專利名稱：基于Solexa測序法的檢測人類乳頭瘤病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus, HPV)的檢測方法，特別是 基于Solexa測序法的HPV檢測方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是世界上女性癌癥的第二號殺手，僅次于乳腺癌。每年全世界約有50萬新 發(fā)病例，25萬死亡病例，其中發(fā)展中國家占2/3。我國是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，占全球?qū)m頸癌總 數(shù)的10%。研究表明，人乳頭瘤病毒(HPV)與宮頸癌有著密切關(guān)系，是重要的致癌因子，同 時也是引發(fā)宮頸癌的必要條件之一。已經(jīng)表明，超過100種的HPV能夠感染皮膚(皮膚類 型)或呼吸道和肛門生殖道的粘膜(粘膜類型)，超過40種的HPV能夠感染子宮頸?；?誘導(dǎo)的良性的，惡化前的或惡性的病變，將HPV分別分為低危型(例如HPV6，11，42，43和 44)和高危型(例如昍乂16，18，31，33和45)。因此，對HPV感染的及早發(fā)現(xiàn)和正確分型對 宮頸癌防治顯得至關(guān)重要。目前HPV的檢測方法主要有以下幾種①細(xì)胞學(xué)檢查，其利用宮頸刮片細(xì)胞學(xué)檢 查或液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查，藉由細(xì)胞外觀形態(tài)的轉(zhuǎn)變來加以診斷。對于HPV感染，鏡下可見 挖空細(xì)胞、角化不良以及濕疣外底層細(xì)胞。其局限性在于，HPV感染的診斷的靈敏性和特異 性較低。②免疫組化方法，其通過檢測HPV的衣殼抗原來進(jìn)一步明確HPV感染，其所得的陽 性反應(yīng)定位明確，判斷可靠。但是，衣殼抗原僅在HPV-DNA復(fù)制成熟后才產(chǎn)生，因此，診斷為 陰性的受試者并不能被確定為不被HPV感染，該方法靈敏性較低。③實時熒光定量PCR法 (FQ-PCR)，其主要是應(yīng)用熒光檢測PCR儀，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號 積累對PCR過程中每一個循環(huán)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時監(jiān)測，從而對模板的初始濃度進(jìn)行 定量。此方法通量較低。④雜交捕獲法(主要為HC-II系統(tǒng))，其是目前唯一獲得美國FDA 認(rèn)證的可用于臨床的HPV DNA檢測方法，并且其已獲得歐洲CE及中國SDA認(rèn)證。該方法使 用專用的標(biāo)本采集保存器；已獲得專利保護(hù)的全長SOOObp的RNA探針以及已獲得專利保護(hù) 的特異性第一抗體。其原理是將核酸探針雜交到受測檢體的HPVDNA上，再通過化學(xué)熒光或 酶反應(yīng)借助增幅的信號進(jìn)行檢測。該方法所使用的核酸探針主要分為兩種針對低危險型 HPV的核酸探針和針對高危險型HPV的核酸探針。該方法可用于HPV的初步篩檢，但是不能 確定HPV的特定類型，也不能確定多重感染的情況。將上述檢測方法聯(lián)合使用，可以提高HPV檢測的靈敏性并降低檢測的假陰性率。 然而，這些方法的組合成本相對較高，一般只適用于經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的HPV檢測和宮頸癌篩 查。對于經(jīng)濟(jì)較不發(fā)達(dá)地區(qū)，特別是在山區(qū)和廣大農(nóng)村地區(qū)，上述檢測方法的聯(lián)合使用存在 著較大的局限性。因此，開發(fā)適合的、低成本的HPV檢測方法，是亟待解決的問題。另一方面，目前已知的HPV檢測方法，例如上文描述的那些檢測方法，通量都較 低。當(dāng)對大規(guī)模的樣品進(jìn)行HPV檢測時，應(yīng)用上述方法是耗時耗力的，并且成本高昂。因此， 本領(lǐng)域迫切需要新的高通量的、低成本的HPV檢測方法。
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本發(fā)明基于Solexa測序法以及PCR標(biāo)簽(PCR index)，開發(fā)了新型的HPV檢測方 法以及用于此的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的方法和試劑盒不僅可以實現(xiàn)HPV的高通量、低成本 檢測，而且可以實現(xiàn)HPV的精確分型。定義為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定義和解釋。如本文中所使用的，術(shù)語“PCR”是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。如本文中所使用的，術(shù)語“Solexa測序法”是指近幾年開發(fā)的新一代DNA測序法， 也稱為第二代測序法。Solexa測序法與傳統(tǒng)測序法(例如，Sanger測序法)的不同之處在 于，其采用邊合成邊測序的原理進(jìn)行DNA序列分析。Solexa測序法具有下述優(yōu)點(diǎn)1)成本 低，僅為傳統(tǒng)測序成本的；2)通量高，可以同時對多個樣品進(jìn)行測序，并且進(jìn)行一次的 Solexa測序法可以產(chǎn)生大約500億(50G)個堿基的數(shù)據(jù)；3)精確性高(高于98.4% )，有 效的解決了多聚重復(fù)序列的讀取問題。另一方面，高測序通量在進(jìn)行測序的序列的數(shù)目確 定的情況下，又反過來提高了序列的測序深度(例如，針對每個序列，可以進(jìn)行多次測序)， 從而確保了測序結(jié)果的可靠性。如本文所使用的，術(shù)語“測序深度”是指一段DNA序列在測 序數(shù)據(jù)中集中出現(xiàn)的次數(shù)。測序深度可以通過將測序量除以基因組長度來計算，例如測序 深度為10，表示測了 10次的整個基因組。Solexa測序法的應(yīng)用十分廣泛。其可以用于基因組測序，基因分型，基因多態(tài)性研 究等等。本發(fā)明的方法將Solexa測序法用于檢測HPV 通過對待分析的樣品進(jìn)行針對HPV 的測序，然后使用本領(lǐng)域已知的比對程序，例如BLAST和S0AP，將所得的測序結(jié)果與HPV數(shù) 據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行比對，從而實現(xiàn)對樣品所感染的HPV的精確分型。