專利名稱：用于合成脂肪醇的構(gòu)建體，載體，藍(lán)細(xì)菌，以 及在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)脂肪醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開(kāi)涉及可再生能源領(lǐng)域和生物質(zhì)能源領(lǐng)域。具體而言，本公開(kāi)涉及用于在藍(lán)細(xì)菌中合成脂肪醇的構(gòu)建體，包含所述構(gòu)建體的載體，包含所述構(gòu)建體或用所述載體轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌，以及在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)脂肪醇的方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，能源問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題正逐步凸顯成為制約我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。可再生生物燃料的應(yīng)用被認(rèn)為是解決這兩大問(wèn)題的有效方式。制備生物乙醇的技術(shù)路線相對(duì)成熟，是相對(duì)容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的一種生物燃料；但是乙醇作為燃料，存在著一些缺陷(1)能量密度低；( 容易揮發(fā)；C3)其易溶于水所導(dǎo)致的一些問(wèn)題，如發(fā)酵過(guò)程中對(duì)微生物毒性的增加、蒸餾分離過(guò)程中除去水相的成本過(guò)高以及運(yùn)輸過(guò)程中對(duì)管道的腐蝕。而理想的生物燃料應(yīng)具備高能量密度、低吸濕性、低揮發(fā)性等特點(diǎn)，并且具有能與現(xiàn)存發(fā)動(dòng)機(jī)設(shè)備和運(yùn)輸設(shè)施相兼容等的性能。最近，長(zhǎng)鏈脂肪醇、長(zhǎng)鏈生物烴等優(yōu)質(zhì)脂肪酸類生物燃料，引起了學(xué)術(shù)界與企業(yè)界越來(lái)越多的重視。著名合成生物學(xué)家Jay D Keasling教授的針對(duì)這類生物燃料的研究現(xiàn)狀及前景撰寫(xiě)過(guò)綜述(Lee，S.K.等人，2008)；而且近期Nature雜志報(bào)道了 JayD Keasling教授及其合作者的最新研究成果通過(guò)代謝工程手段成功實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中合成脂肪醇和蠟脂等脂肪酸類生物燃料6teen，E. J.等人，2010)。美國(guó)著名的生物燃料公司LS9也致力于通過(guò)基因工程改造在大腸桿菌與釀酒酵母等微生物中生產(chǎn)這類新一代的生物燃料(KeaSling，J.D.等人，2007)。因此，開(kāi)展脂肪酸類生物燃料分子的生物合成與代謝調(diào)控研究，對(duì)于提高生物燃料的品質(zhì)和產(chǎn)量、推動(dòng)生物燃料的應(yīng)用以及應(yīng)對(duì)能源和環(huán)境問(wèn)題日益突出的現(xiàn)狀具有重要意義。目前用于生物燃料研究的微生物體系主要是以大腸桿菌和釀酒酵母為代表的異養(yǎng)微生物。藍(lán)細(xì)菌，作為新一代能源微生物系統(tǒng)正受到越來(lái)越多的關(guān)注(Angermayr，
5.Α.等人，2009)。在2009年中，國(guó)內(nèi)外幾個(gè)研究小組相繼在利用藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)生物燃料方面取得突破中國(guó)石油大學(xué)的傅鵬程教授將來(lái)源于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis) 的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶基因在集胞藻PCC6803中共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了太陽(yáng)能到生物乙醇的轉(zhuǎn)化(產(chǎn)量為5. 2mmol/OD730/L/d) (Dexter J.和Fu，P.，2009)；美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校AnastasiosMelis教授的研究小組通過(guò)在集胞藻PCC6803中外源表達(dá)山葛(Pueraria montana)的異戊二烯合成酶基因，實(shí)現(xiàn)了在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)異戊二烯(產(chǎn)量為50mg/g/d) (Lindberg, P.等人，2009)；加州大學(xué)洛杉磯分校James C Liao教授也發(fā)表了他們最新的研究成果通過(guò)基因工程手段實(shí)現(xiàn)了在聚球藻PCC7942中高效生產(chǎn)異丁醛(最高產(chǎn)量為
