專利名稱：用于高通量檢測人類乳頭瘤病毒的dna分子標(biāo)簽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)的檢測方法，特別是 基于Solexa測序法的HPV檢測方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是世界上女性癌癥的第二號殺手，僅次于乳腺癌。每年全世界約有50萬新 發(fā)病例，25萬死亡病例，其中發(fā)展中國家占2/3。我國是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，占全球?qū)m頸癌總 數(shù)的10%。研究表明，人乳頭瘤病毒(HPV)與宮頸癌有著密切關(guān)系，是重要的致癌因子，同 時也是引發(fā)宮頸癌的必要條件之一。已經(jīng)表明，超過100種的HPV能夠感染皮膚(皮膚類 型)或呼吸道和肛門生殖道的粘膜(粘膜類型)，超過40種的HPV能夠感染子宮頸?；?誘導(dǎo)的良性的，惡化前的或惡性的病變，將HPV分別分為低危型(例如HPV6，11，42，43和 44)和高危型(例如昍乂16，18，31，33和45)。因此，對HPV感染的及早發(fā)現(xiàn)和正確分型對 宮頸癌防治顯得至關(guān)重要。目前HPV的檢測方法主要有以下幾種①細(xì)胞學(xué)檢查，其利用宮頸刮片細(xì)胞學(xué)檢 查或液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，藉由細(xì)胞外觀形態(tài)的轉(zhuǎn)變來加以診斷。對于HPV感染，鏡下可見 挖空細(xì)胞、角化不良以及濕疣外底層細(xì)胞。其局限性在于，HPV感染的診斷的靈敏性和特異 性較低。②免疫組化方法，其通過檢測HPV的衣殼抗原來進(jìn)一步明確HPV感染，其所得的陽 性反應(yīng)定位明確，判斷可靠。但是，衣殼抗原僅在HPV-DNA復(fù)制成熟后才產(chǎn)生，因此，診斷為 陰性的受試者并不能被確定為不被HPV感染，該方法靈敏性較低。③實(shí)時熒光定量PCR法 (FQ-PCR)，其主要是應(yīng)用熒光檢測PCR儀，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號 積累對PCR過程中每一個循環(huán)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，從而對模板的初始濃度進(jìn)行 定量。此方法通量較低。④雜交捕獲法(主要為HC-II系統(tǒng))，其是目前唯一獲得美國FDA 認(rèn)證的可用于臨床的HPV DNA檢測方法，并且其已獲得歐洲CE及中國SDA認(rèn)證。該方法使 用專用的標(biāo)本采集保存器；已獲得專利保護(hù)的全長SOOObp的RNA探針以及已獲得專利保護(hù) 的特異性第一抗體。其原理是將核酸探針雜交到受測檢體的HPVDNA上，再通過化學(xué)熒光或 酶反應(yīng)借助增幅的信號進(jìn)行檢測。該方法所使用的核酸探針主要分為兩種針對低危險型 HPV的核酸探針和針對高危險型HPV的核酸探針。該方法可用于HPV的初步篩檢，但是不能 確定HPV的特定類型，也不能確定多重感染的情況。將上述檢測方法聯(lián)合使用，可以提高HPV檢測的靈敏性并降低檢測的假陰性率。 然而，這些方法的組合成本相對較高，一般只適用于經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的HPV檢測和宮頸癌篩 查。對于經(jīng)濟(jì)較不發(fā)達(dá)地區(qū)，特別是在山區(qū)和廣大農(nóng)村地區(qū)，上述檢測方法的聯(lián)合使用存在 著較大的局限性。因此，開發(fā)適合的、低成本的HPV檢測方法，是亟待解決的問題。另一方面，目前已知的HPV檢測方法，例如上文描述的那些檢測方法，通量都較 低。當(dāng)對大規(guī)模的樣品進(jìn)行HPV檢測時，應(yīng)用上述方法是耗時耗力的，并且成本高昂。因此， 本領(lǐng)域迫切需要新的高通量的、低成本的HPV檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于Solexa測序法以及PCR標(biāo)簽(PCR index)，開發(fā)了新型的HPV檢測方 法以及用于此的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的方法和試劑盒不僅可以實(shí)現(xiàn)HPV的高通量、低成本 檢測，而且可以實(shí)現(xiàn)HPV的精確分型。定義為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。如本文中所使用的，術(shù)語“PCR”是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。如本文中所使用的，術(shù)語“Solexa測序法”是指近幾年開發(fā)的新一代DNA測序法， 也稱為第二代測序法。Solexa測序法與傳統(tǒng)測序法(例如，Sanger測序法)的不同之處在 于，其采用邊合成邊測序的原理進(jìn)行DNA序列分析。Solexa測序法具有下述優(yōu)點(diǎn)1)成本 低，僅為傳統(tǒng)測序成本的；2)通量高，可以同時對多個樣品進(jìn)行測序，并且進(jìn)行一次的 Solexa測序法可以產(chǎn)生大約500億(50G)個堿基的數(shù)據(jù)；3)精確性高(高于98.4% )，有 效的解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題。另一方面，高測序通量在進(jìn)行測序的序列的數(shù)目確 定的情況下，又反過來提高了序列的測序深度(例如，針對每個序列，可以進(jìn)行多次測序)， 從而確保了測序結(jié)果的可靠性。如本文所使用的，術(shù)語“測序深度”是指一段DNA序列在測 序數(shù)據(jù)中集中出現(xiàn)的次數(shù)。測序深度可以通過將測序量除以基因組長度來計算，例如測序 深度為10，表示測了 10次的整個基因組。Solexa測序法的應(yīng)用十分廣泛。其可以用于基因組測序，基因分型，基因多態(tài)性研 究等等。本發(fā)明的方法將Solexa測序法用于檢測HPV 通過對待分析的樣品進(jìn)行針對HPV 的測序，然后使用本領(lǐng)域已知的比對程序，例如BLAST和S0AP，將所得的測序結(jié)果與HPV數(shù) 據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行比對，從而實(shí)現(xiàn)對樣品所感染的HPV的精確分型。