專(zhuān)利名稱(chēng)：人乳頭瘤病毒的檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對(duì)人乳頭瘤病毒(HPV)存在篩選人類(lèi)受試者的體外方法，該病毒的存在顯示出了E6/E7 mRNA表達(dá)調(diào)控的缺失以及編碼全長(zhǎng)E6蛋白的穩(wěn)定前mRNA復(fù)制和/或表達(dá)的缺失。特別地，本發(fā)明提供了篩選持續(xù)的轉(zhuǎn)化(transforming)HPV感染的體外方法，所述感染等同于持續(xù)的細(xì)胞異?；虺掷m(xù)的CIN III病變，原位癌癥或高度鱗狀上皮病變(HSIL)的。本方法可用于宮頸癌的篩選。
背景技術(shù)：
宮頸癌是世界范圍內(nèi)最普遍的惡性疾病之一，其是引起女性發(fā)病和死亡的主要原因之一(Parkin DM，Pisani P，F(xiàn)erlay J(1993)′Int JCancer 54594-606；Pisani P，Parkin DM，F(xiàn)erlay J(1993)Int J Cancer55891-903)。預(yù)測(cè)1996年美國(guó)有15,700個(gè)侵襲性宮頸癌的新病例，并且世界衛(wèi)生組織估計(jì)全世界年度發(fā)病率是450,000例(1990)。世界不同地區(qū)的年度發(fā)病率各有不同，變化的范圍是從西亞地區(qū)每100,000人7.6例到南非地區(qū)的每100,000人46.8例(Parkin等人，1993 ibid)。
當(dāng)前對(duì)于宮頸癌的概念為它是一種多階段的疾病，經(jīng)常會(huì)發(fā)展10-25年的一段時(shí)期。子宮頸的侵襲性鱗狀細(xì)胞癌由穿透基本層并入侵基質(zhì)或上皮固有粘膜層(lamina propria)的現(xiàn)象所代表。宮頸癌的臨床病程顯示出相當(dāng)多的變化。預(yù)后已被關(guān)聯(lián)于臨床階段、淋巴結(jié)牽連、初始腫瘤團(tuán)塊、組織學(xué)類(lèi)型、侵入深度和淋巴結(jié)滲透等相關(guān)(DelgadoG，等人，(1990)Gynecol Oncol 38352-357)。一些具有較少的有利(lessfavourable)腫瘤特征的患者有相對(duì)好的結(jié)果，而其他患者卻遭受了原本受限的疾病帶來(lái)的致命結(jié)果。這顯示了明確地需要另外的標(biāo)記物進(jìn)一步表征剛診斷出的宮頸癌，以便實(shí)施與風(fēng)險(xiǎn)適應(yīng)的治療(IkenbergH，等人，Int.J.Cancer 59322-6.1994)。
宮頸癌的流行病學(xué)已經(jīng)顯示出和宗教、婚姻及性伴侶強(qiáng)烈相關(guān)。已經(jīng)已針對(duì)HPV和宮頸腫瘤形成的聯(lián)系進(jìn)行了幾乎所有100例的對(duì)照研究，幾乎所有都發(fā)現(xiàn)了正相關(guān)(IARC monographs，1995)。這種相關(guān)對(duì)有限數(shù)量的病毒類(lèi)型而言是強(qiáng)烈的、一致的和特異的(Munoz N，Bosch FX(1992)HPV and cervical neoplasiareview of case-control andcohort studies.IARC Sci Publ 251-261)。在大多數(shù)提供信息的研究中，通過(guò)侵入性癌癥及重度CIN病變之間的顯著一致性已觀察到了與HPV16DNA的強(qiáng)烈相關(guān)，排除了這種相關(guān)能夠被解釋為偶然、偏見(jiàn)或混淆的可能性(IARC monographs，1995)。間接證據(jù)顯示，癌癥細(xì)胞中檢測(cè)到的HPV DNA是針對(duì)癌發(fā)生早期HPV感染作用的優(yōu)良標(biāo)記物。有報(bào)道顯示，在增加的病毒負(fù)載和宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)之間存在劑量應(yīng)答關(guān)系(Munoz and Bosch，1992 ibid)。在一些更大的系列中，高達(dá)100％的腫瘤是HPV陽(yáng)性的，但病毒為陰性的宮頸癌的存在仍然是可以檢測(cè)到的(Meijer CJ，等人，(1992)Detection of human papillomavirus incervical scrapes by the polymerase chain reaction in relation to cytologypossible implications for cervical cancer screening.IARC Sci Publ 271-281；Das BC，等人，(1993)Cancer 72147-153)。
在鱗狀細(xì)胞宮頸癌中發(fā)現(xiàn)最頻繁的HPV類(lèi)型是HPV 16(41％-86％)和18(2％-22％)。另外也發(fā)現(xiàn)了HPV31、33、35、39、45、51、52、54、56、58、59、61、66和68(IARC，monographs，1995)。在巴塞羅那的HPV2000國(guó)際會(huì)議中HPV 16、18、31和45被定義為高風(fēng)險(xiǎn)，而HPV33、35、39、51、52、56、58、59、68被定義為中等風(fēng)險(xiǎn)(Keerti V.Shah.P71)。這13種高風(fēng)險(xiǎn)加上中等風(fēng)險(xiǎn)的HPV通常被一起稱(chēng)為癌癥相關(guān)的HPV類(lèi)型。
大量的研究已經(jīng)揭示了HPV檢驗(yàn)在宮頸篩選中的潛在作用(見(jiàn)Cuzick等人A systematic review of the role of human papillomavirustesting withing a cervical screening programme.Health Technol Assess314.1999)。
Reid等人(Reid R，等人，(1991)Am J Obstet Gynecol 1641461-1469)最先展示了HPV檢驗(yàn)在篩選中的作用。這一研究在來(lái)自性傳播疾病診所和婦科專(zhuān)家的高風(fēng)險(xiǎn)女性中執(zhí)行，并且使用了敏感(低嚴(yán)謹(jǐn)性)Southern印跡雜交來(lái)檢測(cè)HPV?？偣采婕?012名女性，并且把子宮頸造影(cervicography)也考慮為細(xì)胞學(xué)的可能輔助。一共發(fā)現(xiàn)23例CIN II/III病變，但只有12例被細(xì)胞學(xué)手段探測(cè)到(敏感性52％，特異性92％)。HPV檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)16例高度病變。
Bauer等人(Bauer HM，等人，(1991)JAMA 265472-477)報(bào)道了在參加常規(guī)涂片檢測(cè)的年輕女性(大學(xué)生)中使用MY09/11引物進(jìn)行的早期基于PCR的研究(Manos M，等人，(1990)Lancet 335734)。他們發(fā)現(xiàn)在467個(gè)女性中有46％的陽(yáng)性比率，這比點(diǎn)印跡分析的比率(11％)高許多。
在使用GP5/6引物(Van DenBrule AJ，等人，(1990)J ClinMicrobiol 282739-2743)進(jìn)行PCR的研究中van der Brule等人(VanDen Brule AJ，etal.，(1991)Int J Cancer 48404-408)展示了HPV陽(yáng)性和根據(jù)細(xì)胞學(xué)評(píng)估出的宮頸腫瘤形成之間的非常強(qiáng)的相關(guān)性。在年紀(jì)大一些的細(xì)胞學(xué)陰性的女性(35-55歲)中HPV陽(yáng)性比率僅為3.5％，并且如果僅僅考慮類(lèi)型6、18、31和33這會(huì)降低到1.5％，然而具有組織學(xué)原位癌癥的女性都是HPV-陽(yáng)性的，并且90％具有上述四種類(lèi)型之一。以分級(jí)的方式，具有較少的嚴(yán)重組織學(xué)異常的女性有較低的HPV陽(yáng)性比率，這顯示出了一種清楚的趨勢(shì)。
Roda Housman等人(Roda Housman AM，等人，(1994)Int JCancer 56802-806)通過(guò)觀測(cè)另外1373名女性的異常涂片檢測(cè)擴(kuò)展了這些觀察。這一研究也證實(shí)了增加的陽(yáng)性比率伴隨著涂片結(jié)果的嚴(yán)重性的增加。他們也注意到HPV非均一性的水平從針對(duì)低度涂片的22種類(lèi)型降低到針對(duì)高度涂片的10種“高風(fēng)險(xiǎn)”類(lèi)型。這篇文獻(xiàn)沒(méi)有包括任何細(xì)胞學(xué)陰性的女性或是由組織學(xué)證實(shí)的細(xì)胞學(xué)疾病。
Cuzick等人(Cuzick J，等人，(1992)Lancet 340112-113；Cuzick J，等人，(1994)Br J Cancer 69167-171)首次報(bào)道了HPV檢測(cè)可提供有用的信息用于對(duì)隨機(jī)篩選中檢測(cè)到的細(xì)胞學(xué)異?；颊哌M(jìn)行分類(lèi)。在一項(xiàng)涉及133名女性的研究中，參照結(jié)腸鏡檢查他們發(fā)現(xiàn)了42％的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，這與中度核異常的數(shù)值相近。這些結(jié)果對(duì)HPV16來(lái)說(shuō)最為明顯，42例HPV16陽(yáng)性的女性中有39例在活體檢查中發(fā)現(xiàn)了高度CIN。這一研究指出了評(píng)估病毒負(fù)載的重要性，并且只考慮高水平的高風(fēng)險(xiǎn)類(lèi)型作為陽(yáng)性。