6,230 μ g/L/h) (Atsumi, S.等人，2009)，這項(xiàng)成果發(fā)表在 NatureBiotechnology 雜志上。 2010年3月四日，PNAS雜志報(bào)道了美國(guó)亞歷桑那州立大學(xué)的一項(xiàng)最新的研究成果，即在集胞藻PCC6803中生產(chǎn)和分泌游離脂肪酸(Liu，X.等人，2010)。藍(lán)細(xì)菌(也稱為藍(lán)藻) 是一類能夠進(jìn)行植物型產(chǎn)氧光合作用的原核微生物，它作為新一代能源微生物系統(tǒng)具有如下優(yōu)勢(shì)(1)藍(lán)細(xì)菌能夠吸收太陽(yáng)能、固定二氧化碳作為碳源進(jìn)行自養(yǎng)生長(zhǎng)，培養(yǎng)成本低； (2)藍(lán)細(xì)菌是一類古老的微生物，已在地球上存在了幾十億年，它們對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速；(3)藍(lán)細(xì)菌遺傳操作方便，遺傳背景清晰，許多種類的基因組測(cè)序工作也已經(jīng)陸續(xù)完成，這使得利用基因工程手段改造藍(lán)細(xì)菌非常方便。其中，集胞藻(Synechocystis sp.) PCC6803是單細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌的代表物種，其全基因組測(cè)序于1996年完成，是最早完成全基因組測(cè)序的光合生物，也是目前研究最多的藍(lán)細(xì)菌之一，被認(rèn)為是生物燃料合成方面研究的理想的模式物種之一(Angermayr，S. Α.等人，2009)。所以，以集胞藻PCC6803為研究對(duì)象開(kāi)展藍(lán)細(xì)菌合成脂肪酸類生物燃料方面的基礎(chǔ)研究，對(duì)于開(kāi)發(fā)藍(lán)細(xì)菌作為新一代能源微生物系統(tǒng)和加快推進(jìn)生物燃料應(yīng)用具有重要意義。本發(fā)明人首次成功地在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)出了脂肪醇。

發(fā)明內(nèi)容
相關(guān)術(shù)語(yǔ)藍(lán)細(xì)菌(也稱為藍(lán)藻)是一類光合自養(yǎng)的原核微生物，其能夠利用太陽(yáng)能，固定二氧化碳。脂肪酰輔酶A還原酶(Fatty acyl-CoA reductase)是能夠催化由脂肪酰輔酶A 轉(zhuǎn)化為脂肪醇的反應(yīng)的酶。1,5- 二憐酸核麗糖幾化醇 / 力口氧醇(Ribulose-1，5_bisphosphatecarboxylase/ oxygenase,Rubisco)催化光合作用中卡爾文循環(huán)的第一個(gè)反應(yīng)。它由大小兩個(gè)亞基組成； 在集胞藻PCC6803基因組中，編碼這兩個(gè)亞基的基因位于同一個(gè)操縱子。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將它們的啟動(dòng)子(本發(fā)明的實(shí)施方案中表示為PriJ克隆用于驅(qū)動(dòng)脂肪酰輔酶A羧化酶基因在藍(lán)細(xì)菌中的表達(dá)，其具體序列見(jiàn)SEQ ID NO :3。質(zhì)體藍(lán)素(Plastocyanin，PC)是光合作用中將電子由細(xì)胞色素M/f復(fù)合體傳遞到光系統(tǒng)I的電子載體，其編碼基因?yàn)閜etE。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將它的啟動(dòng)子(本發(fā)明的實(shí)施方案中表示為PprtE)克隆用于驅(qū)動(dòng)脂肪酰輔酶A羧化酶基因在藍(lán)細(xì)菌中的表達(dá)，其具體序列為見(jiàn)SEQ ID NO :5οslr0168基因是集胞藻PCC6803基因組中編碼一個(gè)未知功能蛋白的基因。前人的研究證明該基因的缺失對(duì)于細(xì)胞的生理活動(dòng)沒(méi)有影響，所以該基因所在的位置被認(rèn)為是集胞藻PCC6803基因組中的一個(gè)中性位點(diǎn)(netural site)。本發(fā)明的實(shí)施方案就是通過(guò)在該位點(diǎn)通過(guò)同源重組來(lái)整合包括啟動(dòng)子以及脂肪酰輔酶A還原酶基因，從而實(shí)現(xiàn)在集胞藻 PCC6803中表達(dá)外源脂肪酰輔酶A還原酶。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，載體(vector)是指能夠?qū)NA片段(目的基因)轉(zhuǎn)移到受者細(xì)胞中的一種自我復(fù)制的DNA分子。“雜交”表示這樣一個(gè)過(guò)程在該過(guò)程中，于合適的條件下，兩條核酸序列以穩(wěn)定且特異的氫鍵相互結(jié)合以致形成雙鏈。這些氫鍵在互補(bǔ)堿基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之間(則這稱為A-T鍵)或在互補(bǔ)堿基鳥(niǎo)嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之間(則這稱為G-C鍵)形成。兩條核酸序列的雜交可以是全部的(則稱為互補(bǔ)序列)，即在該雜交過(guò)程中獲得的雙鏈僅包含A-T鍵和C-G鍵。這種雜交可以是部分的(則稱為足夠互補(bǔ)的序列)，即獲得的雙鏈包含允許形成雙鏈的A-T鍵和C-G鍵，但還包含未與互補(bǔ)堿基結(jié)合的堿
