT-Snail-MMP-9增加或AKT-snail-上皮鈣黏蛋白抑制的機(jī)制來(lái)增加細(xì)胞的EMT和遷移性的癌標(biāo)記蛋白質(zhì)。
【實(shí)施例5】輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的表達(dá)的研究
為了在作為輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)細(xì)胞的MDCK細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的表達(dá),MDCK細(xì)胞細(xì)胞中制備輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)穩(wěn)定化細(xì)胞。為此,待轉(zhuǎn)染Flag-ACTN4質(zhì)粒后,用G-418(400μg/mL;Sigma)處理2周,來(lái)進(jìn)行選取。在相應(yīng)細(xì)胞內(nèi)通過(guò)利用RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)后,利用30μg蛋白質(zhì)并通過(guò)Western印跡來(lái)確認(rèn)β-連環(huán)蛋白(BD Biosceinces)及作為其靶基因的波形蛋白(Santa Cruz)的表達(dá)。各抗體是以1:3000的比例進(jìn)行確認(rèn)的。
讓人意外的是,作為輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)細(xì)胞的MDCK細(xì)胞中,β-連環(huán)蛋的表達(dá)有增加,作為β-連環(huán)蛋白的靶蛋白的波形蛋白也有增加(圖7A)。
β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的作用是用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖,β-連環(huán)蛋白是通過(guò)與參與普通細(xì)胞間結(jié)合的上皮鈣黏蛋白相結(jié)合而存在。然而,上皮鈣黏蛋白的減少會(huì)引起β-連環(huán)蛋白的減少。然而,在輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi),即使上皮鈣黏蛋白的表達(dá)受到抑制而消失,β-連環(huán)蛋白的表達(dá)仍有增加。因此,由于認(rèn)為輔肌動(dòng)蛋白-4的增加會(huì)影響β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化,確認(rèn)了通過(guò)利用siRNA來(lái)減少上皮鈣黏蛋白的表達(dá)時(shí)根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4而抑制β-連環(huán)蛋白的分解。
為此,制備了si-上皮鈣黏蛋白(寡核苷酸CAGACAAAGACCAGGACUA,Bioneer)。在SiHa細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染si-上皮鈣黏蛋白(100nM)和輔肌動(dòng)蛋白-4(1μg)基因,當(dāng)上皮鈣黏蛋白的表達(dá)有被抑制時(shí),通過(guò)Western印跡來(lái)確認(rèn)β-連環(huán)蛋白和波形蛋白的表達(dá)量。各相應(yīng)抗體是以1:3000的比例進(jìn)行使用。
如圖7B中所示,隨著上皮鈣黏蛋白的減少,β-連環(huán)蛋白會(huì)隨著輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)而受到抑制。
此外,為了確認(rèn)根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4是否抑制β-連環(huán)蛋白的分解,通過(guò)利用作為蛋白質(zhì)合成抑制劑的放線菌酮(Cyclohexamide,CHX,40μg/mL)處理不同時(shí)間(0-36h)來(lái)確認(rèn)根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4過(guò)表達(dá)所引起的變化。通過(guò)利用Western印跡,來(lái)確認(rèn)β-連環(huán)蛋白及其靶蛋白c-myc。各抗體是以1:3000的比例進(jìn)行使用。
其結(jié)果,當(dāng)輔肌動(dòng)蛋白-4過(guò)表達(dá)時(shí),與對(duì)照組(mock)相比更能延遲分解,β-連環(huán)蛋白的靶蛋白c-myc也延遲減少(圖7C)。
在細(xì)胞內(nèi),β-連環(huán)蛋白的分解是由蛋白酶體所引起的現(xiàn)象。因此,為了確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4是否通過(guò)抑制根據(jù)蛋白酶體分解的分解來(lái)誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定化,通過(guò)處理作為蛋白酶體抑制劑的ALLN(20μM/mL,Calbiocam)6小時(shí),來(lái)通過(guò)Western印跡確認(rèn)β-連環(huán)蛋白的分解是否被輔肌動(dòng)蛋白-4所抑制。