本文中使用的HPV 數(shù)據(jù)庫包含本領(lǐng)域已知的HPV類型的序列，所述序列可見于例如公共數(shù)據(jù)庫，例如NCBI數(shù) 據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。如本文中可互換使用的，術(shù)語“PCR標(biāo)簽(PCR index)”、“標(biāo)簽(index)”或“引物 標(biāo)簽(primer index) ”是指添加在PCR引物5 ‘末端的一小段堿基序列，其通過PCR擴(kuò)增 可以用于標(biāo)記PCR產(chǎn)物，從而辨別不同模板來源的PCR產(chǎn)物的混合物中各個PCR產(chǎn)物的模 板來源。通過在引物的5'末端添加標(biāo)簽，可以對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，從而可以將多個不同 的PCR產(chǎn)物混合成一個文庫，用于進(jìn)一步的分析和處理。文庫中各個不同的PCR產(chǎn)物各自 具有獨(dú)特的標(biāo)簽，從而根據(jù)各個PCR產(chǎn)物中獨(dú)特的標(biāo)簽，可以將各個不同的PCR產(chǎn)物互相區(qū) 分開來，并將其與PCR模板一一對應(yīng)。例如，當(dāng)需要對多個樣品進(jìn)行測序時，可以在用于各個樣品的引物的5'末端添 加不同的標(biāo)簽，然后用添加了標(biāo)簽的引物分別對各個樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而對各個樣品 (即，PCR產(chǎn)物)進(jìn)行標(biāo)記。PCR反應(yīng)后，可以將來自各個樣品的帶有不同標(biāo)簽的PCR產(chǎn)物 混合在一起組成一個文庫，然后應(yīng)用高通量的Solexa測序法同時對文庫中的各個PCR產(chǎn)物 進(jìn)行測序。最終，在所得的測序數(shù)據(jù)中，通過獨(dú)特的標(biāo)簽，可以將測序結(jié)果與各個PCR產(chǎn)物 (從而樣品模板)一一對應(yīng)?？梢詢H在用于PCR擴(kuò)增的引物對的一條引物中引入標(biāo)簽，也可以在引物對的兩條 引物中都引入標(biāo)簽。當(dāng)在引物對的兩條引物中都引入標(biāo)簽時，每個PCR引物對與一對標(biāo)簽 組合成一對標(biāo)簽引物，其中正向和反向PCR引物的5'端分別具有正向標(biāo)簽和反向標(biāo)簽，并
4且正反標(biāo)簽和正反引物序列是對應(yīng)的，且正向標(biāo)簽和反向標(biāo)簽可以是相同的，或不同的。設(shè)計標(biāo)簽時需要考慮多種因素，包括1)標(biāo)簽序列中應(yīng)當(dāng)避免3個或3個以上的 單堿基重復(fù)序列；2)所有標(biāo)簽的同一位點(diǎn)中堿基A和堿基C的總含量應(yīng)在所有堿基含量 的30% -70%之間，例如，當(dāng)設(shè)計100條不同的標(biāo)簽序列時，每一條標(biāo)簽序列的第二個堿基 (艮P，所謂的同一位點(diǎn))中A和C占該100條序列第二個堿基總量的30% -70% ；3)標(biāo)簽 序列本身的GC含量應(yīng)在40-60%之間；4)標(biāo)簽之間的序列差異應(yīng)大于4個堿基；5)標(biāo)簽序 列中應(yīng)避免出現(xiàn)與用于測序的引物相似度高的序列；6)當(dāng)標(biāo)簽序列添加到PCR擴(kuò)增引物上 后，應(yīng)避免PCR擴(kuò)增引物形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和二聚體等二級結(jié)構(gòu)。如本文中所使用的，術(shù)語“標(biāo)簽引物(index primer) ”是指帶有標(biāo)簽的引物，其包 含2個部分，標(biāo)簽部分和引物部分，其中標(biāo)簽部分用于在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中標(biāo)記PCR產(chǎn)物，而 引物部分與模板堿基互補(bǔ)配對，用于擴(kuò)增模板，并且其中標(biāo)簽部分，任選地通過連接序列， 連接至引物部分的5'端。如本文中所使用的，術(shù)語“接頭(adapter) ”或“文庫接頭(libraryadapter) ”是指 經(jīng)設(shè)計的一段堿基序列，其可以連接至文庫中的擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物上，從而文庫中的所有 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物都可以借助該接頭進(jìn)行測序，例如，使用針對該接頭設(shè)計的測序引物(而 無需使用針對各PCR產(chǎn)物設(shè)計的特異性測序引物)進(jìn)行測序。優(yōu)選地，本發(fā)明的接頭可以 通過“PCR-FREE ”方法連接至PCR產(chǎn)物上。如本文中所使用的，術(shù)語“PCR-FREE”是指不進(jìn)行PCR反應(yīng)而直接將接頭連接至 PCR產(chǎn)物上，例如通過使用DNA連接酶將接頭連接至PCR產(chǎn)物上。利用PCR-Free方法來 構(gòu)建測序文庫是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，參見例如，Nature Methods 6，291-295 (2009)。 “PCR-FREE”方法由于整個過程無需進(jìn)行PCR而具有以下有利方面1)減少了純化步驟，降 低了花費(fèi)的時間和成本；2)減少了非特異性擴(kuò)增；3)在含有許多序列高度相似的PCR產(chǎn)物 的文庫的構(gòu)建過程中，避免由PCR引入錯誤，從而提高最后的測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。如本文中所使用的，本發(fā)明的方法和試劑盒可以使用至少1種接頭。不同的接頭 可以共有相同的一段序列(在本文中稱為“測序序列”)，并且可進(jìn)一步包含不同的特征序 列，從而，不同的接頭可以共用相同的引物(其針對相同的測序序列進(jìn)行設(shè)計)進(jìn)行測序， 并且利用獨(dú)特的特征序列可以辨別多個文庫的混合物中各個PCR產(chǎn)物的文庫來源，S卩，對 不同文庫來源的PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的標(biāo)記。