4基。兩條互補(bǔ)序列或足夠互補(bǔ)的序列之間的雜交取決于所使用的操作條件，并且特別是嚴(yán)緊性。嚴(yán)緊性特別是根據(jù)兩條核酸序列的堿基組成來(lái)定義，以及通過(guò)這兩條核酸序列之間的錯(cuò)配程度來(lái)定義。嚴(yán)緊性還可以取決于反應(yīng)參數(shù)，例如存在于雜交溶液中的離子種類的濃度和類型，變性劑的性質(zhì)和濃度，和/或雜交溫度。所有這些數(shù)據(jù)是所熟知的，并且合適的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)確定。如本領(lǐng)域已知的，核酸序列彼此雜交的條件可以被描述為從低到高嚴(yán)緊性的范圍。在此處提及低嚴(yán)緊雜交條件時(shí)，包括至少大約0%到至少大約15% ν/ν甲酰胺，以及用于雜交的至少大約IM到至少大約2Μ的鹽，和用于洗滌條件的至少大約IM到至少大約 2Μ的鹽。一般地，低嚴(yán)緊雜交條件的溫度為大約25-30°C到大約42°C。在此處提及中等嚴(yán)緊雜交條件時(shí)，包括至少大約16% ν/ν到至少大約30% ν/ν的甲酰胺，以及用于雜交的至少大約0. 5Μ到至少大約0. 9Μ的鹽，和用于洗滌條件的至少大約0. 5Μ到至少大約0. 9Μ的鹽。在此處提及高嚴(yán)緊雜交條件時(shí)，包括至少大約31% ν/ν到至少大約50% ν/ν的甲酰胺，以及用于雜交的至少大約0. OlM到至少大約0. 15Μ的鹽，和用于洗滌條件的至少大約 0. OlM到至少大約0. 15Μ的鹽。一般地，洗滌在下列條件下進(jìn)行Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) % (Marmur和Doty，J. Mol. Biol. 5 109，1962)。但是，每增加1 %的錯(cuò)配堿基對(duì)數(shù)目，雙鏈體 DNA 的 Tm 下降 1°C (Bonner 和 Laskey，Eur. J. Biochem. 46 :83，1974)。在這些雜交條件中甲酰胺是可選的。因此，特別優(yōu)選的嚴(yán)緊雜交條件如下確定低嚴(yán)緊雜交條件是6xSSC緩沖液，1. 0% w/vSDS,在25-42°C下；中等嚴(yán)緊雜交條件是hSSC緩沖液，1. 0% w/vSDS，在 20°C至65°C的溫度下；高嚴(yán)緊雜交條件是0. IxSSC緩沖液，0. 1% w/v SDS，在至少65°C的溫度下。關(guān)于核酸的雜交的詳盡指導(dǎo)可見(jiàn)于Ti jssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第 1 部分，第 2 章(Elsevier，New York)；和 Ausubel 等人，編輯(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology,第 2 章(Greene Publishing andffiley-Interscience,New York)。還可參見(jiàn) Sambrook 等人，(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, New York)?！巴恍裕?，或“同一性百分比，，是指兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核酸序列之間的序列同一性。為確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的同一性百分?jǐn)?shù)，以最佳比較目的對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是由這些序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù) (艮P，同一性百分?jǐn)?shù)=相同位置的數(shù)目/位置的總數(shù)(例如，重疊位置)X100)。例如，“同一性百分比”通過(guò)下列方式來(lái)計(jì)算在比較窗中比較兩個(gè)經(jīng)最佳比對(duì)的序列，測(cè)定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核苷酸堿基或相同氨基酸殘基的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗中位置的總數(shù)目(即，窗的大小)，并且將結(jié)果乘以100從而產(chǎn)生序列同一性百分比。用于比較的序列的最佳比對(duì)可以通過(guò)下述來(lái)進(jìn)行例如，Smith和 Waterman (Adv. App 1. Math. 2 :482,1970)的局部同源性算法；Needleman 和 mmsch(J. Mol. Biol. 48 443,1970)的同源性比對(duì)算法；Pearson 和 Lipman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444,1988)的相似性搜索方法；這些算法的計(jì)算機(jī)化實(shí)施(例如，Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575Science Dr. , Madison, Wis.中的 GAP、 BESTFIT、FASTA、BLAST P,BLAST N和TFASTA)；或手工比對(duì)和目測(cè)檢查(參見(jiàn)，例如Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology (1995 ±曾干Ij ))。