Cox等人(Cox JT，等人，(1995)Am J Obstet Gynecol 172946-954)展示了使用雜交捕獲系統(tǒng)(DIGENE Corporation，Gaithersburg，MD，USA)的HPV檢驗(yàn)用于通過(guò)邊界涂片檢驗(yàn)對(duì)女性患者進(jìn)行揀別分類(lèi)的作用。這一檢驗(yàn)進(jìn)行于來(lái)自一所大學(xué)轉(zhuǎn)診服務(wù)的217位此類(lèi)女性，發(fā)現(xiàn)針對(duì)CINII/III具有93％的敏感性，而相比之下，針對(duì)重復(fù)細(xì)胞學(xué)的比率為73％。通過(guò)減少假陽(yáng)性，發(fā)現(xiàn)高病毒負(fù)載，以提高性能。當(dāng)以5RLU作為界限值，在不損失靈敏度下發(fā)現(xiàn)了大約24％的PPV。
WO 91/08312描述了測(cè)定感染HPV的個(gè)體預(yù)后的方法，其包含通過(guò)檢測(cè)樣品中E6和/或E7 HPV基因的全部或一部分的轉(zhuǎn)錄本來(lái)測(cè)量HPV活性水平，并且對(duì)HPV的活性測(cè)量值和預(yù)先建立的活性與嚴(yán)重宮頸發(fā)育不良或腫瘤進(jìn)程風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系加以比較。
WO 99/29890描述了基于測(cè)量和分析基因表達(dá)水平以評(píng)估HPV感染的方法。特別地，WO 99/29890描述了下述方法，所述方法基于測(cè)量2種或更多HPV基因(例如HPV E6，E7，LI和E2)表達(dá)水平，以及繼而對(duì)這些基因的組合的表達(dá)比率加以比較，以提供對(duì)患者體內(nèi)基于HPV的疾病階段的指示。
本發(fā)明人先前已經(jīng)確定僅基于對(duì)E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的簡(jiǎn)單陽(yáng)性/陰性分析來(lái)進(jìn)行臨床上有用的、對(duì)HPV相關(guān)疾病的評(píng)估是可能的，該方法并不需要對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行精確的定量測(cè)量。該方法從技術(shù)上講是簡(jiǎn)單的，在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法可適應(yīng)于中高通量模式的自動(dòng)操作。在申請(qǐng)人的公開(kāi)的國(guó)際申請(qǐng)WO 03/57914中對(duì)該方法進(jìn)行了詳細(xì)的描述。
在WO 03/57914中描述的方法優(yōu)選使用Pre-Tect HPV-ProoferTM試劑盒來(lái)進(jìn)行，該試劑盒可從商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)自Norchip AS。HPVProofer分析提供了三種水平上的信息(1)鑒別出5種特異不同的HPV-類(lèi)型(16、18、31、33和45)的mRNA；(2)確定癌基因HPV E6/E7mRNA的存在；和(3)確定指示調(diào)控障礙的全長(zhǎng)E6/E7mRNA的存在。
對(duì)每份樣品進(jìn)行了三次雙重NASBA反應(yīng)，因此針對(duì)每份樣品報(bào)道六個(gè)結(jié)果。每次都包括陰性對(duì)照以監(jiān)測(cè)污染。所有HPV類(lèi)型都包括陽(yáng)性對(duì)照以監(jiān)測(cè)試劑的性能。固有的細(xì)胞對(duì)照U1A mRNA(細(xì)胞持家基因)監(jiān)測(cè)整個(gè)檢驗(yàn)流程以消除可能的假陽(yáng)性。HPV-Proofer分析是不可能檢測(cè)HPV DNA的。PreTect分析軟件(PAS)用于自動(dòng)常規(guī)數(shù)據(jù)分析、解釋和報(bào)告。
HPV-Proofer分析的用途已經(jīng)由至少12項(xiàng)臨床研究評(píng)估。
發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)確定Pre-Tect HPV-ProoferTM分析不能檢測(cè)HPV病毒粒子，即使它能夠檢測(cè)來(lái)自于HPV 16、18、31、33和45的HPV-mRNA。相反地，E6/E7轉(zhuǎn)錄本的存在，如可通過(guò)HPV-Proofer分析確定的，可以指示轉(zhuǎn)錄調(diào)控的缺失及復(fù)制能力的缺失，和/或編碼全長(zhǎng)E6蛋白的、穩(wěn)定的E6/E7 pre-mRNA的表達(dá)。Pre-Tect HPV-Proofer可以用于檢測(cè)感染的病毒HPV顆粒，這是因?yàn)楫?dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控缺失且病毒處于整合狀態(tài)時(shí)病毒不能制造病毒粒子。使用HPV-Proofer檢測(cè)到的在細(xì)胞中代表E6/E7表達(dá)陽(yáng)性的病毒已經(jīng)偏離了它們正常的生命周期，并且要么喪失了它們對(duì)來(lái)自所有E6/E7轉(zhuǎn)錄本啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制的調(diào)控，或者要么喪失了剪接能力，將E6/E7轉(zhuǎn)錄本留在后面或表達(dá)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的全長(zhǎng)pre-mRNA的穩(wěn)定形式。
發(fā)明人還已經(jīng)觀察到，E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本在感染HPV的細(xì)胞中的表達(dá)與以出現(xiàn)增大的細(xì)胞核、非整倍性(一般多于5或9個(gè)著絲點(diǎn)/細(xì)胞)以及有絲分裂為特征的細(xì)胞變化相關(guān)。E6/E7表達(dá)陽(yáng)性(例如使用PreTect HPV-Proofer檢驗(yàn))的細(xì)胞有時(shí)是不正常的，其顯示出細(xì)胞異?；蚓哂写蟮某墒旒?xì)胞核。這些結(jié)果也和宮頸病變的細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)特征相關(guān)。細(xì)胞學(xué)上或組織學(xué)上定義的缺乏具有增大細(xì)胞核并具有少于9個(gè)著絲點(diǎn)的細(xì)胞的低度病變不能給出用HPV-Proofer檢測(cè)E6/E7 mRNA表達(dá)的陽(yáng)性結(jié)果。
因此，發(fā)明人已經(jīng)確定人乳頭瘤病毒E6/E7轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)可用作為與存在人乳頭瘤病毒持續(xù)感染相關(guān)的細(xì)胞異常存在的分子指示物。E6/E7表達(dá)的檢測(cè)因此可能用于鑒別高度和低度宮頸病變。特別地，E6/E7表達(dá)的檢測(cè)可以辨別組織學(xué)定義的沒(méi)有非整倍性染色體的CINIII樣品和那些具有非整倍性染色體細(xì)胞的樣品；編碼全長(zhǎng)E6蛋白的E6/E7 mRNA陽(yáng)性的樣品被認(rèn)定為具有非整倍性染色體的細(xì)胞。E6/E7表達(dá)的檢測(cè)也可以鑒別組織學(xué)定義的進(jìn)入退化階段CIN III或CIN II(HSIL病例)病例與那些感染持續(xù)或發(fā)展的病例；編碼全長(zhǎng)E6蛋白的E6/E7 mRNA陽(yáng)性的樣品被認(rèn)定為如果不處理的話很可能具有可以發(fā)展的感染。
本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)一步得出結(jié)論(1)E6/E7癌基因表達(dá)的發(fā)病率隨著病變的嚴(yán)重程度而上升。
(2)通過(guò)評(píng)估E6/E7表達(dá)來(lái)檢測(cè)HPV癌基因活性，任選地與對(duì)HPV分類(lèi)結(jié)合，是高度病變的有效預(yù)測(cè)物。
(3)絕大部分的宮頸癌(96％)含有五種主要致癌HPV類(lèi)型(HPV16、18、31、33和45)中的至少一種。
(4)與那些沒(méi)有陽(yáng)性HPV-Proofer結(jié)果的患者相比，利用Pre-TectHPV-ProoferTM檢驗(yàn)出E6/E7表達(dá)陽(yáng)性的患者更可能具有持續(xù)的感染。
相應(yīng)地，第一方面本發(fā)明提供了一種體外方法，所述方法針對(duì)至少一種細(xì)胞或組織中人乳頭瘤病毒存在篩選人類(lèi)受試者，其中人乳頭瘤病毒顯示出了E6/E7 mRNA表達(dá)調(diào)控的缺失以及編碼全長(zhǎng)E6蛋白的穩(wěn)定前mRNA的復(fù)制和/或表達(dá)的缺失，本方法包括在包含來(lái)源于細(xì)胞或組織mRNA的檢驗(yàn)樣品中檢測(cè)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的人乳頭瘤病毒E6/E7基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在，其中此類(lèi)E6/E7 mRNA在樣品中的存在轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為是在組織和細(xì)胞中存在下述人乳頭瘤病毒的指示，所述病毒顯示出了具有E6/E7 mRNA表達(dá)調(diào)控的缺失以及編碼全長(zhǎng)E6蛋白的穩(wěn)定前mRNA的復(fù)制和/或表達(dá)的缺失。