本文中使用的HPV 數(shù)據(jù)庫包含本領(lǐng)域已知的HPV類型的序列，所述序列可見于例如公共數(shù)據(jù)庫，例如NCBI數(shù) 據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。如本文中可互換使用的，術(shù)語“PCR標(biāo)簽(PCR index)”、“標(biāo)簽(index)”或“引物 標(biāo)簽(primer index) ”是指添加在PCR引物5 ‘末端的一小段堿基序列，其通過PCR擴(kuò)增 可以用于標(biāo)記PCR產(chǎn)物，從而辨別不同模板來源的PCR產(chǎn)物的混合物中各個PCR產(chǎn)物的模 板來源。通過在引物的5'末端添加標(biāo)簽，可以對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，從而可以將多個不同 的PCR產(chǎn)物混合成一個文庫，用于進(jìn)一步的分析和處理。文庫中各個不同的PCR產(chǎn)物各自 具有獨(dú)特的標(biāo)簽，從而根據(jù)各個PCR產(chǎn)物中獨(dú)特的標(biāo)簽，可以將各個不同的PCR產(chǎn)物互相區(qū) 分開來，并將其與PCR模板一一對應(yīng)。例如，當(dāng)需要對多個樣品進(jìn)行測序時，可以在用于各個樣品的引物的5'末端添 加不同的標(biāo)簽，然后用添加了標(biāo)簽的引物分別對各個樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而對各個樣品 (即，PCR產(chǎn)物)進(jìn)行標(biāo)記。PCR反應(yīng)后，可以將來自各個樣品的帶有不同標(biāo)簽的PCR產(chǎn)物 混合在一起組成一個文庫，然后應(yīng)用高通量的Solexa測序法同時對文庫中的各個PCR產(chǎn)物 進(jìn)行測序。最終，在所得的測序數(shù)據(jù)中，通過獨(dú)特的標(biāo)簽，可以將測序結(jié)果與各個PCR產(chǎn)物 (從而樣品模板)一一對應(yīng)?？梢詢H在用于PCR擴(kuò)增的引物對的一條引物中引入標(biāo)簽，也可以在引物對的兩條 引物中都引入標(biāo)簽。當(dāng)在引物對的兩條引物中都引入標(biāo)簽時，每個PCR引物對與一對標(biāo)簽 組合成一對標(biāo)簽引物，其中正向和反向PCR引物的5'端分別具有正向標(biāo)簽和反向標(biāo)簽，并
5且正反標(biāo)簽和正反引物序列是對應(yīng)的，且正向標(biāo)簽和反向標(biāo)簽可以是相同的，或不同的。設(shè)計標(biāo)簽時需要考慮多種因素，包括1)標(biāo)簽序列中應(yīng)當(dāng)避免3個或3個以上的 單堿基重復(fù)序列；2)所有標(biāo)簽的同一位點(diǎn)中堿基A和堿基C的總含量應(yīng)在所有堿基含量 的30% -70%之間，例如，當(dāng)設(shè)計100條不同的標(biāo)簽序列時，每一條標(biāo)簽序列的第二個堿基 (艮P，所謂的同一位點(diǎn))中A和C占該100條序列第二個堿基總量的30% -70% ；3)標(biāo)簽 序列本身的GC含量應(yīng)在40-60%之間；4)標(biāo)簽之間的序列差異應(yīng)大于4個堿基；5)標(biāo)簽序 列中應(yīng)避免出現(xiàn)與用于測序的引物相似度高的序列；6)當(dāng)標(biāo)簽序列添加到PCR擴(kuò)增引物上 后，應(yīng)避免PCR擴(kuò)增引物形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和二聚體等二級結(jié)構(gòu)。如本文中所使用的，術(shù)語“標(biāo)簽引物(index primer) ”是指帶有標(biāo)簽的引物，其包 含2個部分，標(biāo)簽部分和引物部分，其中標(biāo)簽部分用于在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中標(biāo)記PCR產(chǎn)物，而 引物部分與模板堿基互補(bǔ)配對，用于擴(kuò)增模板，并且其中標(biāo)簽部分，任選地通過連接序列， 連接至引物部分的5'端。如本文中所使用的，術(shù)語“接頭(adapter) ”或“文庫接頭(libraryadapter) ”是指 經(jīng)設(shè)計的一段堿基序列，其可以連接至文庫中的擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物上，從而文庫中的所有 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物都可以借助該接頭進(jìn)行測序，例如，使用針對該接頭設(shè)計的測序引物(而 無需使用針對各PCR產(chǎn)物設(shè)計的特異性測序引物)進(jìn)行測序。優(yōu)選地，本發(fā)明的接頭可以 通過“PCR-FREE ”方法連接至PCR產(chǎn)物上。如本文中所使用的，術(shù)語“PCR-FREE”是指不進(jìn)行PCR反應(yīng)而直接將接頭連接至 PCR產(chǎn)物上，例如通過使用DNA連接酶將接頭連接至PCR產(chǎn)物上。利用PCR-Free方法來 構(gòu)建測序文庫是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，參見例如，Nature Methods 6，291-295 (2009)。 “PCR-FREE”方法由于整個過程無需進(jìn)行PCR而具有以下有利方面1)減少了純化步驟，降 低了花費(fèi)的時間和成本；2)減少了非特異性擴(kuò)增；3)在含有許多序列高度相似的PCR產(chǎn)物 的文庫的構(gòu)建過程中，避免由PCR引入錯誤，從而提高最后的測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。如本文中所使用的，本發(fā)明的方法和試劑盒可以使用至少1種接頭。不同的接頭 可以共有相同的一段序列(在本文中稱為“測序序列”)，并且可進(jìn)一步包含不同的特征序 列，從而，不同的接頭可以共用相同的引物(其針對相同的測序序列進(jìn)行設(shè)計)進(jìn)行測序， 并且利用獨(dú)特的特征序列可以辨別多個文庫的混合物中各個PCR產(chǎn)物的文庫來源，S卩，對 不同文庫來源的PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的標(biāo)記。將標(biāo)簽與具有不同特征序列的接頭組合，可以大大提高標(biāo)記的效率(參見圖1)。 例如，使用100種標(biāo)簽可以標(biāo)記100個樣品，而使用100種標(biāo)簽和200種具有不同特征序列 的接頭，可以標(biāo)記100*200 = 20000個樣品。