本發(fā)明的實(shí)施方案所涉及的同一性百分比包括至少大約60%，或至少大約65%， 或至少大約70 %，或至少大約75 %，或至少大約80 %，或至少大約85 %，或至少大約90 %， 或更高，例如大約95%，或大約96%，或大約97%，或大約98%，或大約99%，例如至少大約 60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案的一個(gè)目的就是要在藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)構(gòu)建一條合成脂肪醇的途徑， 實(shí)現(xiàn)脂肪醇在微生物體內(nèi)的合成。本發(fā)明的實(shí)施方案是利用在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)脂肪酰輔酶A還原酶在藍(lán)細(xì)菌中表達(dá)，利用藍(lán)細(xì)菌光合生物的特點(diǎn)，吸收太陽(yáng)能固定二氧化碳，合成脂肪醇作為生物燃料。本發(fā)明的實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在光合微生物藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)利用太陽(yáng)能固定二氧化碳合成脂肪醇，合成脂肪醇的能量來(lái)自于太陽(yáng)能，碳源來(lái)自于二氧化碳。因此，利用這一技術(shù)制備的生物燃料不會(huì)受到原料不足的制約，使用這種生物燃料不會(huì)增加碳排放，是真正的零排放生物燃料。在一個(gè)方面，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于在藍(lán)細(xì)菌中合成脂肪醇的構(gòu)建體，其可以包含有在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子，以及處于該啟動(dòng)子控制之下的脂肪酰輔酶A還原酶基因。進(jìn)一步地，所述構(gòu)建體還可以包含有處于所述在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子上游的用于篩選藍(lán)細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因。進(jìn)一步地，所述構(gòu)建體還可以在兩端具有集胞藻PCC6803的slr0168基因的N-末端序列和C-末端序列，以用于同源重組。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子可以選自P*啟動(dòng)子和
1 petE 啟動(dòng)子。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂肪酰輔酶A還原酶基因可以為選自下列的基因來(lái)源于荷荷芭的far基因，其例如顯示在SEQ IDNO :1中；和來(lái)源于擬南芥的at3gll980 基因，其例如顯示在SEQ IDNO :2中。所述脂肪酰輔酶A還原酶基因還可以為來(lái)源于小鼠的向rl基因(例如參見(jiàn)NCBI ID :BC007178)；密碼子經(jīng)過(guò)優(yōu)化的來(lái)源于小鼠的farl基因； 來(lái)源于小鼠的far2基因(例如參見(jiàn)NCBI ID :BC055759)；或來(lái)源于擬南芥的at3g56700 基因。其他合適的脂肪酰輔酶A還原酶基因還包括來(lái)自弗蘭克氏菌(Frankia sp.) CcI3 的 Francci3_2276(例如參見(jiàn) NC_007777)；來(lái)自嗜根庫(kù)克菌(Kocuriarhizophila) DC2201 的 KRH_18580 (例如參見(jiàn) NC_010617)；來(lái)自海洋放線細(xì)菌(Actinobacterium) PHSC20C1 的 A20C1_04336(例如參見(jiàn) NZ_AA0B01000003)；來(lái)自 Hahella chejuensis KCTC 2396 的 HCH_05075(例如參見(jiàn) NC_007645)；來(lái)自水油海桿菌(Marinobacteraquaeolei) VT8 的 Maqu_2220 (例如參見(jiàn) NC_008740)；和來(lái)自海洋桿菌(Oceanobacter sp. ) RED65 的 RED65_09889(例如參見(jiàn)NZ_AAQH01000001)。另外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中還可以使用與上面所列基因具有至少80%同一性，優(yōu)選地至少85%同一性，更優(yōu)選地至少90%同一性，更加優(yōu)選地至少95%同一性，最優(yōu)選地至少99 %同一性，并且編碼具有脂肪酰輔酶A還原酶活性的蛋白質(zhì)的基因；或者與上面所列基因在嚴(yán)緊雜交條件，優(yōu)選高嚴(yán)緊雜交條件下雜交， 并且編碼具有脂肪酰輔酶A還原酶活性的蛋白質(zhì)的基因。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述標(biāo)記基因?yàn)閴延^霉素抗性基因Omega片段，其例如顯示在SEQ ID NO :8中。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藍(lán)細(xì)菌為集胞藻PCC6803。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的實(shí)施方案可以涉及載體，其包含上面所定義的構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述載體選自下列質(zhì)粒質(zhì)粒PXT14，其于2010年6月觀日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC 3948，以在大腸桿菌中的形式(Eco_XT14)，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)；質(zhì)粒pXT34，其于2010年6月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC 3950，以在大腸桿菌中的形式 (Eco-XT34)，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)；和質(zhì)粒pXT51，其于2010年 6月觀日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC 3949， 以在大腸桿菌中的形式(ECO-XT51)，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明的實(shí)施方案可以涉及包含上面所定義的構(gòu)建體的藍(lán)細(xì)菌，或者用上面所定義的載體轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌。優(yōu)選地，所述藍(lán)細(xì)菌選自于2010年6月10 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的集胞藻Syn-XT14，其保藏號(hào)為 CGMCC3894，分類命名為集胞藻(Synechocystis sp.)；于2010年6月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的集胞藻Syn-XT34，其保藏號(hào)為CGMCC 3895，分類命名為集胞藻(Synechocystis sp.)；和于2010年6月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的集胞藻Syn-XT51，其保藏號(hào)為CGMCC 3896，分類命名為集胞藻(Synechocystis sp.)。在另外一個(gè)方面，本發(fā)明的實(shí)施方案可以涉及在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)脂肪醇的方法，所述方法包括在適合于合成脂肪醇的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的藍(lán)細(xì)菌；和從所獲得的培養(yǎng)物中提取所需的脂肪醇。通過(guò)本發(fā)明的實(shí)施方案，成功地在藍(lán)細(xì)菌中產(chǎn)生了脂肪醇，更確切地說(shuō)為長(zhǎng)鏈脂肪醇，例如1-十六烷醇和1-十八烷醇。


圖1為質(zhì)粒pFQ9R的基本結(jié)構(gòu)。在集胞藻PCC6803的slr0168基因上下游片段之間有壯觀霉素抗性基因Omega片段、Prbc啟動(dòng)子和終止子TA。；啟動(dòng)子和終止子之間有^CbaI 和SmaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。圖2為質(zhì)粒pXT14的基本結(jié)構(gòu)。其是通過(guò)將來(lái)源于荷荷芭(Simmondsia chinensis)的 far 基因(far _jojoba) (SEQ ID NO :1)克隆到質(zhì)粒 pFQ9R 中而獲得的。圖3為質(zhì)粒pXT37a的基本結(jié)構(gòu)。在集胞藻PCC6803的slr0168基因上下游片段之間有壯觀霉素抗性基因Omega片段、PpetE啟動(dòng)子和IacZ基因；在IacZ基因兩端有NdeI 和EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。圖4為質(zhì)粒pXT37b的基本結(jié)構(gòu)。pXT37b與pXT37a類似，只是由Omega片段、PpetE 啟動(dòng)子和IacZ基因組成的片段的插入方向與pXT37a相反。
圖5為質(zhì)粒pXT34的基本結(jié)構(gòu)。其是通過(guò)將來(lái)源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)的at3gll980基因(SEQ ID NO 2)克隆到質(zhì)粒pXT37a中而獲得的，其中所述 at3gll980基因位于PpetE啟動(dòng)子的下游。圖6為質(zhì)粒pXT51的基本結(jié)構(gòu)。其是通過(guò)將來(lái)源于荷荷芭的far基因(far_ jojoba) (SEQ ID NO :1)克隆到質(zhì)粒pXT37b中而獲得的，其中所述far基因位于PpetE啟動(dòng)子的下游。圖7為質(zhì)粒pLY2的基本結(jié)構(gòu)。其是通過(guò)在集胞藻PCC6803的slr0168基因上下游片段之間插入壯觀霉素抗性基因Omega片段，并將整個(gè)構(gòu)建物克隆到pUC9載體上而獲得的。圖8為基因工程藻株Syn_LY2在培養(yǎng)8天后，其細(xì)胞中脂肪醇的生產(chǎn)情況(氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果)。其中，C15-0H表示1-十五烷醇(用作內(nèi)標(biāo))；C16-0H表示1-十六烷醇； C18-0H表示1-十八烷醇。圖9為基因工程藻株Syn-XTH在培養(yǎng)8天后，其細(xì)胞中脂肪醇的生產(chǎn)情況(氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果)。其中，C15-0H表示1-十五烷醇(用作內(nèi)標(biāo))；C16-0H表示1-十六烷醇； C18-0H表示1-十八烷醇。圖10為基因工程藻株Syn_XT34在培養(yǎng)8天后，其細(xì)胞中脂肪醇的生產(chǎn)情況(氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果)。其中，C15-0H表示1-十五烷醇(用作內(nèi)標(biāo))；C16-0H表示1-十六烷醇；C18-0H表示1-十八烷醇。