將標(biāo)簽與具有不同特征序列的接頭組合，可以大大提高標(biāo)記的效率(參見圖1)。 例如，使用100種標(biāo)簽可以標(biāo)記100個樣品，而使用100種標(biāo)簽和200種具有不同特征序列 的接頭，可以標(biāo)記100*200 = 20000個樣品。因此，本發(fā)明的一個方面提供了一組標(biāo)簽，其包含至少10種，優(yōu)選至少20種、至少 30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或95種標(biāo)簽，并 且所述標(biāo)簽具有選自SEQ ID NO :1-95的序列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該組標(biāo)簽至少包括 SEQ ID NO: 1-10，或 SEQ ID NO 11-20，或 SEQ ID NO :21_20，或 SEQ ID NO :31_40，或 SEQ ID NO :41-50，或 SEQ ID NO :51_60，或 SEQ ID NO :61_70，或 SEQ ID NO :71_80，或 SEQ ID N0:81-90，或SEQ ID NO :91_95所示的標(biāo)簽，或者其任何兩個或者多個的組合，例如SEQ ID NO 1-95所示的標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽用于標(biāo)記SEQ IDNO :96_106所示的PCR引物，從而用于進(jìn)行高通量HPV測序、檢測或分型。本發(fā)明的一個方面提供了一種標(biāo)簽引物組，其包含11種標(biāo)簽引物，所述標(biāo)簽引物 的序列包含標(biāo)簽序列和PCR弓I物序列，并且所述標(biāo)簽序列，任選地通過連接序列，連接至所 述PCR引物序列的5'端，其中1)所述標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO 1_95，且標(biāo)簽引物組中的11種標(biāo)簽引物的每一 種的標(biāo)簽序列都相同，和2)所述11種標(biāo)簽引物的PCR引物序列分別如SEQ ID NO :96_106所示。本發(fā)明的標(biāo)簽引物組可擴(kuò)增出至少16種大約170bp的產(chǎn)物，其對應(yīng)于HPV基因組 中最為保守的基因區(qū)(Li區(qū))中的一段高度保守的DNA序列。因此，本發(fā)明的標(biāo)簽引物組 可用于HPV的精確分型。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽引物組可用于HPV測序、檢測或分型，從而 其可用于醫(yī)療用途，例如診斷HPV的存在和確定HPV的類型等，以及非醫(yī)療用途，例如構(gòu)建 HPV數(shù)據(jù)庫，鑒定HPV的新的類型和亞型，研究HPV類型分布的地域性特點(diǎn)，流行病學(xué)研究和 疫苗研制等。在另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽引物組可用于制備試劑盒，所述試劑 盒可用于HPV測序、檢測或分型。本發(fā)明的另一個方面提供了一種標(biāo)簽引物套組，其包含至少10個，優(yōu)選至少20 個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或95 個上文描述的標(biāo)簽引物組。優(yōu)選地，標(biāo)簽引物套組中，各個標(biāo)簽引物組所使用的標(biāo)簽序列 互不相同。更優(yōu)選，標(biāo)簽引物套組中所使用的標(biāo)簽序列至少包括SEQ IDNO 1-10，或SEQ ID NO :11-20，或 SEQ ID NO :21_20，或 SEQ ID NO :31_40，或 SEQ ID NO :41_50，或 SEQ ID NO :51-60，或SEQ ID NO :61_70，或SEQ ID NO :71_80，或SEQ ID NO :81_90，或SEQ ID NO: 91-95所示的標(biāo)簽序列，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合，例如SEQID NO :1_95所示的標(biāo) 簽序列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽引物套組可用于高通量HPV測序、檢測或 分型，從而其可用于醫(yī)療用途，例如大規(guī)模的HPV相關(guān)疾病的診斷和HPV的精確分型(為臨 床診斷和治療方案選擇提供依據(jù))等，以及非醫(yī)療用途，例如構(gòu)建HPV數(shù)據(jù)庫，鑒定HPV的 新的類型和亞型，研究HPV類型分布的地域性特點(diǎn)，流行病學(xué)研究和疫苗研制等。在另一個 優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽弓I物套組可用于制備試劑盒，所述試劑盒可用于高通量HPV 測序、檢測或分型。本發(fā)明的另一個方面提供了一種試劑盒，其包含上文描述的標(biāo)簽引物組或標(biāo)簽引 物套組。優(yōu)選，本發(fā)明的試劑盒還包含至少1種，優(yōu)選至少2種、至少10種、至少20種、至 少30種、至少40種、至少50種、至少100種或至少200種接頭。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所 述接頭適用于Solexa測序法，例如其可用于構(gòu)建測序文庫，例如所述接頭可具有選自SEQ ID N0:121-132的序列。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，通過PCR-FREE方法，例如DNA連接酶法， 使用接頭來構(gòu)建測序文庫。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒可用于高通量HPV測序、檢測或分型，并 且如上所述，其可用于醫(yī)療用途和非醫(yī)療用途。本發(fā)明的另一個方面提供了用于對一個或多個樣品進(jìn)行HPV測序、檢測或分型的 方法。所述方法包括使用上文描述的標(biāo)簽引物組或標(biāo)簽引物套組或試劑盒對各個樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行測序以獲得樣品的序列的步驟。