本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的建立，應(yīng)用于品種分子鑒定及品種管理。
背景技術(shù)：
云南隸屬西南，屬于我國(guó)西南山地玉米種植區(qū)，雖然云南省不是我國(guó)玉米主產(chǎn)省份，但擁有得天獨(dú)厚的自然環(huán)境及氣候資源，為玉米種質(zhì)資源的選擇提供了更多的可能性。云瑞系列新品種(系)是由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的一系列在云南省最具代表性的玉米品種(系)，具有產(chǎn)量高、抗病、抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)、綜合性狀良好等特點(diǎn)，社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益顯著。該系列品種已在我國(guó)云南、四川、貴州、廣西等周邊省區(qū)累計(jì)推廣4000多萬(wàn)畝。為廣大農(nóng)戶所喜愛。
隨著我國(guó)育種水平的不斷提升，新育成品種不斷涌現(xiàn)，但“品種同質(zhì)化”現(xiàn)象也日趨嚴(yán)重，市場(chǎng)上“同源不同名”、“套牌品種”等現(xiàn)象屢見不鮮，對(duì)我國(guó)品種管理造成了很大麻煩，在打擊原創(chuàng)育種的同時(shí)也給國(guó)家和農(nóng)民利益造成很大的損害。因此，要解決這一難題，需建立起一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的品種識(shí)別及科學(xué)的種子管理方法。品種識(shí)別及科學(xué)的種子管理需要達(dá)到唯一性、可識(shí)別(鑒別)性、可追溯性的要求。
品種dna分子標(biāo)簽即品種dna身份信息標(biāo)簽，可作為品種特異識(shí)別的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，是品種數(shù)字化管理的核心技術(shù)之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了能夠準(zhǔn)確、快速、方便的識(shí)別云瑞系列玉米品種，本發(fā)明提供一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
1.一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法，包括(1)云瑞系列玉米品種基因組dna提取、(2)pcr擴(kuò)增、(3)pcr產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)、(4)dna指紋數(shù)據(jù)的獲得、(5)云瑞系列玉米品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集、(6)云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽制作，在所述(2)pcr擴(kuò)增中每一個(gè)云瑞系列玉米品種提取的基因組dna，分別用引物bnlg1191、bnlg1940k7、umc2007y4、bnlg2305k4進(jìn)行擴(kuò)增，所述的引物bnlg1191由bnlg1191正向引物和bnlg1191反向引物組成，所述的bnlg1191正向引物的堿基序列如seqidno：1所示，bnlg1191反向引物的堿基序列如seqidno：2所示；所述引物bnlg1940k7由bnlg1940k7正向引物和bnlg1940k7反向引物組成，所述bnlg1940k7正向引物的堿基序列如seqidno：3所示，bnlg1940k7反向引物的堿基序列如seqidno：4所示；所述引物umc2007y4由umc2007y4正向引物和umc2007y4反向引物組成，所述umc2007y4正向引物的堿基序列如seqidno：5所示，umc2007y4反向引物的堿基序列如seqidno：6所示；所述引物bnlg2305k4由bnlg2305k4正向引物和bnlg2305k4反向引物組成，所述bnlg2305k4正向引物的堿基序列如seqidno：7所示，bnlg2305k4反向引物的堿基序列如seqidno：8所示；
在所述(4)dna指紋數(shù)據(jù)的獲得中每一個(gè)云瑞系列玉米品種的dna指紋數(shù)據(jù)的獲得是根據(jù)毛細(xì)管熒光電泳讀出的該云瑞系列玉米品種4個(gè)位點(diǎn)的等位變異片段大小數(shù)據(jù)，純合位點(diǎn)的等位變異記錄為x/x，以x/x的形式表示其dna指紋數(shù)據(jù)，雜合位點(diǎn)的等位變異記錄為x/y，以x/y的形式表示其dna指紋數(shù)據(jù)，其中x、y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異片段大小數(shù)據(jù)，小片段在前，大片段在后，以兩個(gè)片段大小記錄；每一個(gè)云瑞系列玉米品種的dna指紋數(shù)據(jù)x/y或x/y依次按引物bnlg1191、引物bnlg1940k7、引物umc2007y4、引物bnlg2305k4的引物順序排列；