圖11為基因工程藻株Syn_XT51在培養(yǎng)8天后，其細(xì)胞中脂肪醇的生產(chǎn)情況(氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)結(jié)果)。其中，C15-0H表示1-十五烷醇(用作內(nèi)標(biāo))；C16-0H表示1-十六烷醇；C18-0H表示1-十八烷醇。圖12為柱式光反應(yīng)器培養(yǎng)基因工程藻株的實(shí)物照片。序列表信息SEQ ID NO=I 來(lái)源于荷荷芭(Simmondsia chinensis)的脂肪酰輔酶A還原酶基因序列(人工合成基因)。SEQ ID NO :2 根據(jù)擬南芥(Arabidopsis thaliana)的 at3gll980 基因序列人工合成的序列。SEQ ID NO :3 來(lái)源于集胞藻PCC6803的1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶大亞基基因 rbcL上游的啟動(dòng)子片段Prbc的序列(NCBI ID :NC_000911)。SEQ ID NO 4 來(lái)源于集胞藻PCC6803的1，5_ 二磷酸核酮糖羧化酶操縱子下游的終止子片段Irte的序列(NCBI ID :NC_000911)。SEQ ID NO 5 來(lái)源于集胞藻PCC6803的質(zhì)體藍(lán)素基因petE基因上游的啟動(dòng)子片 gPpetE 的序列(NCBI ID :NC_000911)。SEQ ID NO 6 來(lái)源于集胞藻PCC6803的slr0168基因的N-末端序列(也包括一部分基因上游序列)(NCBI ID :NC_000911)。SEQ ID NO :7 :來(lái)源于集胞藻PCC6803的slr0168基因的C-末端序列(也包括一部分基因下游序列)(NCBI ID :NC_000911)。SEQ ID NO :8 質(zhì)粒 pRL57 上克隆的 Omega 片段序列(NCBI ID :L05082)。SEQ ID NO :9 質(zhì)粒 pHB1567 上克隆的 IacZ 基因序列(NCBI ID :AP009048)。SEQ ID NO :10 引物 alrl524_l 的序列。
SEQIDNO11引物alrl524-2的序列。
SEQIDNO12引物Pl的序列。
SEQIDNO13引物P2的序列。
SEQIDNO:14 引物Ρ3的序列。
SEQIDNO15引物P4的序列。
SEQIDNO16引物XP-I的序列。
SEQIDNO17引物XP-2的序列。
SEQIDNO18引物XP-3的序列。
SEQIDNO19引物XP-4的序列。
SEQIDNO20引物lacZ-ml的序列。
SEQIDNO21引物lacZ-m2的序列。
SEQIDNO22引物lacZ-m3的序列。
SEQIDNO23引物M13-Rev的序列。
SEQIDNO:24 引物far-Ι的序列。
SEQIDNO25引物far-2的序列。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 構(gòu)建用于轉(zhuǎn)化藍(lán)細(xì)菌的載體1、質(zhì)粒pFQ9R的構(gòu)建以 alrl524-l(5，-ACCTCCAGCCATTAGCGAAAC-3，)和 air 1524-2 (5，-CTCTCACAAT TGCCCTACCT-3，)為引物對(duì)，以魚(yú)腥藻PCC7120基因組為模板進(jìn)行PCR，并將PCR產(chǎn)物克隆到 PMD18-T 載體(Takara, Catalog No. :D101A)中，從而得到質(zhì)粒 pQLl。用 DraI (Takara， Catalog No. :D1037A)酶切質(zhì)粒pRL57 (Cai Y.等人，1990)，回收約 1. 9kb 的 Omega片段。將質(zhì)粒 pQLl 經(jīng)PstI (Takara，CatalogNo. :D1073A)酶切，T4 DNA聚合酶(Fermentas, Catalog No. :EP0061)補(bǔ)平。將兩片段相連得到質(zhì)粒 pQL4。以 Pl (5，- GCGTCGACTCACCATTTGGACAAA ACATCAGG-3，)和 P2(5，-GCTCTAGACATCTAGGTCAGTCCTCCATAAACATTG-3，)為引物對(duì)，以集胞藻PCC6803基因組為模板進(jìn)行PCR，將PCR片段克隆到pMD18_T載體中，得到質(zhì)粒pFQl ；以 P3(5，-CCCCCGGGGTTACAGTTTTGGCAATTACT -3，)和 P4(5，-CGAGCTCTTCCCCACTTAGATAAAAAA TCCG-3，)為引物對(duì)，以集胞藻PCC6803基因組為模板進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物克隆到pMDIS-T 載體中，得到質(zhì)粒 PFQ2。以 Sail (Takara，Catalog No. :D1080A)和 XbaI (Takara，Catalog No. :D1093A)從質(zhì)粒 pFQl 上切下 Prte 片段；以)(mal (New England BioLabs, Catalog No. R0180S)和 SacI (Takara, Catalog No. :D1078A)從質(zhì)粒 pFQ2 上切下 Trbc 片段；將 Prbc 和 Trbc插入到質(zhì)粒pQL4的相應(yīng)位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pFQ6。質(zhì)粒pKWl 188 (Williams J. G. K.，1988) 經(jīng)EcoRI酶切自連，再經(jīng)XmaI酶切補(bǔ)平，再自連得到質(zhì)粒pKW1188SL。以HindIII (Takara, Catalog No. :D1060A)和 EcoRI (Takara, Catalog No. :D1040A)酶切質(zhì)粒 pFQ6,回收 0mega+Prbc+Trbc片段；以EcoRI酶切質(zhì)粒pKW1188SL ；將兩個(gè)片段連接得到質(zhì)粒pFQ9R。2、質(zhì)粒 pXT37a 和 pXT37b 的構(gòu)建質(zhì)粒pHB1567(高宏等人，2007)經(jīng))(bal酶切，回收5. 41Λ片段，自連得到質(zhì)粒 PXT24。質(zhì)粒 ρΧΤ24 經(jīng) NdeI (Takara，Catalog No. :D1161A)酶切，T4 DNA 聚合酶補(bǔ)平，自