第二個(gè)方面本發(fā)明提供了一種體外方法，所述方法針對(duì)至少一種細(xì)胞或組織中存在的以增大的細(xì)胞核和細(xì)胞非整倍性為特征的細(xì)胞變化來(lái)篩選人類(lèi)受試者，該方法包括在包含來(lái)源于細(xì)胞或組織mRNA的檢驗(yàn)樣品中檢測(cè)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的人乳頭瘤病毒E6/E7基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在，其中此類(lèi)E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本在樣品中的存在被認(rèn)為是受試細(xì)胞或組織顯示出細(xì)胞變化的指示物。
第三個(gè)方面本發(fā)明提供了一種體外方法，所述方法針對(duì)至少一種細(xì)胞或組織中人乳頭瘤病毒持續(xù)轉(zhuǎn)化感染的存在來(lái)篩選人類(lèi)受試者，本方法包括在包含來(lái)源于細(xì)胞或組織mRNA的檢驗(yàn)樣品中篩選出具有編碼全長(zhǎng)E6蛋白的人乳頭瘤病毒E6/E7基因mRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的受試者，其中具有人乳頭瘤病毒E6/E7基因此類(lèi)mRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)陽(yáng)性的受試者被認(rèn)為在細(xì)胞或組織中具有人乳頭瘤病毒的持續(xù)轉(zhuǎn)化感染。
由編碼下述HPV亞型之一的全長(zhǎng)E6蛋白的人乳頭瘤病毒E6/E7轉(zhuǎn)錄本的存在所鑒定出的16、18、31、33或45型HPV之一的“持續(xù)轉(zhuǎn)化感染”，被認(rèn)為等同于細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)評(píng)估出的持續(xù)細(xì)胞異?；虺掷m(xù)CIN III病變、原位癌癥或者高度鱗狀上皮病變(HSIL)。因此，本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法提供了篩選等同于持續(xù)細(xì)胞異?；虺掷m(xù)CINIII病變、原位癌癥或者高度鱗狀上皮病變(HSIL)的人乳頭瘤病毒持續(xù)轉(zhuǎn)化感染的方法。
由編碼全長(zhǎng)E6蛋白的人乳頭瘤病毒E6/E7基因的mRNA的持續(xù)存在所定義的HPV持續(xù)轉(zhuǎn)化感染可能和持續(xù)的CIN II+直接相關(guān)，因此可在宮頸篩查程序中作為預(yù)后性癥狀的標(biāo)記物。特別地，本發(fā)明的方法可以用于對(duì)基于細(xì)胞學(xué)/組織學(xué)確認(rèn)為具有非典型未確定意義的鱗狀細(xì)胞或低度鱗狀上皮病變的女性患者進(jìn)行揀別分類(lèi)。對(duì)所述患者的管理是使人困惑的，因?yàn)橹挥幸恍〔糠謺?huì)發(fā)展成為宮頸上皮腫瘤形成(CIN)III和侵入性宮頸癌(ICC)。通過(guò)細(xì)胞學(xué)/組織學(xué)的繼續(xù)檢驗(yàn)不能確認(rèn)所有那些處于高CIN II+風(fēng)險(xiǎn)的女性。在本文報(bào)道的臨床研究中，對(duì)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的全長(zhǎng)E6/E7基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)，顯示出了針對(duì)高度宮頸病變的顯著特異性，這表面此類(lèi)轉(zhuǎn)錄本的存在提供了一種有用的預(yù)后性癥狀標(biāo)記物。
使用本發(fā)明的方法得到的陽(yáng)性的篩選結(jié)果是由檢測(cè)到編碼全長(zhǎng)E6蛋白的E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)所指示的。E6/E7 mRNA表達(dá)的陽(yáng)性結(jié)果指示了受試者攜帶了下述病毒，所述此病毒顯示出E6/E7 mRNA表達(dá)調(diào)控的缺失和/或所述病毒表達(dá)編碼全長(zhǎng)的E6蛋白的穩(wěn)定前mRNA，該結(jié)果進(jìn)一步表明受試者具有異常的細(xì)胞變化。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“E6/E7調(diào)控的缺失”指或者缺失了對(duì)所有E6/E7轉(zhuǎn)錄本啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制調(diào)控，或者缺失了E6/E7開(kāi)放讀碼框中正常的剪接能力。
術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的前mRNA”是指還沒(méi)有經(jīng)歷E6開(kāi)放讀碼框中的任何剪接事件、并且因此編碼全長(zhǎng)蛋白、且比由相同HPV亞型的天然或野生型人乳頭瘤病毒所表達(dá)的編碼全長(zhǎng)E6蛋白的任何等同初級(jí)(未剪接)E6/E7轉(zhuǎn)錄本更穩(wěn)定(即，顯示出更長(zhǎng)的半衰期)的初級(jí)E6/E7轉(zhuǎn)錄本。天然或野生型人乳頭瘤病毒是指沒(méi)有與持續(xù)感染人類(lèi)宿主相關(guān)的基因組修飾并且沒(méi)有整合到人類(lèi)基因組內(nèi)的病毒。這樣的天然和野生型病毒也具有緊隨轉(zhuǎn)錄發(fā)生的E6/E7前mRNA或全長(zhǎng)mRNA轉(zhuǎn)錄本剪接的特征，使得全長(zhǎng)前mRNA不會(huì)在細(xì)胞中積累至任何顯著的程度。因此，前mRNA一般并不在被天然或野生型病毒感染的細(xì)胞中翻譯出全長(zhǎng)E6蛋白，這是因?yàn)榍癿RNA在翻譯發(fā)生前會(huì)被剪接器件加工。然而，在具有與持續(xù)HPV轉(zhuǎn)化感染相關(guān)的異常的細(xì)胞中，前mRNA是穩(wěn)定的和/或不被剪接的并且因此可以在細(xì)胞內(nèi)聚集到一個(gè)在正常細(xì)胞或正常增殖細(xì)胞(例如被復(fù)制中的HPV感染的細(xì)胞)中所不能觀察到的水平。
相對(duì)于在天然型或野生型病毒中表達(dá)的初級(jí)E6/E7(未剪接)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本而言，穩(wěn)定前mRNA可以被修飾，例如在位于編碼E6蛋白的開(kāi)放讀碼框之外的轉(zhuǎn)錄本區(qū)域中，刪除HPV序列或加入轉(zhuǎn)錄自作為病毒整合結(jié)果的人基因組的mRNA序列。因此穩(wěn)定的前mRNA可以是與天然型或野生型病毒表達(dá)的E6/E7初級(jí)(未剪接)轉(zhuǎn)錄本不同的序列和結(jié)構(gòu)，但其將仍然編碼全長(zhǎng)E6蛋白。
術(shù)語(yǔ)“異常細(xì)胞變化”包括了以比低度宮頸病變或低鱗狀上皮病變更嚴(yán)重的疾病為特征的細(xì)胞變化，包括了以等價(jià)或嚴(yán)重于高度CIN(特征為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的腫瘤擴(kuò)張)、CIN(宮頸上皮腫瘤形成)III、或高鱗狀上皮腫瘤形成(HSIL)的疾病為特征的細(xì)胞變化，包括了多倍DNA增殖病變和伴隨有增加的平均DNA指示值、高百分比的DNA非整倍性和2.5c過(guò)度率的“惡性”CIN病變(Hanselaar等人，1992，AnalCell Pathol.，4315-324；Rihet etal.，1996，J.Clin Pathol49892-896；和McDermott等人，1997，Br.J.Obstet Gynaecol.104623-625).。
宮頸上皮腫瘤形成(縮寫(xiě)為CIN)也稱(chēng)作宮頸發(fā)育不良，是人乳頭狀瘤病毒導(dǎo)致的一種宮頸狀況。CIN根據(jù)其嚴(yán)重性分為I，II或III級(jí)。它被認(rèn)為是一種前癌性異常，卻并不是實(shí)際的癌癥。最溫和的類(lèi)型，CIN I，通常只會(huì)保持自身狀態(tài)，雖然它很少能發(fā)展成癌癥。更加嚴(yán)重的類(lèi)型，CIN II and CIN III，大部分通常保持原態(tài)或隨時(shí)間而變得更嚴(yán)重。它們能夠成為癌癥，但是如果經(jīng)常治療，大多數(shù)情況下不會(huì)這樣。
HPV已經(jīng)被定義為一種在子宮頸細(xì)胞變化發(fā)展中的病原體，它能導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)展。這些細(xì)胞變化和來(lái)自于HPV病毒基因組的E6/E7蛋白的組成性或持續(xù)表達(dá)相關(guān)。因此，可以推論出其中E6/E7 mRNA表達(dá)可被檢測(cè)到的受試者，特別是那些經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的評(píng)估時(shí)顯示出持續(xù)E6/E7表達(dá)的受試者，子宮頸已發(fā)生了明顯細(xì)胞變化。這些變化可能已經(jīng)發(fā)生于子宮頸的極少數(shù)細(xì)胞中，并且可能沒(méi)有被常規(guī)的細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)到。盡管如此，隨著敏感、特異和準(zhǔn)確的檢測(cè)E6/E7 mRNA的方法的使用，鑒定出在比使用傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)篩選方法可能探測(cè)到的時(shí)間更早得多的階段已經(jīng)顯示出子宮頸細(xì)胞變化的受試者已經(jīng)成為可能。這將允許針對(duì)預(yù)防宮頸癌發(fā)展的治療更早地介入。