此外,在HEK-293T細(xì)胞內(nèi),表達(dá)不同濃度(0,0.05,0.1,0.250.5μg)的輔肌動(dòng)蛋白-4,然后測(cè)定細(xì)胞周期蛋白D1(0.5μg,CCND1)的啟動(dòng)子熒光素酶的活性。
其結(jié)果,當(dāng)輔肌動(dòng)蛋白-4過(guò)表達(dá)時(shí),β-連環(huán)蛋白的蛋白酶體分解受到抑制而變得更穩(wěn)定,從而β-連環(huán)蛋白的量會(huì)增加(圖8A)。此外,β-連環(huán)蛋白的靶蛋白細(xì)胞周期蛋白D1(CCND1)的轉(zhuǎn)錄活性也根據(jù)輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)濃度在增加(圖8B)。
【實(shí)施例6】輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞及過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖的研究
β-連環(huán)蛋白及其靶蛋白的細(xì)胞周期蛋白D1的增加會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖,認(rèn)為輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞增殖,通過(guò)集落形成分析,來(lái)確認(rèn)HeLa和SiHa的輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制穩(wěn)定化細(xì)胞(HeLa-KD,SiHa-KD)的增殖。在12孔板上分別接種3×103個(gè)細(xì)胞,保持5天后,確認(rèn)集落形成的數(shù)量。此外,通過(guò)利用作為輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)穩(wěn)定化細(xì)胞的ME-180-OV#3細(xì)胞并通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)細(xì)胞增殖程度。為此,在12孔板上分別接種3×103個(gè)細(xì)胞,保持5天后,確認(rèn)集落形成的數(shù)量。通過(guò)利用0.05%結(jié)晶紫(crystal violet)對(duì)集落進(jìn)行染色24小時(shí),然后用蒸餾水(DW)進(jìn)行清洗,而后利用Nikon COOLPIX P300數(shù)碼相機(jī)(12.2Mega-pixel;Nikon Corp.,Tokyo,Japan)進(jìn)行拍照。
其結(jié)果,對(duì)輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞HeLa和SiHa而言,集落形成雖有被抑制(圖9A和9B),反之在輔肌動(dòng)蛋白-4有過(guò)表達(dá)的ME-180細(xì)胞中集落形成有增加(圖9C)。因此,輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)是通過(guò)細(xì)胞的增殖會(huì)誘導(dǎo)癌的形成。
如上所述,在輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞中,通過(guò)集落形成分析來(lái)減少細(xì)胞的增殖,為了在宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa-輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制穩(wěn)定化細(xì)胞中確認(rèn)輔肌動(dòng)蛋白-4是否影響細(xì)胞增殖,而進(jìn)行MTT分析。為此,在96孔板上分別接種1×104個(gè)的HeLa和SiHa表達(dá)抑制細(xì)胞,然后根據(jù)時(shí)間(12-36h)進(jìn)行測(cè)定并用圖表展示,各重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。在每個(gè)孔上處理100MTT溶液(5mg/mL,Sigma)6小時(shí)后,為了停止反應(yīng),添加100mL二甲基亞砜(DMSO)。通過(guò)利用ELISA測(cè)讀儀(Bio-Rad Laboratories,Inc),在590nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量。
如圖10所示,HeLa和SiHa細(xì)胞的生長(zhǎng)均比對(duì)照組有減少。