本發(fā)明的另一個方面提供了用于對一個或多個樣品進(jìn)行HPV測序、檢測或分型的 方法，其包括下列步驟提供η個樣品，η為大于等于1的整數(shù)，所述樣品優(yōu)選地來自哺乳動物，更優(yōu)選是 人，且優(yōu)選是脫落細(xì)胞；可選地，將待分析的η個樣品分成m個小組，m為整數(shù)且η > m > 1 ；1)對于每一個樣品，使用一個標(biāo)簽弓I物組對樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述標(biāo)簽引物組包含11種標(biāo)簽引物，所述標(biāo)簽引物的序列包含標(biāo)簽序列和PCR引 物序列，并且所述標(biāo)簽序列，任選地通過連接序列，連接至所述PCR引物序列的5'端，其中i)所述標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO :1_95，并且所述11種標(biāo)簽引物的每一種的標(biāo)簽 序列都相同，和ii)所述11種標(biāo)簽引物的PCR引物序列分別如SEQ ID NO :96_106所示，其中，不同的樣品使用的標(biāo)簽引物組可以相同或者不同，并且不同的標(biāo)簽引物組 使用不同的標(biāo)簽序列；2)將步驟1)中的使用不同標(biāo)簽引物組進(jìn)行擴(kuò)增所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起， 得到一個或多個PCR產(chǎn)物文庫； 3)通過PCR-FREE方法，例如DNA連接酶法給步驟2)中獲得的一個或多個PCR產(chǎn) 物文庫分別添加接頭，從而構(gòu)建一個或多個測序文庫，其中不同的測序文庫所使用的接頭 可以相同或者不同，且不同的接頭共有相同的測序序列，但具有不同的特征序列；4)任選地，將步驟3)中獲得的使用不同接頭的測序文庫混合在一起，得到一個或 多個文庫混合物；5)對步驟3)中獲得的一個或多個測序文庫或步驟4)中獲得的一個或多個文庫混 合物分別進(jìn)行測序，其中利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選Pair-End技術(shù)(例如Solexa、Illumina Hiseq 2000)進(jìn)行測序；6)根據(jù)標(biāo)簽引物組的標(biāo)簽引物序列，或者根據(jù)標(biāo)簽引物組的標(biāo)簽引物序列以及接 頭的特征序列，將測序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)；其中所述樣品優(yōu)選是脫落細(xì)胞，且優(yōu)選來源于動物，例如人。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用至少10個，優(yōu)選至少20個、至少30個、 至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或95個上文描述的標(biāo)簽 引物組。進(jìn)一步優(yōu)選地，所使用的標(biāo)簽序列至少包括SEQ ID N0:l-10，或SEQ ID NO 11-20， 或 SEQ ID NO :21-20，或 SEQ ID NO :31_40，或 SEQ ID NO :41_50，或 SEQ ID N0:51_60，或 SEQ ID NO :61-70，或 SEQ ID NO :71_80，或 SEQ ID NO :81_90，或 SEQ ID N0:91_95 所示的 標(biāo)簽序列，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合，例如SEQ ID NO: 1-95所示的標(biāo)簽序列。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用至少1種，優(yōu)選至少2 種、至少10種、至少20種、至少30種、至少40種、至少50種、至少100種或至少200種接 頭，例如所述接頭可具有選自SEQ ID NO 121-132的序列。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，在測序后，將獲得的樣品序列與上文描 述的HPV數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行對比，從而對樣品進(jìn)行HPV精確分型。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明基于Solexa測序法提供了用于對多個樣品進(jìn)行 高通量HPV測序、檢測或分型的方法，所述樣品優(yōu)選是脫落細(xì)胞，且優(yōu)選來源于動物，例如人，所述方法包括下列步驟1)將待分析的樣品分成m個小組，m為彡1的整數(shù)；2)對每個樣品小組進(jìn)行如下步驟2a)從待分析的樣品中提取DNA ；2b)根據(jù)用于擴(kuò)增HPV DNA的引物組中的所有引物的序列，設(shè)計一套標(biāo)簽，標(biāo)簽的 個數(shù)η等于該樣品小組的樣品數(shù)目；2c)將2b)中設(shè)計的每一個標(biāo)簽分別添加至引物組的所有正向引物或所有反向引 物或所有引物的序列的5'末端，從而提供η個標(biāo)簽引物組；2d)使用2c)中提供的標(biāo)簽引物組對2a)中獲得的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而提 供PCR產(chǎn)物，其中針對每個樣品DNA，使用不同的標(biāo)簽引物組；和2e)將2d)中的所有PCR產(chǎn)物混合在一起，獲得PCR產(chǎn)物文庫；3)給2)中得到的PCR產(chǎn)物文庫加上接頭，其中各個PCR產(chǎn)物文庫使用不同的接 頭，從而構(gòu)建m個測序文庫，其中各個接頭共有相同的測序序列，而具有互不相同的特征序 列；4)將m個測序文庫混合在一起，利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選Pair-End技術(shù)(例如 Solexa, Illumina Hiseq 2000)進(jìn)行測序；得到所有樣品的測序結(jié)果；5)根據(jù)測序結(jié)果中的接頭的特征序列、標(biāo)簽的序列以及引物的序列，將獲得的測 序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)；和任選地，將每個樣品的測序結(jié)果與HPV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而實(shí) 現(xiàn)HPV測序、檢測或分型。