作為HPV整合至人基因組的結(jié)果或者作為在修飾過(guò)的游離HPV基因組中發(fā)生的“修飾作用”的結(jié)果，對(duì)病毒E6/E7癌基因轉(zhuǎn)錄的正?？刂埔呀?jīng)缺失(Durst etal.，1985，J Gen Virol，66(Pt 7)1515-1522；Pater and Pater，1985 Virology 145313-318；Schwarz etal.，1985，Nature 314111-114；Park etal.，1997，ibid)。相反，在惡變前的病變和HPV感染的正常上皮中乳頭瘤病毒主要為“未經(jīng)修飾的”游離體形式，因此癌基因(E6/E7)的轉(zhuǎn)錄可能缺乏或被有效負(fù)調(diào)節(jié)(Johnson etal.，1990，J Gen Virol，71(Pt 7)1473-1479；Falcinelli etal.，1993，J MedVirol，40261-265)。觀察到人乳頭瘤病毒類(lèi)型16的DNA整合進(jìn)入人基因組會(huì)導(dǎo)致更加不穩(wěn)定的細(xì)胞活性/基因組，并且增加了E6和E7mRNA的穩(wěn)定性(Jeon and Lambert，1995，ProcNatl Acad Sci USA 921654-1658)。因此普遍發(fā)現(xiàn)于宮頸癌中但僅僅偶然發(fā)現(xiàn)于CIN病變中的HPV整合，(Carmody etal.，1996，Mol Cell Probes，10107-116)，是宮頸癌發(fā)生中的一個(gè)重要事件。
在臨床實(shí)踐中，依賴僅篩選E6/E7 mRNA表達(dá)的方法的性能?chē)?yán)重依賴可信地獲得針對(duì)E6/E7 mRNA表達(dá)的陰性結(jié)果的能力。這也需要具有最大靈敏度因此產(chǎn)生最少的假陰性結(jié)果的檢測(cè)技術(shù)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)使用靈敏的擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)以篩選E6/E7mRNA的存在或不存在來(lái)實(shí)現(xiàn)這樣的效果。最優(yōu)選的技術(shù)是使用分子信標(biāo)探針的實(shí)時(shí)NASBA擴(kuò)增，該技術(shù)由Leone等人在Nucleic AcidsResearch.，1998，Vol 26，2150-2155中描述。由于本項(xiàng)技術(shù)的靈敏度，假陰性結(jié)果的發(fā)生被最小化，“陰性E6/E7表達(dá)”的結(jié)果可以以更高的置信水平來(lái)獲得。如果這種檢驗(yàn)被用于臨床篩選程序的實(shí)踐中，這一點(diǎn)就是極端重要的。
優(yōu)選地，針對(duì)來(lái)自于16、18、31、33和45型HPV中任何一種或多種(更優(yōu)選是全部)的E6/E7 mRNA的表達(dá)加以檢驗(yàn)。在一種實(shí)施方案中，這一分析可以只檢測(cè)上述HPV類(lèi)型。來(lái)自于16、18、31和33型HPV的DNA已經(jīng)在超過(guò)96％的來(lái)自于挪威人群的宮頸癌患者樣品中被檢測(cè)到。其它研究已顯示，大多數(shù)情況下，E6和E7不變地保留在宮頸癌中，因?yàn)槠浔磉_(dá)很可能是轉(zhuǎn)化為惡性狀態(tài)和維持惡性狀態(tài)所必需的(Choo etal.，1987，J Med Virol 21101-107；Durst etal.，1995，Cancer Genet Cytogenet，85105-112)。和基于對(duì)未損傷的基因組或LI基因序列的檢測(cè)的HPV檢測(cè)系統(tǒng)相反，對(duì)表達(dá)自E6/E7區(qū)域的HPVmRNA的檢測(cè)可以檢測(cè)出超過(guò)90％的、與發(fā)展宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)的患者。
在臨床中，基于檢測(cè)E6/E7 mRNA的方法可以用于后篩選或患者揀別分類(lèi)，即對(duì)具有前期ASCUS，CIN1或扁平濕疣癥狀個(gè)體的進(jìn)一步分析。此方法可以用于從具有前期ASCUS，CIN1或扁平濕疣診斷癥狀的個(gè)體群中挑選出那些具有發(fā)展成宮頸癌的高風(fēng)險(xiǎn)的患者。由于不同細(xì)胞學(xué)家和細(xì)胞學(xué)系之間非常低的再現(xiàn)性，ASCUS，扁平濕疣和CIN1或多或少可以被定義為同樣的癥狀，Ostor(Int J.Gyn Path.12186-192.1993)發(fā)現(xiàn)只有1％左右的CIN 1病例可能發(fā)展為宮頸癌，因此迫切需要一種鑒別出具有發(fā)展出宮頸癌的實(shí)質(zhì)性風(fēng)險(xiǎn)的ASCUS，扁平濕疣或CIN I的個(gè)體亞組的有效的方法。Karlsen等人在1996年的研究中，在87％的宮頸癌病例中檢測(cè)到了16、18、31或33型HPV之一的存在。再加上HPV 45，接近90％的宮頸癌樣品被發(fā)現(xiàn)和這5類(lèi)HPV類(lèi)型相關(guān)。因此，從Ostor(Int J.Gyn Path.12186-192.1993)提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，超過(guò)99.9％是被檢測(cè)到具有ASCUS，具有CIN I或扁平濕疣檢的病例被我們的HPV-Proofer試劑盒所遺漏。
本方法的高靈敏度和特異性意味著它可以在針對(duì)檢驗(yàn)女性是否具有發(fā)展為宮頸癌的高或很高風(fēng)險(xiǎn)的初始篩選、回復(fù)-檢驗(yàn)試劑盒或常規(guī)診斷中發(fā)揮作用。
在本發(fā)明的方法中，mRNA的“陽(yáng)性表達(dá)”被認(rèn)為是高于背景的平均表達(dá)。這并不絕對(duì)需要對(duì)E6/E7 mRNA表達(dá)水平的精確定量。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以包括對(duì)mRNA表達(dá)水平的定量測(cè)量。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，為了明確區(qū)分“陽(yáng)性表達(dá)”和“陰性表達(dá)”，確定“陽(yáng)性表達(dá)”可能需要超過(guò)50個(gè)拷貝的相關(guān)mRNA(每毫升樣品或每總體積樣品)的存在，而確定“陰性表達(dá)”可能需要少于1個(gè)拷貝的相關(guān)mRNA(每毫升樣品或每總體積樣品)的存在。
本發(fā)明的方法將優(yōu)選涉及通過(guò)使用能夠特異地檢測(cè)來(lái)自癌癥相關(guān)的HPV類(lèi)型(更加優(yōu)選地，來(lái)自“高風(fēng)險(xiǎn)”的癌癥相關(guān)HPV類(lèi)型)的E6/E7 mRNA的技術(shù)，來(lái)篩選E6/E7 mRNA。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法涉及通過(guò)使用能夠檢測(cè)來(lái)自16、18、31和33型、優(yōu)選45型HPV的E6 mRNA的技術(shù)來(lái)篩選E6/E7 mRNA。最優(yōu)選地，該方法將特異檢測(cè)來(lái)自HPV 16、18、31、33型和優(yōu)選地，還有45型的至少一種的E6/E7 mRNA的表達(dá)，并且最優(yōu)選得，特異檢測(cè)來(lái)自所有五種類(lèi)型的E6/E7 mRNA的表達(dá)。然而，來(lái)源于16、18、31、33和45型之外的例如35、39、45、52、56、58、59、66和68型的E6/E7表達(dá)陽(yáng)性的女性可能仍然有明顯的細(xì)胞異常。因此，本方法可以包括從對(duì)來(lái)自上述一種或多種HPV類(lèi)型的E6/E7 mRNA的表達(dá)加以篩選，最優(yōu)選地，這在除對(duì)來(lái)自16、18、31、33和45型HPV的E6/E7 mRNA的篩選外進(jìn)行。某些HPV類(lèi)型呈現(xiàn)顯著的地理/種群分布。因此，包括已知在所檢驗(yàn)的地理/種群區(qū)域中流行的HPV類(lèi)型是合適的，例如除對(duì)16、18、31、33和45型HPV進(jìn)行篩選之外。
本發(fā)明的方法以對(duì)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的HPV類(lèi)型中的一些或全部的全長(zhǎng)E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)為基礎(chǔ)。在這些實(shí)施方案中，全長(zhǎng)E6/E7 mRNA的存在被認(rèn)為是陽(yáng)性篩選結(jié)果。
術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本”不包括任何天然存在的剪接變體，但包括編碼功能性全長(zhǎng)E6和E7蛋白的雙順?lè)醋愚D(zhuǎn)錄本。四種E6/E7 mRNA類(lèi)型迄今為止已經(jīng)在被HPV16感染的細(xì)胞中得到描述，即未剪接的E6轉(zhuǎn)錄本和三種被命名為E6*I、E6*II和E6*III的剪接轉(zhuǎn)錄本(Smotkin D，等人，J Virol.1989 Mar 63(3)1441-7；Smotkin D，Wettstein FO.ProcNatl Acad Sci USA.1986 Jul 83(13)4680-4；Doorbar J.等人，Virology.1990 Sep 178(1)254-62；Cornelissen MT，等人J Gen Virol.1990 May 71(Pt 5)1243-6；Johnson MA，等人JGen Virol.1990 Jul 71(Pt 7)1473-9；Schneider-Maunoury S，等人JVirol.1987 Oct 61(10)3295-8；Sherman L，等人Int J Cancer.1992Feb 50(3)356-64)。所有四種轉(zhuǎn)錄本是由恰恰位于E6 ORF第二個(gè)ATG上游的單一啟動(dòng)子(p97)所驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的。在HPV16的情形中，術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)E6/E7轉(zhuǎn)錄本”是指包含E6 ORF第97-880位核苷酸的所有或基本上所有區(qū)域的轉(zhuǎn)錄本，包含第97位和880位的核苷酸在內(nèi)。核苷酸的位置是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)HPV命名表(see Human PapillomavirusCompendium OnLine，available via the internet or in paper form fromHV Database，Mail Stop K710，Los Alamos National Laboratory，LosAlamos，NM 87545，USA)而編號(hào)的。