因此，本發(fā)明的一個方面提供了一組標(biāo)簽，其包含至少10種，優(yōu)選至少20種、至少 30種、至少40種、至少50種、至少60種、至少70種、至少80種、至少90種或95種標(biāo)簽，并 且所述標(biāo)簽具有選自SEQ ID NO :1-95的序列。在一個優(yōu)選實施方案中，該組標(biāo)簽至少包括 SEQ ID NO: 1-10，或 SEQ ID NO 11-20，或 SEQ ID NO :21_20，或 SEQ ID NO :31_40，或 SEQ ID NO :41-50，或 SEQ ID NO :51_60，或 SEQ ID NO :61_70，或 SEQ ID NO :71_80，或 SEQ ID N0:81-90，或SEQ ID NO :91_95所示的標(biāo)簽，或者其任何兩個或者多個的組合，例如SEQ ID NO 1-95所示的標(biāo)簽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽用于標(biāo)記SEQ IDNO :96_106所示的PCR引物，從而用于進(jìn)行高通量HPV測序、檢測或分型。本發(fā)明的一個方面提供了一種標(biāo)簽引物組，其包含11種標(biāo)簽引物，所述標(biāo)簽引物 的序列包含標(biāo)簽序列和PCR弓I物序列，并且所述標(biāo)簽序列，任選地通過連接序列，連接至所 述PCR引物序列的5'端，其中1)所述標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO 1_95，且標(biāo)簽引物組中的11種標(biāo)簽引物的每一 種的標(biāo)簽序列都相同，和2)所述11種標(biāo)簽引物的PCR引物序列分別如SEQ ID NO :96_106所示。本發(fā)明的標(biāo)簽引物組可擴(kuò)增出至少16種大約170bp的產(chǎn)物，其對應(yīng)于HPV基因組 中最為保守的基因區(qū)(Li區(qū))中的一段高度保守的DNA序列。因此，本發(fā)明的標(biāo)簽引物組 可用于HPV的精確分型。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽引物組可用于HPV測序、檢測或分型，從而 其可用于醫(yī)療用途，例如診斷HPV的存在和確定HPV的類型等，以及非醫(yī)療用途，例如構(gòu)建 HPV數(shù)據(jù)庫，鑒定HPV的新的類型和亞型，研究HPV類型分布的地域性特點(diǎn)，流行病學(xué)研究和 疫苗研制等。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽引物組可用于制備試劑盒，所述試劑 盒可用于HPV測序、檢測或分型。本發(fā)明的另一個方面提供了一種標(biāo)簽引物套組，其包含至少10個，優(yōu)選至少20 個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或95 個上文描述的標(biāo)簽引物組。優(yōu)選地，標(biāo)簽引物套組中，各個標(biāo)簽引物組所使用的標(biāo)簽序列 互不相同。更優(yōu)選，標(biāo)簽引物套組中所使用的標(biāo)簽序列至少包括SEQ IDNO 1-10，或SEQ ID NO :11-20，或 SEQ ID NO :21_20，或 SEQ ID NO :31_40，或 SEQ ID NO :41_50，或 SEQ ID NO :51-60，或SEQ ID NO :61_70，或SEQ ID NO :71_80，或SEQ ID NO :81_90，或SEQ ID NO: 91-95所示的標(biāo)簽序列，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合，例如SEQID NO :1_95所示的標(biāo) 簽序列。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽引物套組可用于高通量HPV測序、檢測或 分型，從而其可用于醫(yī)療用途，例如大規(guī)模的HPV相關(guān)疾病的診斷和HPV的精確分型(為臨 床診斷和治療方案選擇提供依據(jù))等，以及非醫(yī)療用途，例如構(gòu)建HPV數(shù)據(jù)庫，鑒定HPV的 新的類型和亞型，研究HPV類型分布的地域性特點(diǎn)，流行病學(xué)研究和疫苗研制等。在另一個 優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的標(biāo)簽弓I物套組可用于制備試劑盒，所述試劑盒可用于高通量HPV 測序、檢測或分型。本發(fā)明的另一個方面提供了一種試劑盒，其包含上文描述的標(biāo)簽引物組或標(biāo)簽引 物套組。優(yōu)選，本發(fā)明的試劑盒還包含至少1種，優(yōu)選至少2種、至少10種、至少20種、至 少30種、至少40種、至少50種、至少100種或至少200種接頭。在一個優(yōu)選實施方案中，所 述接頭適用于Solexa測序法，例如其可用于構(gòu)建測序文庫，例如所述接頭可具有選自SEQ ID N0:121-132的序列。在一個優(yōu)選實施方案中，通過PCR-FREE方法，例如DNA連接酶法， 使用接頭來構(gòu)建測序文庫。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可用于高通量HPV測序、檢測或分型，并 且如上所述，其可用于醫(yī)療用途和非醫(yī)療用途。本發(fā)明的另一個方面提供了用于對一個或多個樣品進(jìn)行HPV測序、檢測或分型的 方法。所述方法包括使用上文描述的標(biāo)簽引物組或標(biāo)簽引物套組或試劑盒對各個樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行測序以獲得樣品的序列的步驟。