在所述(5)云瑞系列玉米品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集中每一個(gè)云瑞系列玉米品種所采集的基本商品信息數(shù)據(jù)包括作物種類、品種植物學(xué)類型、品種繁殖類型、品種名稱、單元識(shí)別代碼、審定區(qū)域和審定的年份，所述的單元識(shí)別代碼是用1、2、3……自然數(shù)中的任意數(shù)表示，且不同的云瑞系列玉米品種的單元識(shí)別代碼均不相同；
所述(6)云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽制作是將同一云瑞系列玉米品種在步驟(4)獲得的dna指紋數(shù)據(jù)和在步驟(5)所采集的基本商品信息數(shù)據(jù)輸入二維碼生成器生成二維碼圖形即為云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽。
2.根據(jù)技術(shù)方案1所述的一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法，步驟(2)pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10μl的反應(yīng)體積，其中1μl10×pcr反應(yīng)緩沖液，0.6μl25mmol/lmgcl2，0.8μl2.5mmol/ldntp溶液，0.25μl5μmol/l正向引物，0.25μl5μmol/l反向引物，0.25μl2u/μltaqdna聚合酶，5.85μl超純水，1μl樣品dna；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延45min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
3.根據(jù)技術(shù)方案1或2所述的一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法，在步驟(5)云瑞系列玉米品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集中所采集的基本商品信息數(shù)據(jù)還包括生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者名稱。
4.根據(jù)技術(shù)方案3所述的一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法，在步驟(5)云瑞系列玉米品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集中所采集的基本商品信息數(shù)據(jù)還包括追溯網(wǎng)址。
5.根據(jù)技術(shù)方案1或2所述的一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法構(gòu)建的云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽。
6.根據(jù)技術(shù)方案3所述的一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法構(gòu)建的云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽。
7.根據(jù)技術(shù)方案4所述的一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法構(gòu)建的云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效益：
1、本發(fā)明提出了4對(duì)鑒別云瑞系列玉米品種的特異性引物，實(shí)現(xiàn)了以廣泛基因組覆蓋度的最少引物鑒定云瑞系列玉米品種，能夠用最少的引物構(gòu)建所有云瑞系列玉米品種的dna分子標(biāo)簽，減少了繁復(fù)的工作量和高昂的檢測(cè)成本，能夠把云瑞系列玉米品種與其它云南高原玉米品種鑒別開，同時(shí)還可以把云瑞系列玉米品種一一區(qū)分開。
2、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了云瑞系列玉米品種和其種子的雙重防偽，達(dá)到品種識(shí)別及科學(xué)的種子管理的唯一性、可識(shí)別(鑒別)性、可追溯性,標(biāo)識(shí)于商品種子包裝上，用于云瑞系列玉米品種種子的防偽和溯源的一種信息化管理技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)。
3、本發(fā)明優(yōu)化了pcr反應(yīng)體系技術(shù)參數(shù)，現(xiàn)有pcr擴(kuò)增體系并不適用于云瑞系列玉米品種，擴(kuò)增出的條帶不清晰甚至沒有條帶，本發(fā)明優(yōu)化后的pcr反應(yīng)體系能夠抑制非特異性擴(kuò)增，增加目的dna產(chǎn)物的產(chǎn)率，使得云瑞系列玉米品種的擴(kuò)增條帶清晰可見，更易于膠片的觀察和條帶統(tǒng)計(jì)。