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行DNA提取。例 如，可以使用自動化的DNA提取儀和DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，例如可商購獲得的 KingFisher自動提取儀，例如美國Thermo Scientific Kingfisher Flex全自動磁珠提取 純化系統(tǒng)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，2b)中的引物組包含11條引物，其序列分別如SEQ ID NO 96-106所示。這11條引物組成的引物組可擴(kuò)增出至少16種大約170bp的產(chǎn)物，其對 應(yīng)于HPV基因組中最為保守的基因區(qū)(Li區(qū))中的一段高度保守的DNA序列。因此，通過 對該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確測序，可以實(shí)現(xiàn)HPV的精確分型。在又一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，2b)中設(shè)計的標(biāo)簽的個數(shù)為至少10個，優(yōu)選至少20 個，至少30個，至少40個，至少50個，至少60個，至少70個，至少80個，至少90個，或至少 100個。優(yōu)選，標(biāo)簽可具有選自SEQ ID NO :1_95的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，不同樣品小 組之間的所使用的標(biāo)簽可以相同或者不同。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，引入正向引物的標(biāo)簽與 引入反向引物的標(biāo)簽可以相同或者不同。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，2b)中設(shè)計的標(biāo)簽至少 包括 SEQ ID N0:l-10，或 SEQ ID NO 11-20，或 SEQ ID NO :21_20，或 SEQ ID N0:31_40，或 SEQ ID NO :41-50，或 SEQ ID NO :51_60，或 SEQ ID NO :61_70，或 SEQ ID NO :71_80，或 SEQ ID N0:81-90，或SEQ ID NO :91_95所示的標(biāo)簽，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合。在特 別優(yōu)選的實(shí)施方案中，2b)中設(shè)計的標(biāo)簽如SEQ ID N0:l-95所示。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用PCR-FREE方法，給PCR產(chǎn)物文庫加上接頭，例如使 用DNA連接酶。特別地，在本發(fā)明的方法中，由于不同HPV類型之間的DNA序列高度相似， 因此，本發(fā)明的測序文庫的構(gòu)建必須通過PCR-FREE方法來完成。相反，如果通過采用常規(guī)的pooling PCR將接頭連接至PCR產(chǎn)物上來構(gòu)建測序文庫，那么所得到的文庫中將含有大 量的與原模板不一致的產(chǎn)物，導(dǎo)致不能對原模板進(jìn)行準(zhǔn)確測序。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中， 使用的接頭的數(shù)目為至少1種，優(yōu)選至少2種、至少10種、至少20種、至少30種、至少40 種、至少50種、至少100種或至少200種，例如所述接頭可具有選自SEQID NO :121_132的 序列。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，接頭是可商購獲得的接頭，例如可購自 IIlumina公司的PCR-free Index Adapter Oligo Mix。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明也可 使用下列PCR-free接頭(下劃線部分為接頭的特征序列)。PCR-free 接頭 1 (SEQ ID NO: 121) =ATCACG5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 2 (SEQ ID NO 122) =CGATGT5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 3 (SEQ ID NO 123) =TTAGGC5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACTTAGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 4 (SEQ ID NO: 124) =TGACCA5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACTGACCMTCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 5 (SEQ ID NO 125) =ACAGTG5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 6 (SEQ ID NO: 126) =GCCAAT5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACGCCMTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 7 (SEQ ID NO 127) =CAGATC5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACCAGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 8 (SEQ ID NO: 128) =ACTTGA5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACACTTGMTCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 