本發(fā)明的另一個方面提供了用于對一個或多個樣品進(jìn)行HPV測序、檢測或分型的 方法，其包括下列步驟提供η個樣品，η為大于等于1的整數(shù)，所述樣品優(yōu)選地來自哺乳動物，更優(yōu)選是 人，且優(yōu)選是脫落細(xì)胞；可選地，將待分析的η個樣品分成m個小組，m為整數(shù)且η > m > 1 ；1)對于每一個樣品，使用一個標(biāo)簽弓I物組對樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述標(biāo)簽引物組包含11種標(biāo)簽引物，所述標(biāo)簽引物的序列包含標(biāo)簽序列和PCR引 物序列，并且所述標(biāo)簽序列，任選地通過連接序列，連接至所述PCR引物序列的5'端，其中i)所述標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO :1_95，并且所述11種標(biāo)簽引物的每一種的標(biāo)簽 序列都相同，和ii)所述11種標(biāo)簽引物的PCR引物序列分別如SEQ ID NO :96_106所示，其中，不同的樣品使用的標(biāo)簽引物組可以相同或者不同，并且不同的標(biāo)簽引物組 使用不同的標(biāo)簽序列；2)將步驟1)中的使用不同標(biāo)簽引物組進(jìn)行擴(kuò)增所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起， 得到一個或多個PCR產(chǎn)物文庫； 3)通過PCR-FREE方法，例如DNA連接酶法給步驟2)中獲得的一個或多個PCR產(chǎn) 物文庫分別添加接頭，從而構(gòu)建一個或多個測序文庫，其中不同的測序文庫所使用的接頭 可以相同或者不同，且不同的接頭共有相同的測序序列，但具有不同的特征序列；4)任選地，將步驟3)中獲得的使用不同接頭的測序文庫混合在一起，得到一個或 多個文庫混合物；5)對步驟3)中獲得的一個或多個測序文庫或步驟4)中獲得的一個或多個文庫混 合物分別進(jìn)行測序，其中利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選Pair-End技術(shù)(例如Solexa、Illumina Hiseq 2000)進(jìn)行測序；6)根據(jù)標(biāo)簽引物組的標(biāo)簽引物序列，或者根據(jù)標(biāo)簽引物組的標(biāo)簽引物序列以及接 頭的特征序列，將測序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)；其中所述樣品優(yōu)選是脫落細(xì)胞，且優(yōu)選來源于動物，例如人。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法使用至少10個，優(yōu)選至少20個、至少30個、 至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或95個上文描述的標(biāo)簽 引物組。進(jìn)一步優(yōu)選地，所使用的標(biāo)簽序列至少包括SEQ ID N0:l-10，或SEQ ID NO 11-20， 或 SEQ ID NO :21-20，或 SEQ ID NO :31_40，或 SEQ ID NO :41_50，或 SEQ ID N0:51_60，或 SEQ ID NO :61-70，或 SEQ ID NO :71_80，或 SEQ ID NO :81_90，或 SEQ ID N0:91_95 所示的 標(biāo)簽序列，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合，例如SEQ ID NO: 1-95所示的標(biāo)簽序列。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法使用至少1種，優(yōu)選至少2 種、至少10種、至少20種、至少30種、至少40種、至少50種、至少100種或至少200種接 頭，例如所述接頭可具有選自SEQ ID NO 121-132的序列。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施方案中，在測序后，將獲得的樣品序列與上文描 述的HPV數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行對比，從而對樣品進(jìn)行HPV精確分型。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明基于Solexa測序法提供了用于對多個樣品進(jìn)行 高通量HPV測序、檢測或分型的方法，所述樣品優(yōu)選是脫落細(xì)胞，且優(yōu)選來源于動物，例如人，所述方法包括下列步驟1)將待分析的樣品分成m個小組，m為彡1的整數(shù)；2)對每個樣品小組進(jìn)行如下步驟2a)從待分析的樣品中提取DNA ；2b)根據(jù)用于擴(kuò)增HPV DNA的引物組中的所有引物的序列，設(shè)計一套標(biāo)簽，標(biāo)簽的 個數(shù)η等于該樣品小組的樣品數(shù)目；2c)將2b)中設(shè)計的每一個標(biāo)簽分別添加至引物組的所有正向引物或所有反向引 物或所有引物的序列的5'末端，從而提供η個標(biāo)簽引物組；2d)使用2c)中提供的標(biāo)簽引物組對2a)中獲得的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而提 供PCR產(chǎn)物，其中針對每個樣品DNA，使用不同的標(biāo)簽引物組；和2e)將2d)中的所有PCR產(chǎn)物混合在一起，獲得PCR產(chǎn)物文庫；3)給2)中得到的PCR產(chǎn)物文庫加上接頭，其中各個PCR產(chǎn)物文庫使用不同的接 頭，從而構(gòu)建m個測序文庫，其中各個接頭共有相同的測序序列，而具有互不相同的特征序 列；4)將m個測序文庫混合在一起，利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選Pair-End技術(shù)(例如 Solexa, Illumina Hiseq 2000)進(jìn)行測序；得到所有樣品的測序結(jié)果；5)根據(jù)測序結(jié)果中的接頭的特征序列、標(biāo)簽的序列以及引物的序列，將獲得的測 序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)；和任選地，將每個樣品的測序結(jié)果與HPV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而實 現(xiàn)HPV測序、檢測或分型。在一個優(yōu)選實施方案中，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行DNA提取。例 如，可以使用自動化的DNA提取儀和DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，例如可商購獲得的 KingFisher自動提取儀，例如美國Thermo Scientific Kingfisher Flex全自動磁珠提取 純化系統(tǒng)。在一個優(yōu)選的實施方案中，2b)中的引物組包含11條引物，其序列分別如SEQ ID NO 96-106所示。這11條引物組成的引物組可擴(kuò)增出至少16種大約170bp的產(chǎn)物，其對 應(yīng)于HPV基因組中最為保守的基因區(qū)(Li區(qū))中的一段高度保守的DNA序列。