序列表中seqidno：1所示的是bnlg1191正向引物的堿基序列。
序列表中seqidno：2所示的是bnlg1191反向引物的堿基序列。
序列表中seqidno：3所示的是bnlg1940k7正向引物的堿基序列。
序列表中seqidno：4所示的是bnlg1940k7反向引物的堿基序列。
序列表中seqidno：5所示的是umc2007y4正向引物的堿基序列。
序列表中seqidno：6所示的是umc2007y4反向引物的堿基序列。
序列表中seqidno：7所示的是bnlg2305k4正向引物的堿基序列。
序列表中seqidno：8所示的是bnlg2305k4反向引物的堿基序列。
附圖說明
圖1是實(shí)施例1采用本發(fā)明方法構(gòu)建的云瑞系列云瑞508玉米品種dna分子標(biāo)簽。
具體實(shí)施方式
術(shù)語(yǔ)：
追溯網(wǎng)址：是指云瑞系列玉米品種的生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者的網(wǎng)址。
本發(fā)明針對(duì)云瑞系列玉米品種，選取多態(tài)性高、區(qū)分度好、數(shù)據(jù)容易統(tǒng)計(jì)、擴(kuò)增重復(fù)性好、引物位點(diǎn)在染色體上均勻分布的ssr引物作為核心引物。采用200個(gè)不同遺傳背景的云南玉米品種對(duì)40余對(duì)玉米ssr引物進(jìn)行篩選，篩選出4對(duì)多態(tài)性高、區(qū)分度好、數(shù)據(jù)容易統(tǒng)計(jì)、擴(kuò)增重復(fù)性好、引物位點(diǎn)在染色體上均勻分布的ssr引物。30對(duì)引物對(duì)200個(gè)云南玉米品種進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，得到dna指紋圖譜，通過數(shù)據(jù)分析確定9個(gè)云瑞系列玉米品種的指紋圖譜進(jìn)行分析，最后確定4對(duì)引物作為核心引物鑒別云瑞系列玉米品種。玉米為二倍體，dna指紋數(shù)據(jù)以4個(gè)位點(diǎn)的等位變異片段大小數(shù)據(jù)表示，dna指紋數(shù)據(jù)通毛細(xì)管熒光電泳讀取。
表1用于構(gòu)建云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的引物信息
實(shí)例1建立云瑞系列玉米品種云瑞508(滇審玉米2015036號(hào))玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法
(1)云瑞系列玉米品種基因組dna提?。?/p>
取云瑞508葉片約200-300mg置于2.0ml離心管，加液氮充分研磨。每管加入700μl經(jīng)65℃預(yù)熱的ctab提取液，充分混合，65℃水浴60min并2-3顛倒混勻。每管加入等體積的三氯甲烷和異戊醇的混合液，三氯甲烷：異戊醇的體積比為24：1，充分混合后靜置10min，在12,000rpm離心15min。吸取上清液轉(zhuǎn)移至一新管，加入等體積0℃預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置30min后在4℃、12,000rpm離心10min，棄上清液，加入70％v/v乙醇，旋轉(zhuǎn)2-3次后棄去乙醇溶液，并倒立于墊有濾紙的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，室溫放置10min以上。加入100μl超純水1或00μlte緩沖液，充分溶解后得基因組dna樣品，備用。
ctab提取液：81.7g氯化鈉和20.0gctab溶于適量水中，然后加入1mol/ltris-hcl100ml，0.5mol/ledta40ml，定容至1000ml，4℃貯存。
(2)pcr擴(kuò)增
取步驟(1)獲得的基因組dna樣品進(jìn)行擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10μl的反應(yīng)體積，其中，1μl10×pcr反應(yīng)緩沖液、0.6μl25mmol/lmgcl2、0.8μl2.5mmol/ldntp溶液、0.25μl5μmol/l正向引物，0.25μl5μmol/l反向引物(各引物對(duì)合成時(shí)用熒光基團(tuán)修飾)，0.25μl2u/μltaqdna聚合酶，5.85μl超純水，1μl樣品dna。
pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，60℃退火35s，72℃延45min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