此外,通過(guò)能確認(rèn)細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色分析。這是可以確認(rèn)細(xì)胞的分化過(guò)程的實(shí)驗(yàn),是通過(guò)區(qū)分G0、G1、S、G2/M期的細(xì)胞來(lái)測(cè)定細(xì)胞數(shù)量的方法。根據(jù)如上結(jié)果,實(shí)驗(yàn)原理在于,當(dāng)細(xì)胞的生長(zhǎng)有增加,反之增殖有減少時(shí),S期的細(xì)胞數(shù)量會(huì)有減少。為此,將HeLa和SiHa的對(duì)照組細(xì)胞(對(duì)照組)和表達(dá)抑制細(xì)胞(KD)在100mm盤(pán)上接種2×106個(gè)細(xì)胞,然后在-20℃的70%乙醇內(nèi)進(jìn)行固定處理1小時(shí),以固定細(xì)胞。在固定的細(xì)胞內(nèi)添加包含核糖核酸酶(RNase)的50μg/mL碘化丙啶(Sigma)后,在37℃下孵化30分鐘。待經(jīng)過(guò)30分鐘后,通過(guò)利用FACSan(BD Biosciences,FACS Calibur)來(lái)確認(rèn)對(duì)相應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行各細(xì)胞周期的細(xì)胞數(shù)(%)。
如圖11所示,對(duì)于HeLa和SiHa細(xì)胞的輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞而言,S期的比列有減少。
由此判斷,輔肌動(dòng)蛋白-4起到促進(jìn)癌誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用。
【實(shí)施例7】對(duì)注射輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞的小鼠中的腫瘤形成的研究
如實(shí)施例6中所示,輔肌動(dòng)蛋白-4的過(guò)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的生長(zhǎng),從而在小鼠模型中對(duì)效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
為此,為了確認(rèn)在實(shí)驗(yàn)裸鼠中有無(wú)形成癌組織,通過(guò)利用輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞,將SiHa-對(duì)照組或SiHa-KD(0.1mLPBS中的3×106個(gè)細(xì)胞)細(xì)胞進(jìn)行皮下注射(S.C.)。使用4周齡雄性BALB/c裸鼠(Orient Bio Inc.),每種細(xì)胞各使用五只小鼠(n=5)。待注射癌細(xì)胞后,在溫度22±2℃、濕度50±10%下將小鼠維持在12小時(shí)明/12小時(shí)暗的狀態(tài)。待注射后1-28天內(nèi),通過(guò)使用數(shù)字卡尺,每天測(cè)定所生成的癌大小,將體積計(jì)算為V=0.5×(寬2×長(zhǎng))。
此外,待注射癌細(xì)胞28天后,將SiHa-對(duì)照組和SiHa-表達(dá)抑制組的裸鼠中形成的癌大小進(jìn)行拍照并比較。照片是利用Nikon COOLPIX P300digital camera(12.2Mega-pixel;NikonCorp.,Tokyo,Japan)進(jìn)行拍攝的。
為了提取上述形成的各組的癌組織以比較,通過(guò)利用Nikon COOLPIX P300digital camera(12.2Mega-pixel;Nikon Corp.,Tokyo,Japan進(jìn)行拍照。
此外,測(cè)定所形成的癌大小(數(shù)字卡尺,V=0.5×(寬2×長(zhǎng)))和重量(AdventurerTM,OHAUSCorp.USA),待注射癌細(xì)胞后,根據(jù)日期比較各小鼠組的體重。
將抑制輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)的SiHa細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)并確認(rèn)根據(jù)時(shí)間的腫瘤形成,其結(jié)果,與對(duì)照組細(xì)胞相比,在輔肌動(dòng)蛋白-4表達(dá)抑制細(xì)胞中的癌形成有受抑制(圖12A)。此外,待注射28天后,在確認(rèn)小鼠體內(nèi)生成的腫瘤形成的結(jié)果,與對(duì)照組相比,其大小也較小(圖12B)。
此外,從注射有輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞的小鼠中切除的腫瘤與對(duì)照組進(jìn)行比較時(shí),腫瘤大小比對(duì)照組要小(圖13A)。從小鼠中提取的癌進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,輔肌動(dòng)蛋白-4的表達(dá)抑制細(xì)胞的癌的大小和重量有明顯減少(圖13B)。然而,注射有癌細(xì)胞的小鼠的體重并沒(méi)有變化(圖13C)。
工業(yè)應(yīng)用性
本發(fā)明可用于宮頸癌診斷用的套件、預(yù)防或治療劑上。