因此，通過 對該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行精確測序，可以實現(xiàn)HPV的精確分型。在又一個優(yōu)選的實施方案中，2b)中設(shè)計的標(biāo)簽的個數(shù)為至少10個，優(yōu)選至少20 個，至少30個，至少40個，至少50個，至少60個，至少70個，至少80個，至少90個，或至少 100個。優(yōu)選，標(biāo)簽可具有選自SEQ ID NO :1_95的序列。在優(yōu)選的實施方案中，不同樣品小 組之間的所使用的標(biāo)簽可以相同或者不同。在優(yōu)選的實施方案中，引入正向引物的標(biāo)簽與 引入反向引物的標(biāo)簽可以相同或者不同。在特別優(yōu)選的實施方案中，2b)中設(shè)計的標(biāo)簽至少 包括 SEQ ID N0:l-10，或 SEQ ID NO 11-20，或 SEQ ID NO :21_20，或 SEQ ID N0:31_40，或 SEQ ID NO :41-50，或 SEQ ID NO :51_60，或 SEQ ID NO :61_70，或 SEQ ID NO :71_80，或 SEQ ID N0:81-90，或SEQ ID NO :91_95所示的標(biāo)簽，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合。在特 別優(yōu)選的實施方案中，2b)中設(shè)計的標(biāo)簽如SEQ ID N0:l-95所示。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用PCR-FREE方法，給PCR產(chǎn)物文庫加上接頭，例如使 用DNA連接酶。特別地，在本發(fā)明的方法中，由于不同HPV類型之間的DNA序列高度相似， 因此，本發(fā)明的測序文庫的構(gòu)建必須通過PCR-FREE方法來完成。相反，如果通過采用常規(guī)的pooling PCR將接頭連接至PCR產(chǎn)物上來構(gòu)建測序文庫，那么所得到的文庫中將含有大 量的與原模板不一致的產(chǎn)物，導(dǎo)致不能對原模板進(jìn)行準(zhǔn)確測序。在一個優(yōu)選的實施方案中， 使用的接頭的數(shù)目為至少1種，優(yōu)選至少2種、至少10種、至少20種、至少30種、至少40 種、至少50種、至少100種或至少200種，例如所述接頭可具有選自SEQID NO :121_132的 序列。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，接頭是可商購獲得的接頭，例如可購自 IIlumina公司的PCR-free Index Adapter Oligo Mix。在另外的實施方案中，本發(fā)明也可 使用下列PCR-free接頭(下劃線部分為接頭的特征序列)。PCR-free 接頭 1 (SEQ ID NO: 121) =ATCACG5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 2 (SEQ ID NO 122) =CGATGT5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACCGATGTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 3 (SEQ ID NO 123) =TTAGGC5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACTTAGGCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 4 (SEQ ID NO: 124) =TGACCA5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACTGACCMTCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 5 (SEQ ID NO 125) =ACAGTG5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACACAGTGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 6 (SEQ ID NO: 126) =GCCAAT5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACGCCMTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 7 (SEQ ID NO 127) =CAGATC5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACCAGATCATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 8 (SEQ ID NO: 128) =ACTTGA5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACACTTGMTCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 9 (SEQ ID NO: 129) =GATCAG5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACGATCAGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 10 (SEQ ID NO: 130) =TAGCTT5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACTAGCTTATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 11 (SEQ ID NO 131) =GGCTAC5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACGGCTACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGPCR-free 接頭 12 (SEQ ID NO: 132) =CTTGTA5-Phos/GATCGGMGAGCACACGTCTGMCTCCAGTCACCTTGTMTCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法使用Solexa測序儀(例如，Illumina Genome Analyzer IIx測序儀)進(jìn)行Solexa測序法。在另外的優(yōu)選的實施方案中，HPV數(shù) 據(jù)庫包含本領(lǐng)域已知的HPV類型的序列，所述序列例如可見于例如公共數(shù)據(jù)庫，例如NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實施方案中，樣品可以是脫落細(xì)胞。在另一個優(yōu)選實 施方案中，樣品可以來源于動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人。發(fā)明的有益效果