關(guān)于除HPV16之外的HPV類(lèi)型，“全長(zhǎng)”E6/E7轉(zhuǎn)錄本可能認(rèn)為包含含有與HPV16 E6/E7的上述轉(zhuǎn)錄本同源的序列的轉(zhuǎn)錄本，而不包括E6剪接變體。HPV類(lèi)型的各種序列比對(duì)可從人乳頭瘤病毒在線中公開(kāi)獲得。
對(duì)全長(zhǎng)E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本的特異檢測(cè)可以通過(guò)以下方式來(lái)實(shí)施，例如，使用特異于只出現(xiàn)在全長(zhǎng)E6/E7轉(zhuǎn)錄本中而不出現(xiàn)剪接變體中的區(qū)域的引物或探針。
E6*I轉(zhuǎn)錄本顯示缺失了226到409(在16型HPV中)位核苷酸之間的編碼序列并且E*611轉(zhuǎn)錄本顯示缺失了226到526(在16型HPV中)位核苷酸之間的編碼序列。因此優(yōu)選使用至少一種來(lái)自位于16型HPV的226和409位核苷酸之間的區(qū)域或來(lái)自18、31、33或45型HPV之一的同源區(qū)域的引物或探針。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的特異性可通過(guò)使用下述引物對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述引物對(duì)中一個(gè)引物特異對(duì)應(yīng)于位于此區(qū)域內(nèi)的序列并且另一個(gè)引物特異對(duì)應(yīng)位于此區(qū)域之外的序列，或者兩條引物都特異于此區(qū)域內(nèi)的序列，優(yōu)選地，與特異于位于此區(qū)域內(nèi)序列的探針相連接。在其它實(shí)施方案中，可以組合使用兩條引物都特異于位于此區(qū)域之外的序列的引物對(duì)，和特異于此區(qū)域內(nèi)序列的探針，以賦予對(duì)編碼全長(zhǎng)E6的mRNA的特異性。
不同的HPV類(lèi)型呈現(xiàn)不同的E6/E7 mRNA表達(dá)模式?？捎糜谳o助設(shè)計(jì)用于探針或引物以檢測(cè)全長(zhǎng)E6/E7轉(zhuǎn)錄本的多種HPV類(lèi)型(包括HPV16和31型)的轉(zhuǎn)錄圖可通過(guò)人乳頭瘤病毒(Human PapillomavirusCompendium)公開(kāi)獲得(參上)。
分析方法學(xué)本發(fā)明的方法包括在至少一種細(xì)胞或組織中，更具體地，在包含來(lái)自于至少一種細(xì)胞或組織的RNA的樣品中，篩選E6/E7轉(zhuǎn)錄本的存在。此至少一種細(xì)胞或組織必須包括至少一種懷疑感染了人乳頭瘤病毒的子宮頸細(xì)胞，例如子宮頸上皮細(xì)胞。
這里公開(kāi)的篩選方法可以在從含有受試者體內(nèi)取出的宮頸細(xì)胞的臨床樣品或者活組織切片中分離出的核酸制備品上執(zhí)行?？捎米骱怂醽?lái)源的合適樣品包括(但并不僅僅包括)子宮頸拭抹物、子宮頸活體檢測(cè)物、子宮頸刮擦物、通過(guò)使用毛刷和棉塞移除的樣品、皮膚活體檢測(cè)物/瘤，也包括石蠟包埋的組織和福爾馬林或甲醇固定的細(xì)胞。
使用本發(fā)明公開(kāi)的方法制備用于篩選的核酸必須包含mRNA，然而它并不需要是純化的poly A+mRNA制品，總RNA制品或包含RNA和基因組DNA的總核酸粗制品，甚至細(xì)胞裂解粗產(chǎn)物也適合成為NASBA反應(yīng)的起始材料。本質(zhì)上而言，本領(lǐng)域已知的任何用于分離包含mRNA的核酸制品的技術(shù)都可以用于從檢驗(yàn)樣品中分離核酸。優(yōu)選的技術(shù)是US-A-5,234,809和EP-B-0389,063中描述的“Boom”分離方法。這種方法，其能用于分離包含RNA和DNA的核酸制品，其是以在離液劑硫氰酸酯胍(GuSCN)存在條件下核酸與二氧化硅顆粒的結(jié)合特點(diǎn)為基礎(chǔ)的。
本方法以分析HPV基因組的轉(zhuǎn)錄活性為基礎(chǔ)。本方法并不限于用于檢測(cè)RNA表達(dá)的精密技術(shù)。本領(lǐng)域已知許多可用于檢測(cè)特定mRNA序列的技術(shù)，它們都可以用于本發(fā)明中。例如，特異mRNA可以通過(guò)雜交、擴(kuò)增或測(cè)序技術(shù)被檢測(cè)。
最優(yōu)選的是使用擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá)，最優(yōu)選的是如NASBA的等溫?cái)U(kuò)增、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)擴(kuò)增、信號(hào)調(diào)節(jié)RNA擴(kuò)增技術(shù)、等溫液相擴(kuò)增等。所有這些方法都已是熟知的現(xiàn)有技術(shù)。更優(yōu)選地，mRNA的表達(dá)是通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增組合擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)來(lái)檢測(cè)的。最優(yōu)選的組合為通過(guò)NASBA的擴(kuò)增，組合利用分子信標(biāo)技術(shù)進(jìn)行的對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，如Leone等人在Nucleic Acids Research，1998，Vol 26，2150-2155所描述的。
使用NASBA技術(shù)在檢驗(yàn)樣品中檢測(cè)HPV的方法總體上包括如以下步驟(a)配制反應(yīng)介質(zhì)，其包括合適的引物對(duì)、RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶、水解RNA-DNA雜合體中RNA鏈且不會(huì)水解單鏈或雙鏈RNA或DNA的核糖核酸酶、識(shí)別所述啟動(dòng)子的RNA聚合酶，和核糖核苷及三磷酸脫氧核糖核苷；(b)將介質(zhì)和分離自懷疑包含HPV的檢驗(yàn)樣品中的核酸制品在允許NASBA擴(kuò)增反應(yīng)的條件下進(jìn)行溫育；和(c)檢測(cè)和/或定量測(cè)量NASBA擴(kuò)增反應(yīng)的任何HPV特異性產(chǎn)物。
對(duì)NASBA反應(yīng)的特異產(chǎn)物(例如目標(biāo)RNA的正義和/或反義拷貝)的檢測(cè)可以通過(guò)多種不同方法執(zhí)行。在其中一種方法中，NASBA產(chǎn)物可以通過(guò)使用能特異性地退火到NASBA產(chǎn)物的HPV特異性雜交探針來(lái)檢測(cè)。該雜交探針可以附著在示蹤標(biāo)記物上，例如熒光、發(fā)光、放射性或化學(xué)發(fā)光化合物，或酶標(biāo)或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它任何標(biāo)記物。標(biāo)記物的具體性質(zhì)并不重要，但它應(yīng)該能夠通過(guò)其自身或與一種或多種附加物質(zhì)(例如酶的底物)聯(lián)合產(chǎn)生可被外部設(shè)備檢測(cè)到的信號(hào)。
優(yōu)選的檢測(cè)方法是能夠允許在反應(yīng)全程連續(xù)監(jiān)測(cè)NASBA反應(yīng)產(chǎn)物形成的所謂的“實(shí)時(shí)NASBA”。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，這可以通過(guò)使用“分子信標(biāo)”探針而實(shí)現(xiàn)，所述探針包含能退火到NASBA產(chǎn)物的HPV特異性序列，形成雙莖的寡核苷酸序列和一對(duì)熒光/淬滅部分，如本領(lǐng)域已知的和在此所述的。如果分子信標(biāo)探針在擴(kuò)增前加到反應(yīng)混合物中它就可能實(shí)時(shí)監(jiān)控NASBA產(chǎn)物的形成(Leone etal.，Nucleic Acids Research，1998，Vol 26，2150-2155)。進(jìn)行實(shí)時(shí)NASBA的試劑盒和操作指南是商業(yè)可得的(例如NucliSens EasyQ system，fromOrganon Teknika)。
在另一種方法中，分子信標(biāo)技術(shù)可以和引物2寡核苷酸合并，從而無(wú)需單獨(dú)的雜交探針就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)NASBA反應(yīng)。