9 (SEQ ID NO: 129) =GATCAG5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACGATCAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 10 (SEQ ID NO: 130) =TAGCTT5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACTAGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 11 (SEQ ID NO 131) =GGCTAC5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACGGCTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 12 (SEQ ID NO: 132) =CTTGTA5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACCTTGTMTCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用Solexa測序儀(例如，Illumina Genome Analyzer IIx測序儀)進(jìn)行Solexa測序法。在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，HPV數(shù) 據(jù)庫包含本領(lǐng)域已知的HPV類型的序列，所述序列例如可見于例如公共數(shù)據(jù)庫，例如NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，樣品可以是脫落細(xì)胞。在另一個優(yōu)選實(shí) 施方案中，樣品可以來源于動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。發(fā)明的有益效果
本發(fā)明的新型的HPV檢測方法和用于此的試劑盒相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下有利方面。1)高通量。通過使用標(biāo)簽與具有不同特征序列的接頭，進(jìn)行一次本發(fā)明的方法，可 檢測甚至10000份樣品，從而本發(fā)明的方法可以廣泛用于疾病普查工作，成為早期診斷疾 病的有效手段。2)低成本。本發(fā)明采用Solexa測序法進(jìn)行測序，測序成本大大降低(僅為常規(guī)測 序法的)，從而HPV檢測成本大大降低。3)可對HPV進(jìn)行精確分型。通過使用多條引物(例如本發(fā)明的6條正向引物和5 條反向引物)進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物的序列信息與HPV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可以精確地確定 HPV的類型，從而為臨床診斷和治療方案選擇提供依據(jù)。另外，使用本發(fā)明的方法還有利于發(fā)現(xiàn)新的HPV類型，包括已有的類型中的新的 亞型和變異體，為科學(xué)研究提供更有效和方便的工具。下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人 員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖 和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 將變得顯然。


圖1為經(jīng)標(biāo)簽和具有獨(dú)特的特征序列的接頭標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物的示意圖。在本 發(fā)明的示例性方法中，通過PCR在每個樣品的PCR產(chǎn)物兩端同時引入標(biāo)簽；把多個帶有不 同標(biāo)簽的PCR產(chǎn)物混合在一起，用于構(gòu)建測序文庫。在測序文庫的構(gòu)建過程中，當(dāng)需要時， 可以構(gòu)建多個測序文庫時，其中通過使用具有不同特征序列的接頭，來標(biāo)記各個測序文庫。 文庫構(gòu)建完畢后，經(jīng)具有不同特征序列的接頭標(biāo)記的多個測序文庫可以混合在一起，并用 Solexa測序法進(jìn)行同時測序(不同的測序文庫之間所使用的標(biāo)簽可以相同或不同)。最 后，根據(jù)測序結(jié)果中的接頭的特征序列和標(biāo)簽的序列信息，可將測序結(jié)果與每個樣品一一 對應(yīng)。圖2為部分PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。從電泳圖上可觀察到，PCR產(chǎn)物條帶 的大小為約170bp。其中，泳道M是50bp DNA分子梯，泳道1_14為隨機(jī)挑選的HPV陽性樣 本的PCR產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式采用本發(fā)明的方法，對190份已知HC-II結(jié)果的樣品進(jìn)行HPV基因分型，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)采用本發(fā)明的方法所得的結(jié)果不僅與已知的HC-II結(jié)果一致，而且實(shí)現(xiàn)了對HPV的精確 分型。實(shí)施例1 樣品提取根據(jù)廠商的說明書，使用KingFisher自動提取儀(美國ThermoSc ientific Kingfisher Flex全自動磁珠提取純化系統(tǒng))從190份已知HC-II結(jié)果的脫落細(xì)胞中提取 DNA。使用程序“BioeaSy-200l·! 1 BloodDNA-KF. msz”，進(jìn)行核酸提取。程序結(jié)束后，獲得 100 μ 1左右的洗脫產(chǎn)物(提取的DNA)，用作下一步PCR擴(kuò)增中的模板。