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本發(fā)明的新型的HPV檢測方法和用于此的試劑盒相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下有利方面。1)高通量。通過使用標(biāo)簽與具有不同特征序列的接頭，進(jìn)行一次本發(fā)明的方法，可 檢測甚至10000份樣品，從而本發(fā)明的方法可以廣泛用于疾病普查工作，成為早期診斷疾 病的有效手段。2)低成本。本發(fā)明采用Solexa測序法進(jìn)行測序，測序成本大大降低(僅為常規(guī)測 序法的)，從而HPV檢測成本大大降低。3)可對HPV進(jìn)行精確分型。通過使用多條引物(例如本發(fā)明的6條正向引物和5 條反向引物)進(jìn)行擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物的序列信息與HPV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可以精確地確定 HPV的類型，從而為臨床診斷和治療方案選擇提供依據(jù)。另外，使用本發(fā)明的方法還有利于發(fā)現(xiàn)新的HPV類型，包括已有的類型中的新的 亞型和變異體，為科學(xué)研究提供更有效和方便的工具。下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人 員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖 和優(yōu)選實施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 將變得顯然。


圖1為經(jīng)標(biāo)簽和具有獨(dú)特的特征序列的接頭標(biāo)記后的PCR產(chǎn)物的示意圖。在本 發(fā)明的示例性方法中，通過PCR在每個樣品的PCR產(chǎn)物兩端同時引入標(biāo)簽；把多個帶有不 同標(biāo)簽的PCR產(chǎn)物混合在一起，用于構(gòu)建測序文庫。在測序文庫的構(gòu)建過程中，當(dāng)需要時， 可以構(gòu)建多個測序文庫時，其中通過使用具有不同特征序列的接頭，來標(biāo)記各個測序文庫。 文庫構(gòu)建完畢后，經(jīng)具有不同特征序列的接頭標(biāo)記的多個測序文庫可以混合在一起，并用 Solexa測序法進(jìn)行同時測序(不同的測序文庫之間所使用的標(biāo)簽可以相同或不同)。最 后，根據(jù)測序結(jié)果中的接頭的特征序列和標(biāo)簽的序列信息，可將測序結(jié)果與每個樣品一一 對應(yīng)。圖2為部分PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。從電泳圖上可觀察到，PCR產(chǎn)物條帶 的大小為約170bp。其中，泳道M是50bp DNA分子梯，泳道1_14為隨機(jī)挑選的HPV陽性樣 本的PCR產(chǎn)物。
具體實施例方式采用本發(fā)明的方法，對190份已知HC-II結(jié)果的樣品進(jìn)行HPV基因分型，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)采用本發(fā)明的方法所得的結(jié)果不僅與已知的HC-II結(jié)果一致，而且實現(xiàn)了對HPV的精確 分型。實施例1 樣品提取根據(jù)廠商的說明書，使用KingFisher自動提取儀(美國ThermoSc ientific Kingfisher Flex全自動磁珠提取純化系統(tǒng))從190份已知HC-II結(jié)果的脫落細(xì)胞中提取 DNA。使用程序“BioeaSy-200l·! 1 BloodDNA_KF. msz”，進(jìn)行核酸提取。程序結(jié)束后，獲得 100 μ 1左右的洗脫產(chǎn)物(提取的DNA)，用作下一步PCR擴(kuò)增中的模板。
實施例2 =PCR擴(kuò)增把實施例1中獲得的190份DNA依次編號為1_190，并平均分為2組(HPV-1組編 號1-95 ；HPV-2組編號96-190)。根據(jù)用于擴(kuò)增HPV DNA的引物組(包括6條正向引物和 5條反向引物)的各條引物的序列(表2，SEQ ID N0:96-107)，設(shè)計一套標(biāo)簽，共95個(表 1, SEQ ID N0:l-95)。將設(shè)計的每一個標(biāo)簽分別添加至引物組的各條引物的序列的5'末 端，從而獲得95個標(biāo)簽引物組，其中每個標(biāo)簽引物組包括相應(yīng)的6條正向標(biāo)簽引物和5條 反向標(biāo)簽引物，并且不同的標(biāo)簽引物組使用不同的標(biāo)簽(即，95個標(biāo)簽引物組與95個標(biāo)簽 --對應(yīng))。在96孔板中對所有樣品進(jìn)行PCR反應(yīng)，共使用2塊板(HPV-1組和HPV-2組各1塊 板)。使用實施例1中獲得的DNA作為模板，并且在HPV-I組和HPV-2組(各95個樣品) 中，針對每個樣品，使用不同的標(biāo)簽引物組進(jìn)行PCR擴(kuò)增(S卩，95個樣品與95個標(biāo)簽引物組 一一對應(yīng))。記錄下每一個標(biāo)簽引物組(每一個標(biāo)簽)對應(yīng)的樣品的編號信息。每塊板中 還設(shè)置一個不添加模板的陰性對照。2塊板中的陰性對照所用的引物分別與樣品1和樣品 96所用的引物相同。表1 標(biāo)簽與樣品的相關(guān)信息。