分別用引物bnlg1191、bnlg1940k7、umc2007y4、bnlg2305k4進(jìn)行擴(kuò)增，所述的引物bnlg1191由bnlg1191正向引物和bnlg1191反向引物組成，所述的bnlg1191正向引物的堿基序列如seqidno：1所示，bnlg1191反向引物的堿基序列如seqidno：2所示；所述引物bnlg1940k7由bnlg1940k7正向引物和bnlg1940k7反向引物組成，所述bnlg1940k7正向引物的堿基序列如seqidno：3所示，bnlg1940k7反向引物的堿基序列如seqidno：4所示；所述引物umc2007y4由umc2007y4正向引物和umc2007y4反向引物組成，所述umc2007y4正向引物的堿基序列如seqidno：5所示，umc2007y4反向引物的堿基序列如seqidno：6所示；所述引物bnlg2305k4由bnlg2305k4正向引物和bnlg2305k4反向引物組成，所述bnlg2305k4正向引物的堿基序列如seqidno：7所示，bnlg2305k4反向引物的堿基序列如seqidno：8所示；
(3)pcr產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)
將熒光標(biāo)記的pcr產(chǎn)物用超純水稀釋30倍，分別從中吸取1μl加入到dna分析儀專用深孔板孔中。板中各孔分別加入0.1μlliz500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.9μl去離子甲酰胺。將深孔板在pcr儀上95℃變性5min，取出，立即置于碎冰上，冷卻10min以上。瞬時(shí)1000rpm離心10s后置放到dna分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。對(duì)采集的數(shù)據(jù)采用genemapperv3.2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，讀出每個(gè)位點(diǎn)每份樣品的等位變異大小數(shù)據(jù)。
(4)dna指紋數(shù)據(jù)的獲得
每一個(gè)云瑞系列玉米品種的dna指紋數(shù)據(jù)的獲得是根據(jù)毛細(xì)管熒光電泳讀出的該云瑞系列玉米品種在4個(gè)位點(diǎn)的等位變異片段大小數(shù)據(jù)，純合位點(diǎn)的等位變異記錄為x/x，以x/x的形式表示其dna指紋數(shù)據(jù)，雜合位點(diǎn)的等位變異記錄為x/y，以x/y的形式表示其dna指紋數(shù)據(jù)，其中x、y為該位點(diǎn)上兩個(gè)不同的等位變異片段大小數(shù)據(jù)，小片段在前，大片段在后，以兩個(gè)片段大小記錄；每一個(gè)云瑞系列玉米品種的dna指紋數(shù)據(jù)x/y或x/y依次按引物bnlg1191、引物bnlg1940k7、引物umc2007y4、引物bnlg2305k4的引物順序排列；
云瑞508在4個(gè)位點(diǎn)上擴(kuò)增出的片段大小(bp)分別為(按上述引物順序排列)：
189/189、196/196、348/348、360/360、258/258、264/264、278/278，即為云瑞508的dna指紋數(shù)據(jù)為：189/189、196/196、348/348、360/360、258/258、264/264、278/278。
分子標(biāo)記數(shù)據(jù)為可替換或擴(kuò)展項(xiàng)，有多態(tài)性更好的位點(diǎn)可以替換或補(bǔ)充。
(5)云瑞系列玉米品種基本商品信息數(shù)據(jù)的采集
云瑞508品種的基本商品信息數(shù)據(jù)如下：
作物種類：玉米
品種植物學(xué)類型：玉米
品種繁殖類型：常規(guī)種
品種名稱：云瑞508
單元識(shí)別代碼：1
審定區(qū)域和審定的年份：云南，2015年。
(6)云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽制作
將步驟(4)獲得的云瑞508的dna指紋數(shù)據(jù)和步驟(5)采集的云瑞508品種的基本商品信息數(shù)據(jù)輸入微微二維碼生成器生成二維碼圖形即為云瑞508品種dna分子標(biāo)簽，該品種dna分子標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)了使用者用普通設(shè)備(手機(jī))快速識(shí)別種子真?zhèn)巍?/p>
云瑞508玉米品種dna分子標(biāo)簽的全部信息如下：
作物種類：玉米
品種植物學(xué)類型：玉米
品種繁殖類型：常規(guī)種
品種名稱：云瑞508
單元識(shí)別代碼：1
審定區(qū)域和審定的年份：云南，2015年。
dna指紋數(shù)據(jù)：189/189、196/196、348/348、360/360、258/258、264/264、278/278。
sequencelisting
<110>云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所
<120>一種建立云瑞系列玉米品種dna分子標(biāo)簽的方法
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