實(shí)施例2 =PCR擴(kuò)增把實(shí)施例1中獲得的190份DNA依次編號為1_190，并平均分為2組(HPV-1組編 號1-95 ；HPV-2組編號96-190)。根據(jù)用于擴(kuò)增HPV DNA的引物組(包括6條正向引物和 5條反向引物)的各條引物的序列(表2，SEQ ID N0:96-107)，設(shè)計一套標(biāo)簽，共95個(表 1, SEQ ID N0:l-95)。將設(shè)計的每一個標(biāo)簽分別添加至引物組的各條引物的序列的5'末 端，從而獲得95個標(biāo)簽引物組，其中每個標(biāo)簽引物組包括相應(yīng)的6條正向標(biāo)簽引物和5條 反向標(biāo)簽引物，并且不同的標(biāo)簽引物組使用不同的標(biāo)簽(即，95個標(biāo)簽引物組與95個標(biāo)簽 --對應(yīng))。在96孔板中對所有樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，共使用2塊板(HPV-1組和HPV-2組各1塊 板)。使用實(shí)施例1中獲得的DNA作為模板，并且在HPV-I組和HPV-2組(各95個樣品) 中，針對每個樣品，使用不同的標(biāo)簽引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增(S卩，95個樣品與95個標(biāo)簽引物組 一一對應(yīng))。記錄下每一個標(biāo)簽引物組(每一個標(biāo)簽)對應(yīng)的樣品的編號信息。每塊板中 還設(shè)置一個不添加模板的陰性對照。2塊板中的陰性對照所用的引物分別與樣品1和樣品 96所用的引物相同。表1 標(biāo)簽與樣品的相關(guān)信息。
表2 未添加標(biāo)簽的用于擴(kuò)增HPV DNA的引物組的各條引物的序列信息。
引物。使用下列PCR參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增95 "C 30 秒一48 "C 30 秒一72 °C 30 秒(40 個循環(huán))72°C 10 分鐘一12°C⑴PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，其組成是(所有試劑均購自Enzymatics公司) PCR反應(yīng)在Bio-Rad公司的PTC-200PCR儀上運(yùn)行。PCR完成后，取3 μ 1 PCR產(chǎn)物 在2. 5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(圖2)。實(shí)施例3 =PCR產(chǎn)物的混合和純化把HPV-I組與HPV-2組中剩余的PCR產(chǎn)物各混合在一個3ml的EP管中(同樣標(biāo) 記為HPV-I組和HPV-2組)，并震蕩混勻。從2管混合物中各取出500 μ 1 DNA,并根據(jù)廠 商的說明書，使用Qiagen DNAPurification試劑盒進(jìn)行過柱純化，得到200 μ 1 DNA。使用 Nanodrop8000 (Thermo Fisher Scientific公司)，測定純化后的混合物的DNA濃度分別為 98ng/ μ 1 (HPV-1 組)和 102ng/ μ 1 (HPV-2 組)。實(shí)施例4 =Solexa測序文庫的構(gòu)建4. 1 末端修復(fù)反應(yīng)使用Thermomixer (Eppendorf公司)，對實(shí)施例3中獲得的經(jīng)純化的兩管DNA混合 物分別進(jìn)行DNA末端修復(fù)反應(yīng)。修復(fù)反應(yīng)的反應(yīng)體系為ΙΟΟμ 1，其組成是(所有試劑均購 自 Enzymatics 公司)
16 反應(yīng)條件為20°C，30分鐘。根據(jù)廠商的說明書，使用QIAquick PCR Purification試劑盒純化并回收DNA末 端修復(fù)反應(yīng)的產(chǎn)物?；厥盏漠a(chǎn)物溶于34μ1 EB(QIAGENElution Buffer)中。4.2:3'末端加A反應(yīng)使用Thermomixer (Eppendorf公司)，對回收的DNA進(jìn)行3'末端加A反應(yīng)。反應(yīng) 體系為50ul，其組成是(所有試劑均購自Enzymatics公司): 反應(yīng)條件為37°C，30分鐘。根據(jù)廠商的說明書，使用MiniElute PCR Purification Kit (QIAGEN公司)純化 并回收3'末端加A反應(yīng)的產(chǎn)物?；厥盏漠a(chǎn)物溶于20μ 1的EB中。4. 3 添力口 Solexa 接頭使用Thermomixer (Eppendorf公司)，對上一步獲得的2種產(chǎn)物分別添加不同的接 頭以構(gòu)建2個測序文庫。記錄下接頭和文庫的對應(yīng)關(guān)系。添加Solexa接頭的反應(yīng)體系為50ul，其組成是(所有試劑均購自Illumina公 司)
反應(yīng)條件為20°C，15分鐘。根據(jù)廠商的說明書,使用Ampure Beads (Beckman CoulterGenomics)純化反應(yīng)產(chǎn) 物并將產(chǎn)物溶于17 μ 1去離子水。使用AgilentBioanalyzer 2100 (Agilent公司)和熒光 定量PCR(QPCR)測定產(chǎn)物的DNA濃度，結(jié)果如下 實(shí)施例5 So Iexa測序以Agilent Bioanalyzer 2100所測濃度為準(zhǔn)，將上一步所得的2種產(chǎn)物等摩爾混 合在一起(各取IOpmol DNA)。根據(jù)廠商的說明書，使用Solexa測序儀(Illumina Genome Analyzer IIx測序儀)，用Solexa PE-75程序進(jìn)行測序。實(shí)施例6 結(jié)果分析根據(jù)測序結(jié)果中的接頭的特征序列以及標(biāo)簽引物(標(biāo)簽部分和引物部分)的序列 的信息，將測序結(jié)果與每個樣品一一對應(yīng)。然后，使用本領(lǐng)域已知的比對程序，例如BLAST 和S0AP，將每個樣品的測序結(jié)果與HPV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而實(shí)現(xiàn)HPV檢測，并對HPV進(jìn)行 精確分型。所得到的檢測結(jié)果與已知的結(jié)果完全一致(參見表3)，表明本發(fā)明方法可以用于 精確檢測樣品中的HPV。表3 :190個樣品的檢測結(jié)果。
18 此外，本發(fā)明的方法還可以對樣品中的HPV進(jìn)行精確分型。表4中提供了圖2所 示的泳道1-14所對應(yīng)的樣品的測序序列和分型結(jié)果。
參考文獻(xiàn)本文中用于舉例說明本發(fā)明或提供關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施的另外的詳細(xì)內(nèi)容的專利、