在又一種方法中，可以通過(guò)使用能和引物2寡核苷酸5′端的核酸序列雜交的一般標(biāo)記檢測(cè)探針來(lái)監(jiān)測(cè)NASBA反應(yīng)的產(chǎn)物。這等同于Organon Teknika提供的“NucliSensTM”檢測(cè)系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)中，來(lái)源于目標(biāo)HPV mRNA的NASBA產(chǎn)物的特異性可以通過(guò)使用下述HPV特異性的捕獲探針來(lái)賦予，所述探針包含這里描述的、吸附在如磁性微珠一類(lèi)的固體支持物上的探針寡核苷酸。最優(yōu)選地，一般標(biāo)記檢測(cè)探針是Organon Teknika提供的ECL檢測(cè)探針。NASBA擴(kuò)增子可和HPV特異性的捕獲探針及一般ECL探針雜交(通過(guò)引物2上的互補(bǔ)序列)。雜交之后微珠/擴(kuò)增產(chǎn)物/ECL探針復(fù)合物可以在自動(dòng)ECL讀數(shù)機(jī)(例如Organon Teknika提供的NucliSens讀數(shù)機(jī))的磁性電極上被捕獲。接下來(lái)，壓脈沖引發(fā)了ECL反應(yīng)。
本方法的優(yōu)選實(shí)施方案依賴于擴(kuò)增出至少為主要的癌癥相關(guān)的HPV類(lèi)型16，18，31和33以及優(yōu)選還有HPV45的E6/E7 mRNA。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)有多種不同方法。
在一種實(shí)施方案中，特異對(duì)應(yīng)于16、18、31和33優(yōu)選45型HPV的單獨(dú)引物對(duì)可以單個(gè)用來(lái)擴(kuò)增來(lái)自每一種HPV類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄本。另外，在一個(gè)反應(yīng)容器中的兩種或多種引物對(duì)的混合物可用來(lái)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)的多元復(fù)用。
在另一種實(shí)施方案中，能夠擴(kuò)增來(lái)自16、18、31和33型以及優(yōu)選還有45型HPV的E6/E7基因區(qū)域的單一的引物對(duì)可以使用，其因此能夠在一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增所有4(優(yōu)選5)種類(lèi)型。這能夠，例如，通過(guò)使用一對(duì)簡(jiǎn)并引物或選擇在各個(gè)HPV類(lèi)型中高度保守的E6/E7mRNA區(qū)域而實(shí)現(xiàn)。
E6/E7引物對(duì)可以相應(yīng)于E6/E7 mRNA的任何區(qū)域，并且可以擴(kuò)增E7開(kāi)放讀碼框和/或E6的開(kāi)放讀碼框的所有或一部分。優(yōu)選地，它能夠擴(kuò)增編碼全長(zhǎng)E6蛋白的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。
在另一種方法中，針對(duì)多種HPV類(lèi)型的特異性可以通過(guò)使用簡(jiǎn)并寡核苷酸引物或者顯示較小序列變異(優(yōu)選對(duì)應(yīng)于HPV基因型之間的序列變異)的多核苷酸的復(fù)雜混合物而實(shí)現(xiàn)。使用這樣的簡(jiǎn)并引物或混合物的基本原理是混合物可以包含至少一種可以檢測(cè)每一種HPV類(lèi)型的引物對(duì)。
在又一種方法中，針對(duì)多種HPV類(lèi)型的特異性可以通過(guò)在引物中，優(yōu)選在HPV基因型之間的序列變異的位點(diǎn)上，將一個(gè)或多個(gè)次黃嘌呤核苷酸摻入而實(shí)現(xiàn)。
在WO 03/057914和WO 03/057927中可以找到可用于檢測(cè)來(lái)源于多種HPV類(lèi)型的E6/E7mRNA的合適引物和探針的清單。WO03/057914和WO 03/057927的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
本發(fā)明的方法優(yōu)選地通過(guò)使用Pre-Tect HPV-ProoferTM檢驗(yàn)和試劑盒而實(shí)施。然而，應(yīng)該理解，本發(fā)明并不僅僅限于使用這種特定的檢驗(yàn)。
本發(fā)明的方法對(duì)于真正組織學(xué)陰性的、來(lái)源于整個(gè)或部分子宮頸、尸體或/和宮頸癌的典型樣品給出陰性結(jié)果。這將提供顯著的特異性并使得PreTect HPV-ProoferTM成為已經(jīng)發(fā)展起來(lái)的最有前途的初級(jí)篩選方法之一。
已證明單獨(dú)使用PreTect HPV-ProoferTM來(lái)診斷處于發(fā)展宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)中的女性的特異性是與年齡和工作無(wú)關(guān)，其特異性是單獨(dú)使用商業(yè)化的基于DNA的檢驗(yàn)的三倍。
對(duì)E6/E7轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)具有無(wú)需重復(fù)檢驗(yàn)就可鑒別哪種高危感染能夠持續(xù)發(fā)展的潛力。E6/E7癌基因表達(dá)的發(fā)生率隨著病變的嚴(yán)重程度增加。
本發(fā)明的方法可以和通過(guò)任何合適方法進(jìn)行的HPV基因型分類(lèi)一起實(shí)施。術(shù)語(yǔ)“HPV基因型分類(lèi)”是指能夠鑒別出現(xiàn)在給定個(gè)體中存在的HPV亞型的任何技術(shù)。通過(guò)檢測(cè)E6/E7表達(dá)并結(jié)合HPV分型來(lái)評(píng)估HPV癌基因活性，將會(huì)成為針對(duì)高度病變的強(qiáng)大預(yù)報(bào)器。
參考以下實(shí)驗(yàn)性的實(shí)施例，本發(fā)明將得到進(jìn)一步的理解。
Pre-Tect HPV ProoferTM檢驗(yàn)對(duì)涉及使用Pre-Tect HPVProoferTM試劑盒和檢驗(yàn)的所有實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例而言，檢驗(yàn)是通過(guò)使用商業(yè)可得的試劑盒并依照提供的操作手冊(cè)而實(shí)施的。關(guān)于實(shí)時(shí)檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA的檢驗(yàn)操作的更多信息可以在WO 03/057914中找到，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
下面的實(shí)驗(yàn)部分總結(jié)了使用Pre-Tect HPV-ProoferTM檢驗(yàn)和試劑盒所獲得的臨床數(shù)據(jù)。
實(shí)施例1-從門(mén)診病人群體中選出的4136例子宮頸樣品中的致癌人乳頭瘤病毒(HPV)的E6和E7 mRNA的表達(dá)本研究的目的是鑒定經(jīng)由組織學(xué)確認(rèn)的細(xì)胞學(xué)HGSIL/CIN3樣品中E6/E7 mRNA和DNA的存在。
材料和方法樣品采集自經(jīng)過(guò)仔細(xì)篩選的門(mén)診病人群體，包括大于30歲的女性(n＝4136)。來(lái)自于每一種高風(fēng)險(xiǎn)HPV類(lèi)型16、18、31、33和45的E6/E7轉(zhuǎn)錄本由基于實(shí)時(shí)多路NASBA的PreTect HPV-Proofer檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)(NorChip AS，Klokkarstua，Norway)。通過(guò)Gp5+/6+一致性PCR來(lái)研究HPV DNA的存在，并且繼而將HPV DNA陽(yáng)性樣品用于針對(duì)16、18、31、33和45型HPV的類(lèi)型特異PCR。具有細(xì)胞學(xué)HGSIL癥狀的女性是通過(guò)組織活體檢測(cè)和組織學(xué)檢測(cè)而確定的。
組織學(xué)上確認(rèn)的病例已登記在挪威癌癥登記中心(NorwegianCancer Registry)。在挪威，細(xì)胞學(xué)HGSIL可以分為HGSIL/AGUS，HGSIL/ASC-H，HGSIL/CIN2和HGSIL/CIN3。
結(jié)果25例細(xì)胞學(xué)HGSIL病例中，14例是組織學(xué)上確認(rèn)為CIN2+的。兩例組織學(xué)CIN2+病例通過(guò)細(xì)胞學(xué)診斷為HGSIL/ASC-H和HGSIL/CIN2。PreTect HPV Proofer檢測(cè)到了52％(13/25)的細(xì)胞學(xué)HGSIL病例、86％(12/14)的組織學(xué)CIN2+病例，以及組織學(xué)未驗(yàn)證的9％(1/11)的細(xì)胞學(xué)HGSIL病例。Gp5+/6+PCR的數(shù)值分別是64％(16/25)，93％(13/14)和27％(3/11)。有一例經(jīng)過(guò)一致性PCR檢驗(yàn)為陽(yáng)性，而經(jīng)PreTect HPV-Proofer檢測(cè)為陰性的組織學(xué)CIN2+樣品被證明是HPV 35。HGSIL/CIN3的流行率是0.29％(12/4136)，而組織學(xué)CIN2+的流行率是56％(14/25)。PreTect HPV-Proofer和一致性PCR的敏感性、特異性和陽(yáng)性與陰性預(yù)期值在表1中示出。
表1
PPV＝陽(yáng)性預(yù)期值NPV＝陰性預(yù)期值討論和結(jié)論細(xì)胞學(xué)HGSIL/CIN3和組織CIN2+病例之間有很好的一致性，只有僅僅一例細(xì)胞學(xué)HGSIL/CIN3沒(méi)有被組織學(xué)鑒定為CIN2+。組織學(xué)上驗(yàn)證出的CIN2+病例中，針對(duì)HPV DNA和mRNA的檢測(cè)等級(jí)都是高的，并且?guī)缀醯韧?。在未被組織學(xué)驗(yàn)證的細(xì)胞學(xué)HGSIL病例中，用于PreTect HPV-Proofer的檢測(cè)等級(jí)低于用于一致性PCR的。合起來(lái)，細(xì)胞學(xué)HGSIL/CIN3和PreTect HPV-Proofer檢測(cè)到了所有的組織學(xué)CIN2+。