9連；再經(jīng)EcoRI酶切，T4 DNA聚合酶補(bǔ)平，自連得到質(zhì)粒pXT2^。以質(zhì)粒pHB1536 (高宏等人，2007)為模板，分別以 XP-I (5，-AGTGGTTCGCATCCTCGG-3，)和 ΧΡ-2 (5，-ATGAATCCTTAATC GGTACCAAATAAAAAAGGGGACCTCTAGG-3 ’)以及 ΧΡ-3 (5 ’ -CCCTTTTTTATTTGGTACCGATTAAGGATTCA TAGCGGTTGCC-3，)和 ΧΡ-4 (5 ‘ -CCAGTGAATCCGTAATCATGGT-3 ‘)為引物對(duì)進(jìn)行 PCR，PCR 產(chǎn)物回收后，經(jīng)變性、退火和延伸；再以其為模板，以XP-I和ΧΡ-4為引物對(duì)進(jìn)行PCR，將PCR產(chǎn)物克隆到 PMD18-T 載體中，得到質(zhì)粒 pQL17。質(zhì)粒 pQL17 經(jīng) BglII (Takara, Catalog No. D1021S)和SphI (Takara，Catalog No. :D1180A)酶切，回收片段與經(jīng)相同酶切的pHB1536相連接，得到質(zhì)粒PQL18。質(zhì)粒pQL18經(jīng))(baI酶切，回收0mega+PpetE+lacZ片段，插入到質(zhì)粒 pXT24a的相同位點(diǎn)，得到質(zhì)粒pXT36a。以質(zhì)粒pHB1567為模板，分別以lacZ_ml (5，-ATGGT CAGGTCATGGATGAGCA-3，)和 lacZ_m2 (5，-AATCCCCATGTGGAAACCGT-3，)以及 lacZ_m3 (5，-AC GGTTTCCACATGGGGATT-3，)和 M13_Rev(5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，)為引物對(duì)進(jìn)行 PCR，PCR產(chǎn)物回收后，經(jīng)變性、退火和延伸；再以其為模板，以lacZ-ml和M13_Rev為引物對(duì)進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中，得到質(zhì)粒pXT30。質(zhì)粒ρΧΤ30經(jīng)EcoRI和EcoRV 酶切，回收片段與經(jīng)相同酶切的pXT36a相連，得到質(zhì)粒pXT37b。質(zhì)粒pXT37b經(jīng))(baI酶切， 兩片段回收后，自連篩選得到與pXT37b插入方向相反的質(zhì)粒pXT37a。3、質(zhì)粒pLY2的構(gòu)建質(zhì)粒pRL57經(jīng)DraI酶切，回收Omega片段；質(zhì)粒pKW1188SL經(jīng)EcoRI酶切后，補(bǔ)平，回收片段；兩片段連接得到質(zhì)粒PLY2。該質(zhì)粒用作對(duì)照質(zhì)粒。4、質(zhì)粒pXT14的構(gòu)建以質(zhì)粒 pXL66 (Standford 大學(xué) Chaitan Khosla 教授饋贈(zèng))為模板，以 far_l (5，-GGGTCTAGAATGGAAGAGATGGGC AGCATC-3，)和 far_2(5 ‘-AAACCCGGGATCAATTCAGGACATGTTCCA CGA-3，)為引物對(duì)進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物回收后經(jīng))(bal和SmaI酶切，克隆到質(zhì)粒pFQ9R的相同位點(diǎn)，從而得到質(zhì)粒PXT14。5、質(zhì)粒pXT51的構(gòu)建質(zhì)粒pXL66經(jīng)NdeI和XhoI酶切，回收荷荷芭的far基因片段，插入到質(zhì)粒pXT37b 的相同位點(diǎn)，得到質(zhì)粒PXT51。6、質(zhì)粒pXT34的構(gòu)建按照SEQ ID No 2的序列，合成擬南芥的at3gll980基因，并克隆在質(zhì)粒pUC57上 (合成由上海生工生物工程有限公司完成)，得到質(zhì)粒PXT31。質(zhì)粒pHB1567經(jīng)過(guò)EcoRI和 XhoI酶切，回收5. 4kb的片段；質(zhì)粒pHB1536經(jīng)過(guò)BioI和NdeI酶切，回收2. 4kb的片段；質(zhì)粒pXT31經(jīng)過(guò)Ndel+EcoRI酶切，回收at3gll980片段；以上三片段連接，得到質(zhì)粒pXT34。
實(shí)施例2 藍(lán)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化體的篩選1、取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD73tl約為0. 5 1. 0)的藻細(xì)胞10mL，離心收集細(xì)胞；并用新鮮的BGll培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，再將細(xì)胞重懸于ImL BGll培養(yǎng)基(1. 5g L-1NaNO3^Omg L-1K2HPO4CH2Ojemg Γ1 CaCl2 ·2Η20，6mg Γ1 檸檬酸，6mg Γ1 檸檬酸鐵銨，Img I^1EDTA二鈉鹽，20mg L-1 NaCO3, 2. 9mg L-1 H3BO3,1. 8mg L-1MnCl2 · 4H20，0. 22mg L-1 ZnSO4 · 7H20，0. 39mg