表2 未添加標(biāo)簽的用于擴(kuò)增HPV DNA的引物組的各條引物的序列信息。 注F表示正向引物，R表示反向引物。使用下列PCR參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增95 "C 30 秒一48 "C 30 秒一72 °C 30 秒(40 個循環(huán))72°C 10 分鐘一12°C⑴PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，其組成是(所有試劑均購自Enzymatics公司) PCR反應(yīng)在Bio-Rad公司的PTC-200PCR儀上運(yùn)行。PCR完成后，取3 μ 1 PCR產(chǎn)物 在2. 5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(圖2)。實施例3 =PCR產(chǎn)物的混合和純化把HPV-I組與HPV-2組中剩余的PCR產(chǎn)物各混合在一個3ml的EP管中(同樣標(biāo) 記為HPV-I組和HPV-2組)，并震蕩混勻。從2管混合物中各取出500 μ 1 DNA，并根據(jù)廠 商的說明書，使用Qiagen DNAPurification試劑盒進(jìn)行過柱純化，得到200 μ 1 DNA。使用 Nanodrop8000 (Thermo Fisher Scientif ic公司)，測定純化后的混合物的DNA濃度分別為 98ng/ μ 1 (HPV-1 組)和 102ng/ μ 1 (HPV-2 組)。實施例4 =Solexa測序文庫的構(gòu)津4. 1 末端修復(fù)反應(yīng)使用Thermomixer (Eppendorf公司)，對實施例3中獲得的經(jīng)純化的兩管DNA混合 物分別進(jìn)行DNA末端修復(fù)反應(yīng)。修復(fù)反應(yīng)的反應(yīng)體系為ΙΟΟμ 1，其組成是(所有試劑均購 自 Enzymatics 公司) 反應(yīng)條件為20°C，30分鐘。根據(jù)廠商的說明書，使用QIAquick PCR Purification試劑盒純化并回收DNA末 端修復(fù)反應(yīng)的產(chǎn)物。回收的產(chǎn)物溶于34μ1 EB(QIAGENElution Buffer)中。4.2:3'末端加A反應(yīng)使用Thermomixer (Eppendorf公司)，對回收的DNA進(jìn)行3'末端加A反應(yīng)。反應(yīng) 體系為50ul，其組成是(所有試劑均購自Enzymatics公司): 反應(yīng)條件為37°C，30分鐘。根據(jù)廠商的說明書，使用MiniElute PCR Purification Kit (QIAGEN公司)純化 并回收3'末端加A反應(yīng)的產(chǎn)物?；厥盏漠a(chǎn)物溶于20μ 1的EB中。4. 3 添力口 Solexa 接頭使用Thermomixer (Eppendorf公司)，對上一步獲得的2種產(chǎn)物分別添加不同的接 頭以構(gòu)建2個測序文庫。記錄下接頭和文庫的對應(yīng)關(guān)系。添加Solexa接頭的反應(yīng)體系為50ul，其組成是(所有試劑均購自Illumina公 司)
反應(yīng)條件為20°C，15分鐘。根據(jù)廠商的說明書,使用Ampure Beads (Beckman Coulter Genomics)純化反應(yīng)產(chǎn) 物并將產(chǎn)物溶于17 μ 1去離子水。使用Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent公司)和熒 光定量PCR(QPCR)測定產(chǎn)物的DNA濃度，結(jié)果如下 實施例5 So Iexa測序以Agilent Bioanalyzer 2100所測濃度為準(zhǔn)，將上一步所得的2種產(chǎn)物等摩爾混 合在一起(各取IOpmol DNA)。根據(jù)廠商的說明書，使用Solexa測序儀(Illumina Genome Analyzer II χ測序儀)，用Solexa ΡΕ-75程序進(jìn)行測序。實施例6 結(jié)果分析根據(jù)測序結(jié)果中的接頭的特征序列以及標(biāo)簽引物(標(biāo)簽部分和引物部分)的序列 的信息，將測序結(jié)果與每個樣品一一對應(yīng)。然后，使用本領(lǐng)域已知的比對程序，例如BLAST 和S0AP，將每個樣品的測序結(jié)果與HPV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而實現(xiàn)HPV檢測，并對HPV進(jìn)行 精確分型。所得到的檢測結(jié)果與已知的結(jié)果完全一致(參見表3)，表明本發(fā)明方法可以用于 精確檢測樣品中的HPV。表3 :190個樣品的檢測結(jié)果。 此外，本發(fā)明的方法還可以對樣品中的HPV進(jìn)行精確分型。表4中提供了圖2所 示的泳道1-14所對應(yīng)的樣品的測序序列和分型結(jié)果。
參考文獻(xiàn)本文中用于舉例說明本發(fā)明或提供關(guān)于本發(fā)明的實施的另外的詳細(xì)內(nèi)容的專利、
出版物和其他材料通過引用合并入本文，并且為方便起見按下列文獻(xiàn)目錄提供。[1]. Pectasides D，Kanposioras K，Papaxoinis G et al. Chemotherapy for recurrent cervical cancer. Cancer Treatment Reviews，2008，34(7) :603_613.[2]. Brink, A. A. , P. J. Sni jders, and C. J. Mei jer. HPV detection methods. Dis. Markers 2007，23 :273_281·[3]. IARC. Handbooks of cancer prevention. Cervix cancer screening[R]. Lyon :IARC Press,2005.[4].Doorbar, J. Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer. Clin. Sci. 2006，110 :525_54L[5].Cox T，Cuzick J. HPV DNA testing in cervical cancer screening :From evidence to policies.Gyneeol Oncol，2006，103 :8_1L[6]. Kulmala S，syljhen. Human papillomavirus testing with the hybrid capture assay and PCR as screening tools. Clin Microbiol，2004，42(6) :2470_2475.[7]. Quail,M. et al. ,A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat. Methods，2008，5，1005-1010.[8]. Brown, C. G. et al.，Solexa/Illumina GAPipeline product and product documentation， Illumina Inc,2006.[9]. Lozano，R. Successfully integrating human papillomavirus testing into your practice. Arch. Pathol. Lab Med,2003,127 :991-994.