總之，來(lái)自于五種最經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的致癌HPV類(lèi)型，HPV 16、18、31、33和45的HPV E6/E7轉(zhuǎn)錄本，看起來(lái)存在于幾乎所有組織學(xué)CIN2+病例中。PreTect HPV-Proofer的高特異性和陽(yáng)性預(yù)期值在HPV診斷中是一個(gè)有利條件，并且因此mRNA檢測(cè)是對(duì)細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)的合適補(bǔ)充。
實(shí)施例2-HPV檢測(cè)在瑞典婦科學(xué)篩選程序中作為低度病變的繼續(xù)追查在瑞典，每年大約有40000例細(xì)胞學(xué)病例顯示出了異常狀況并需要繼續(xù)追查。大部分病例自然地恢復(fù)了但有些病例如果不處理則會(huì)繼續(xù)發(fā)展。繼續(xù)追查程序中也存在細(xì)胞學(xué)低靈敏度的問(wèn)題。在對(duì)癌癥前期病變的檢測(cè)中，當(dāng)HPV檢驗(yàn)是在對(duì)細(xì)胞學(xué)ASCUS或CIN I的檢測(cè)完成后再實(shí)施時(shí)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)特異性和靈敏度有飛躍性的提高。
主要的目的是在瑞典篩選程序中，評(píng)價(jià)HPV RNA和DNA檢驗(yàn)相對(duì)于細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)的各自的作用。另一個(gè)重要的目的是評(píng)估在具有CIN I或ASCUS但呈現(xiàn)HPV RNA或DNA檢驗(yàn)陰性的女性中缺失CINII+的風(fēng)險(xiǎn)。
測(cè)試材料來(lái)自對(duì)瑞典中部地區(qū)常規(guī)篩選程序之后的15000名女性。細(xì)胞學(xué)上呈ASCUS或CIN I陽(yáng)性的所有女性被選出用于進(jìn)一步的研究。所有的細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)材料都由有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)者進(jìn)行盲式(blindly)重新評(píng)估。對(duì)ASCUS和CIN I陽(yáng)性樣品(N＝240)使用PreTect HPV-Proofer(N＝240)進(jìn)行評(píng)估，并且四個(gè)月后將一組隨機(jī)選擇的樣品用于雜交捕獲II(HCII)與細(xì)胞學(xué)(N＝127)檢驗(yàn)和單獨(dú)的細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)。將其與7個(gè)月后用組織學(xué)進(jìn)行的LEEP活體組織檢測(cè)(N＝126)，和12個(gè)月后使用PreTect HPV-Proofer(N＝240)、HCII和細(xì)胞學(xué)進(jìn)行的檢測(cè)相比較(表2)。檢驗(yàn)了所有ASCUS和CIN I樣品的mRNA。陰道鏡(Coloposcopy)定位的LEEP活體組織檢測(cè)(N＝126)被用作為對(duì)所有具有異常細(xì)胞學(xué)癥狀和/或陽(yáng)性HPV DNA檢驗(yàn)結(jié)果(4個(gè)月后)的女性進(jìn)行的繼續(xù)追查的一部分。使用HCII分析(Digene，Gatesburg，MD，USA)來(lái)檢測(cè)HPV DNA。對(duì)來(lái)自于HPV 16、18、31、33和45的E6/E7mRNA轉(zhuǎn)錄本的鑒定和個(gè)體分類(lèi)是通過(guò)使用PreTectHPV-Proofer分析(NorChip AS，Klokkarstua，Norway)來(lái)進(jìn)行的。
結(jié)果HPV檢驗(yàn)的結(jié)果已經(jīng)與細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性診斷4個(gè)月和12個(gè)月后的細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果以及7個(gè)月后的進(jìn)行的組織學(xué)診斷結(jié)果進(jìn)行了比較。HPV類(lèi)型的頻率和分布狀態(tài)在表3中顯示。在19％的病例中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果之間的一致性。在組織學(xué)的良性和低度病變中細(xì)胞學(xué)和DNA檢驗(yàn)比RNA檢驗(yàn)有更普遍的陽(yáng)性機(jī)率。組織學(xué)作為“黃金標(biāo)準(zhǔn)”的情況下，和DNA檢測(cè)(分別是31％和51％)相比，RNA檢驗(yàn)顯示出了更高的陽(yáng)性預(yù)期值和更高的特異性(分別是46％和85.3％)。然而DNA檢驗(yàn)(91％)顯示出了比RNA檢驗(yàn)(81％)更高的敏感性。通過(guò)LEEP宮頸錐形切除術(shù)治療的病例中的19％在治療5個(gè)月后顯示出異常的細(xì)胞學(xué)特征，0.5％的發(fā)現(xiàn)是CIN II+。在這些病例的24％中檢測(cè)到了HPV DNA，并且6％檢測(cè)到了HPV RNA.(表2)表2全部的結(jié)果
表3組織學(xué)結(jié)果與HPV DNA、RNA和細(xì)胞學(xué)結(jié)果的對(duì)比
討論和結(jié)論與基于DNA的方法相比，基于RNA的方法具有較高的陽(yáng)性預(yù)期值和較高的特異性，這可以用下述事實(shí)來(lái)解釋E6/E7癌基因的表達(dá)是惡性表型的維持和發(fā)展所需要的。具有CIN I或ASCUS但呈現(xiàn)HPVRNA或DNA檢驗(yàn)陰性的女性中缺失CIN II+的風(fēng)險(xiǎn)非常之低(0.2％)，這證實(shí)了在細(xì)胞學(xué)ASCUS或CIN I中HPV檢驗(yàn)的附加價(jià)值。
實(shí)施例3-在年齡小于30歲的女性中不伴隨癌基因表達(dá)的高危HPV感染人乳頭瘤病毒(HPV)是女性中常見(jiàn)的病毒感染，特別是在年輕群體中，雖然大部分感染是暫時(shí)的和沒(méi)有癥狀的。在斯堪的納維亞國(guó)家中，HPV在30歲以上女性人群中的流行率在5到15％之間變化，在年輕的女性中HPV流行率可能高達(dá)30-40％。并且，70-80％性活躍的女性會(huì)在她們一生中某個(gè)階段獲得HPV感染。然而，大很多的感染會(huì)自然地清除，只有一小部分會(huì)持續(xù)并發(fā)展成宮頸上皮細(xì)胞病變(CIN)。
本研究的目的是在年齡小于30歲的女性中比較對(duì)E6/E7轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)和對(duì)HPV DNA的檢測(cè)。
材料和方法總共檢測(cè)了282例30歲以下(平均年齡26.9歲)女性的子宮頸樣品。使用NucliSens Extractor提取RNA和DNA，并使用PreTectHPV-Proofer檢驗(yàn)(NorChip AS，Klokkarstua，Norway)來(lái)檢測(cè)16、18、31、33，和45型致癌HPV的E6/E7 mRNA表達(dá)。通過(guò)Gp5+/6+一致性PCR檢查HPV DNA的存在，然后對(duì)HPV DNA陽(yáng)性的樣品進(jìn)行針對(duì)同樣5種HPV類(lèi)型的特異PCR。
結(jié)果通過(guò)Gp5+/6+PCR檢測(cè)占總數(shù)32.6％(n＝92)的樣品是HPV DNA陽(yáng)性的，并且發(fā)現(xiàn)24.8％(n＝70)的是類(lèi)型16、18、31、33和45。僅僅在15.2％(n＝43)的病例中觀察到來(lái)自于同樣五種HPV類(lèi)型的E6/E7mRNA。
五種致癌HPV類(lèi)型16、18、31、33和45占據(jù)了HPV DNA陽(yáng)性樣品中的76％(70/92)，同時(shí)在這些病例中有61％(43/70)檢測(cè)到了E6/E7 mRNA表達(dá)。
在282例里的8例(2.8％)中獲得了細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性的結(jié)果，其中8例里的5例觀察到了ASCUS，并且8例里的3例觀察到了HPV扁平濕疣。對(duì)ASCUS病例而言，在5例里的4例中通過(guò)Gp5+/6+一致性PCR和類(lèi)型特異性PCR檢測(cè)到了HPV DNA，然而只發(fā)現(xiàn)一例樣品包含HPVmRNA。然而，對(duì)HPV扁平濕疣的病例而言，通過(guò)Gp5+/6+一致性PCR在所有樣品(n＝3)中都檢測(cè)到了HPV DNA，并且通過(guò)類(lèi)型特異PCR檢測(cè)到3例中的兩例有HPV DNA，而通過(guò)PreTect HPV Proofer只在1例中檢測(cè)到了HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)。
討論在30歲以下女性中HPV存在率高于年長(zhǎng)的女性。和其它類(lèi)型相比，5種致癌HPV類(lèi)型16、18、31、33和45的流行率也是同樣的規(guī)律。缺少E6/E7轉(zhuǎn)錄本可能反映出了病毒的游離體狀態(tài)以及由此的、對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的受控調(diào)節(jié)。這些感染更可能被清除。然而，病毒的整合可能會(huì)打斷E2基因，并因此也擾亂了E2基因作為E6/E7轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的功能。