權(quán)利要求
1.一種用于在藍(lán)細(xì)菌中合成脂肪醇的構(gòu)建體，其包含有在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子，以及處于該啟動(dòng)子控制之下的脂肪酰輔酶A還原酶基因。
2.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其進(jìn)一步包含有處于所述在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子上游的用于篩選藍(lán)細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記基因。
3.權(quán)利要求1或2的構(gòu)建體，其進(jìn)一步在兩端具有集胞藻PCC6803的slr0168基因的 N-末端序列和C-末端序列，以用于同源重組。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述在藍(lán)細(xì)菌中具有活性的啟動(dòng)子選自PA。 啟動(dòng)子和？㈨⑶啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述脂肪酰輔酶A還原酶基因?yàn)檫x自下列的基因來(lái)源于荷荷芭的far基因，其例如顯示在SEQ ID NO :1中；和來(lái)源于擬南芥的 at3gl 1980基因，其例如顯示在SEQ ID N0:2中。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述標(biāo)記基因?yàn)閴延^霉素抗性基因Omega片段，其例如顯示在SEQ ID NO :8中。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的構(gòu)建體，其中所述藍(lán)細(xì)菌為集胞藻PCC6803。
8.一種載體，其包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的構(gòu)建體。
9.權(quán)利要求8的載體，其選自下列質(zhì)粒質(zhì)粒pXT14，其于2010年6月觀日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC 3948 ；質(zhì)粒pXT34，其于2010 年6月觀日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC3950 ； 和質(zhì)粒ΡΧΤ51，其于2010年6月觀日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC 3949。
10.包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的構(gòu)建體的藍(lán)細(xì)菌。
11.用權(quán)利要求8或9的載體轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌。
12.權(quán)利要求10或11的藍(lán)細(xì)菌，其選自于2010年6月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的藍(lán)細(xì)菌Syn-XT14，其保藏號(hào)為CGMCC 3894 ；于2010年6 月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的藍(lán)細(xì)菌Syn-XT34，其保藏號(hào)為CGMCC 3895 ；和于2010年6月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的藍(lán)細(xì)菌Syn-XT51，其保藏號(hào)為CGMCC 3896。
13.—種在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)脂肪醇的方法，所述方法包括在適合于合成脂肪醇的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)的藍(lán)細(xì)菌；和從所獲得的培養(yǎng)物中提取所需的脂肪醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于合成脂肪醇的構(gòu)建體，載體，藍(lán)細(xì)菌，以及在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)脂肪醇的方法。具體而言，本發(fā)明涉及用于在藍(lán)細(xì)菌中合成脂肪醇的構(gòu)建體，包含所述構(gòu)建體的載體，包含所述構(gòu)建體或用所述載體轉(zhuǎn)化的藍(lán)細(xì)菌，以及在藍(lán)細(xì)菌中生產(chǎn)脂肪醇的方法。
文檔編號(hào)C12R1/89GK102311966SQ201010213758
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者呂雪峰, 姚倫, 談曉明, 高倩倩, 齊鳳霞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所