權(quán)利要求
用于對一個或多個樣品進(jìn)行HPV測序、檢測或分型的方法，其包括下列步驟1)對于每一個樣品，使用一個標(biāo)簽引物組對樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述標(biāo)簽引物組包含11種標(biāo)簽引物，所述標(biāo)簽引物的序列包含標(biāo)簽序列和PCR引物序列，并且所述標(biāo)簽序列，任選地通過連接序列，連接至所述PCR引物序列的5′端，其中i)所述標(biāo)簽序列選自SEQ ID NO1 95，并且所述11種標(biāo)簽引物的每一種的標(biāo)簽序列都相同，和ii)所述11種標(biāo)簽引物的PCR引物序列分別如SEQ ID NO96 106所示，其中，不同的樣品使用的標(biāo)簽引物組可以相同或者不同，并且不同的標(biāo)簽引物組使用不同的標(biāo)簽序列；2)將步驟1)中的使用不同標(biāo)簽引物組進(jìn)行擴(kuò)增所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物混合在一起，得到一個或多個PCR產(chǎn)物文庫；3)通過PCR FREE方法，例如DNA連接酶法給步驟2)中獲得的一個或多個PCR產(chǎn)物文庫分別添加接頭，從而構(gòu)建一個或多個測序文庫，其中不同的測序文庫所使用的接頭可以相同或者不同，且不同的接頭共有相同的測序序列，但具有不同的特征序列；4)任選地，將步驟3)中獲得的使用不同接頭的測序文庫混合在一起，得到一個或多個文庫混合物；5)對步驟3)中獲得的一個或多個測序文庫或步驟4)中獲得的一個或多個文庫混合物分別利用二代測序技術(shù)，優(yōu)選Pair End技術(shù)(例如Solexa、Illumina Hiseq 2000)進(jìn)行測序；；6)根據(jù)標(biāo)簽引物組的標(biāo)簽引物序列，或者根據(jù)標(biāo)簽引物組的標(biāo)簽引物序列以及接頭的特征序列，將測序結(jié)果與樣品一一對應(yīng)；其中所述樣品優(yōu)選是脫落細(xì)胞，且優(yōu)選來源于動物，例如人。
2.權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)中使用至少10個，優(yōu)選至少20個、至少30個、至 少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或95個標(biāo)簽引物組，優(yōu) 選所使用的標(biāo)簽序列至少包括SEQID N0:l-10，或SEQ ID NO :11_20，或SEQ ID NO =21-20, 或 SEQID NO :31-40，或 SEQ ID NO :41_50，或 SEQ ID NO 51-60，或 SEQID NO :61_70，或 SEQ ID NO :71-80，或SEQ ID NO :81_90，或SEQID NO :91_95所示的標(biāo)簽序列，或者它們?nèi)魏蝺?個或者多個的組合。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟3)中使用至少1種，優(yōu)選至少2種、至少10種、至 少20種、至少30種、至少40種、至少50種、至少100種或至少200種接頭，例如所述接頭 可具有選自SEQ ID NO 121-132的序列。
4.權(quán)利要求1的方法，其還包括將所述樣品的測序結(jié)果與HPV數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行對比， 以對樣品進(jìn)行HPV精確分型。
5.用于對多個樣品進(jìn)行高通量HPV測序、檢測或分型的方法，所述樣品優(yōu)選是脫落細(xì) 胞，且優(yōu)選來源于動物，例如人，所述方法包括下列步驟1)將待分析的樣品分成m個小組，m為彡1的整數(shù)；2)對每個樣品小組進(jìn)行如下步驟2a)從待分析的樣品中提取DNA;2b)根據(jù)用于擴(kuò)增HPV DNA的引物組中的所有引物的序列，設(shè)計一套標(biāo)簽，標(biāo)簽的個數(shù)η等于該樣品小組的樣品數(shù)目；2c)將2b)中設(shè)計的每一個標(biāo)簽分別添加至引物組的所有正向引物或所有反向引物或 所有引物的序列的5'末端，從而提供η個標(biāo)簽引物組；2d)使用2c)中提供的標(biāo)簽引物組對2a)中獲得的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而提供 PCR產(chǎn)物，其中針對每個樣品DNA，使用不同的標(biāo)簽引物組；和2e)將2d)中的所有PCR產(chǎn)物混合在一起，獲得PCR產(chǎn)物文庫；3)給2)中得到的PCR產(chǎn)物文庫加上接頭，其中各個PCR產(chǎn)物文庫使用不同的接頭，從 而構(gòu)建m個測序文庫，其中各個接頭共有相同的測序序列，而具有互不相同的特征序列；4)將m個測序文庫混合在一起，利用Solexa或IlluminaHiseq 2000測序法進(jìn)行測 序，得到所有樣品的測序結(jié)果；5)根據(jù)測序結(jié)果中的接頭的特征序列、標(biāo)簽的序列以及引物的序列，將獲得的測序結(jié) 果與樣品一一對應(yīng)；和任選地，將每個樣品的測序結(jié)果與HPV數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而實現(xiàn) HPV測序、檢測或分型。
6.權(quán)利要求5的方法，其中2b)中的引物組包含11條引物，其序列分別如SEQID NO 96-106 所示。
7.權(quán)利要求6的方法，其中2b)中設(shè)計的標(biāo)簽可具有選自SEQIDNO :1_95的序列，且 優(yōu)選至少包括 SEQ ID NO: 1-10，或 SEQ ID NO 11-20，或 SEQ ID NO :21_20，或 SEQ ID NO: 31-40，或 SEQ ID NO :41_50，或 SEQ ID NO :51_60，或 SEQ ID NO :61_70，或 SEQ ID NO: 71-80，或SEQ ID NO :81_90，或SEQ ID NO :91_95所示的標(biāo)簽，或者它們?nèi)魏蝺蓚€或者多個的組合。
8.權(quán)利要求7的方法，其中3)中可使用至少2種、優(yōu)選至少10種、至少20種、至少30 種、至少40種、至少50種、至少100種或至少200種接頭，例如所述接頭可具有選自SEQ ID NO 121-132 的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及人類乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)的檢測方法，特別是基于Solexa測序法的HPV檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK101921874SQ20101021372
公開日2010年12月22日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者徐佳佳, 易鑫, 聶喜芳, 趙美茹 申請人:深圳華大基因科技有限公司