出版物和其他材料通過引用合并入本文，并且為方便起見按下列文獻(xiàn)目錄提供。[1]. Pectasides D，Kanposioras K，Papaxoinis G et al. Chemotherapy for recurrent cervical cancer. Cancer TreatmentReviews,2008,34(7) :603_613.[2]. Brink, A. A.，P. J. Sni jders, and C. J. Mei jer. HPVdetection methods. Dis. Markers 2007，23 :273_281·[3]. IARC. Handbooks of cancer prevention. Cervix cancer screening [R]. Lyon :IARC Press,2005.[4].Doorbar, J. Molecular biology of human papillomavirusinfection and cervical cancer. Clin. Sci. 2006，110 :525_54L[5].Cox T，Cuzick J. HPV DNA testing in cervical cancerscreening :From evidence to policies.Gyneeol Oncol，2006，103 :8_1L[6]. Kulmala S，syljhen. Human papillomavirus testing withthe hybrid capture assay and PCR as screening tools. ClinMicrobiol,2004,42(6) :2470_2475.[7]. Quai1,M. et al. ,A large genome center's improvementsto the Illumina sequencing system. Nat. Methods，2008，5，1005-1010.[8]. Brown, C. G. et al.，Solexa/Illumina GAPipeline productand product documentation， Illumina Inc,2006.[9].Lozano,R. Successfully integrating humanpapi1lomavirus testing into your practice. Arch. Pathol. LabMed, 2003，127 :991_994.
權(quán)利要求
一組標(biāo)簽，其包含至少10種，優(yōu)選至少20種、至少30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或95種標(biāo)簽，所述標(biāo)簽具有選自SEQ ID NO1 95的序列，并且優(yōu)選所述標(biāo)簽用于標(biāo)記SEQ ID NO96 106所示的PCR引物；優(yōu)選該組標(biāo)簽至少包括SEQ ID NO1 10，或SEQ ID NO11 20，或SEQ ID NO21 20，或SEQ ID NO31 40，或SEQ ID NO41 50，或SEQ ID NO51 60，或SEQ ID NO61 70，或SEQ ID NO71 80，或SEQ ID NO81 90，或SEQ ID NO91 95所示的標(biāo)簽，或者其任何兩個或者多個的組合。
2.權(quán)利要求1的一組標(biāo)簽用于進(jìn)行高通量HPV測序、檢測或分型的用途，優(yōu)選其用于標(biāo) 記SEQ ID NO 96-106所示的PCR引物。
3.一種標(biāo)簽引物組，其包含11種標(biāo)簽引物，所述標(biāo)簽引物的序列包含標(biāo)簽序列和PCR 引物序列，并且所述標(biāo)簽序列，任選地通過連接序列，連接至所述PCR引物序列的5'端，其 中1)所述標(biāo)簽序列選自SEQID NO :1-95，并且所述11種標(biāo)簽引物的每一種的標(biāo)簽序列 都相同，和2)所述11種標(biāo)簽引物的PCR引物序列分別如SEQID NO :96_106所示。
4.權(quán)利要求3的標(biāo)簽引物組的用途，其用于HPV測序、檢測或分型，或用于制備試劑盒， 所述試劑盒用于HPV測序、檢測或分型。
5.一種標(biāo)簽引物套組，其包含至少10個，優(yōu)選至少20個、至少30個、至少40個、至少 50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或95個權(quán)利要求3的標(biāo)簽引物組，其中， 每個標(biāo)簽引物組所使用的標(biāo)簽序列互不相同，優(yōu)選所使用的標(biāo)簽序列至少包括SEQ ID NO 1-10，或 SEQ ID NO :11-20，或SEQ ID NO :21_20，或 SEQ ID NO :31_40，或 SEQ ID NO :41_50， 或 SEQ ID NO :51-60，或 SEQ ID NO :61_70，或 SEQ ID NO :71_80，或 SEQ ID N0:81_90，或 SEQ ID NO :91-95所示的標(biāo)簽序列，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合。
6.權(quán)利要求5的標(biāo)簽引物套組的用途，其用于高通量HPV測序、檢測或分型，或用于制 備診斷試劑盒，所述試劑盒用于高通量HPV測序、檢測或分型。
7.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求3的標(biāo)簽引物組或權(quán)利要求5的標(biāo)簽引物套組，并且 優(yōu)選還包含至少1種，優(yōu)選至少2種、至少10種、至少20種、至少30種、至少40種、至少50 種、至少100種或至少200種接頭，優(yōu)選所述接頭適用于Solexa測序法，例如適用于構(gòu)建測 序文庫，例如所述接頭可具有選自SEQ ID NO 121-132的序列。
8.權(quán)利要求7的試劑盒用于高通量HPV測序、檢測或分型的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)的檢測方法，特別是基于Solexa測序法的HPV檢測方法。
文檔編號C12Q1/70GK101921748SQ20101021373
公開日2010年12月22日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者劉濤, 徐佳佳, 易鑫 申請人:深圳華大基因科技有限公司