結(jié)論在這一年輕的門(mén)診病人群體中，在少于50％的一致性PCR陽(yáng)性樣品中檢測(cè)到了伴隨癌基因表達(dá)的HPV感染。因此，監(jiān)測(cè)針對(duì)16、18、31、33和45型HPV的E6/E7基因表達(dá)可以成為除細(xì)胞學(xué)檢測(cè)之外的有價(jià)值的診斷檢驗(yàn)。mRNA檢測(cè)可能對(duì)年輕女性的進(jìn)展性疾病更具分辨能力。
實(shí)施例4-基于DNA的HPV檢驗(yàn)方法和基于RNA的HPV檢驗(yàn)方法的比較本研究的目的是驗(yàn)證針對(duì)HPV檢驗(yàn)的兩種商業(yè)可得的分析方法，以調(diào)查在細(xì)胞學(xué)上呈陰性和陽(yáng)性的女性中高危HPV感染的流行率，并且在與細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)檢驗(yàn)相對(duì)比的情況下對(duì)基于DNA和基于RNA檢驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。
材料和方法本研究的群體選自門(mén)診部門(mén)和婦科醫(yī)生的私人實(shí)踐。在本研究中包括了628名女性，她們具有40歲的平均年齡(范圍，19-85歲)。首先進(jìn)行了傳統(tǒng)Pap涂片檢測(cè)，并且將剩余的材料轉(zhuǎn)移到PreservCytTM管(Cytyc Corporation)中。通過(guò)使用雜交捕獲II分析(DigeneCorporation)技術(shù)、經(jīng)過(guò)Pre Tect HPV-Proofer分析(NorChip AS)對(duì)來(lái)自16、18、31、33和45型HPV的E6/E7 mRNA進(jìn)行專(zhuān)門(mén)鑒別的技術(shù)以及實(shí)時(shí)NASBA技術(shù)來(lái)實(shí)施對(duì)高危HPV DNA(類(lèi)型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)的檢測(cè)。
當(dāng)HPV檢驗(yàn)為陽(yáng)性或者細(xì)胞學(xué)顯示為HSIL的時(shí)候進(jìn)行活體組織檢測(cè)。組織學(xué)被認(rèn)為是“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。
結(jié)果在53％的病例中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)的一致性。在61％的具有良性或低度細(xì)胞學(xué)癥狀的女性中檢測(cè)出了高度組織學(xué)癥狀(CIN 2+)。Kappa值是0.31。在17％(109/628)的病例中兩個(gè)檢驗(yàn)具有不同結(jié)果(表4)。
表4在兩種HPV檢驗(yàn)結(jié)果不同的病例中進(jìn)行的與組織學(xué)相關(guān)的HPV檢驗(yàn)
兩種HPV檢驗(yàn)都顯示出了和病變等級(jí)的顯著相關(guān)(p＜0.001)。在良性和低度病變中DNA檢驗(yàn)陽(yáng)性比例更高。和RNA檢驗(yàn)相比，DNA檢驗(yàn)顯示出更高的靈敏度但具有更低的特異性(表5)。
表5用于檢測(cè)在組織學(xué)確定的CIN 2+的HPV檢驗(yàn)的性能表現(xiàn)
結(jié)論和DNA檢驗(yàn)相比，RNA檢驗(yàn)顯示出了更高的預(yù)后性癥狀價(jià)值和特異性。
實(shí)施例5-HPV類(lèi)型特異性的DNA和RNA持續(xù)在使用線性陣列檢驗(yàn)的HPV基因分型所確認(rèn)的呈HPV陽(yáng)性但并沒(méi)有任何細(xì)胞學(xué)疾病的54名女性中，分析HPV感染的過(guò)程和持續(xù)。
通過(guò)在兩年后重復(fù)HPV基因分型檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)評(píng)估來(lái)監(jiān)測(cè)HPV感染對(duì)宮頸細(xì)胞異常(核異常)發(fā)展的影響。使用HPV-Proofer檢驗(yàn)對(duì)已知HPV癌基因E6和E7的HPV轉(zhuǎn)錄檢測(cè)是在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都進(jìn)行的。
材料和方法設(shè)計(jì)用來(lái)評(píng)估HPV持續(xù)性(基線)的正在進(jìn)行中的研究的一部分涉及超過(guò)3000名的女性，從其中2000人中獲得了基于液體的細(xì)胞學(xué)(LBC)樣品。LBC涉及在包含細(xì)胞維持溶液的管中漂洗子宮頸樣品，而不是像在實(shí)施傳統(tǒng)帕帕尼古拉烏涂片檢測(cè)時(shí)將其直接沉積在載玻片上那樣。初級(jí)護(hù)理人員進(jìn)行標(biāo)本收集，通過(guò)ThinPreps程序制造平層載玻片，并且根據(jù)英國(guó)臨床細(xì)胞學(xué)指南協(xié)會(huì)(British Society for ClinicalCytology guidelines)來(lái)實(shí)施細(xì)胞學(xué)分級(jí)。在基準(zhǔn)日挑選出了54名女性的群體，這是基于具有細(xì)胞學(xué)正常結(jié)果但同時(shí)針對(duì)至少一種的下列高危HPV類(lèi)型16、18、31、33和45(考慮到在歐洲最普遍發(fā)現(xiàn)的高危類(lèi)型以及在超過(guò)90％的癌癥中涉及到的)呈現(xiàn)HPV DNA陽(yáng)性來(lái)選擇的。在實(shí)施細(xì)胞學(xué)評(píng)估和HPV的DNA及RNA檢驗(yàn)的基準(zhǔn)日兩年之后，重新召回這些女性進(jìn)行LBC涂片檢測(cè)追查。
經(jīng)過(guò)細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)之后，LBC樣品中的剩余細(xì)胞在3,500rpm條件下離心10分鐘，并在提取核酸并進(jìn)行HPV檢測(cè)之前在-70℃條件下將其儲(chǔ)藏為分開(kāi)的細(xì)胞團(tuán)粒。通過(guò)使用由QIAamp96 DNA SwabBioRobotTM試劑盒提供的試劑，使用BioRobot 9604(QIAGEN Ltd.，Crawley，UK)進(jìn)行自動(dòng)的DNA提取，而根據(jù)制造商的指示書(shū)，依照針對(duì)從動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行分離的操作手冊(cè)，應(yīng)用RNeasy柱(QIAGEN Ltd.)進(jìn)行RNA的提取。核酸在進(jìn)行HPV檢測(cè)前儲(chǔ)藏在-70℃條件下。
使用線性陣列雜交分析(LA)進(jìn)行HPV DNA基因分型檢測(cè)，其中LA涉及由PGMY引物組產(chǎn)生的450個(gè)核苷酸長(zhǎng)短的PCR復(fù)制子與包含固定探針的尼龍條帶[Gravitt等人，2000；Coutlee等人，2002]的雜交。此條帶包括兩種水平的β-珠蛋白控制引物、18種高危HPV(HR-HPV)探針16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、55、56、58、59、68、73、82、83，和9種低危HPV(LR-HPV)探針6、11、40、42、53、54、57、66、84。PCR試劑、探針條帶和進(jìn)展試劑由洛希分子系統(tǒng)(Roche Molecular Systems)，Inc.(Alameda)提供。任何檢驗(yàn)出β-珠蛋白陰性的樣品將從分析中排除。經(jīng)過(guò)等溫NASBA擴(kuò)增獲得RNA擴(kuò)增產(chǎn)品，并使用直接針對(duì)16、18、31、33、45型HPV的全長(zhǎng)E6/E7 mRNA的分子信標(biāo)探針實(shí)施類(lèi)型特異性檢測(cè)。所有用于NASBA擴(kuò)增和HPV檢測(cè)的試劑作為PreTects HPV-ProoferKit(NorChip，Klokkarstua，Norway)的一部分提供。通過(guò)使用NucliSensEasyQ Analyzer實(shí)時(shí)地進(jìn)行mRNA聚集產(chǎn)物的熒光檢測(cè)，并且使用PreTect分析軟件(PAS，NorChip)分析熒光特征。
結(jié)果經(jīng)過(guò)DNA分型檢測(cè)的監(jiān)測(cè)，兩年后54名女性中的11例(20％)發(fā)展為核異常，54名女性中的31例和54名女性中的23例分別顯示出了暫時(shí)的和持續(xù)的感染。和那些顯示出暫時(shí)感染的女性相比，維持類(lèi)型特異性持續(xù)HPV感染的女性更可能發(fā)展為核異常(P＜0.001)。HPVmRNA E6-E7轉(zhuǎn)錄本的存在對(duì)于后續(xù)過(guò)程中檢測(cè)疾病而言具有較低的靈敏度而較高的特異性。另外，和在基準(zhǔn)日僅檢測(cè)到陽(yáng)性DNA的女性相比，在基準(zhǔn)日同時(shí)具有陽(yáng)性mRNA轉(zhuǎn)錄本和DNA的女性非常可能獲有持續(xù)的感染(P＜0.013)。這一研究突顯了檢測(cè)持續(xù)類(lèi)型特異性HPV感染對(duì)于鑒別那些具有發(fā)展為宮頸異常的更高風(fēng)險(xiǎn)的女性的重要性。檢測(cè)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的E6/E7轉(zhuǎn)錄本具有鑒別哪些高危HPV感染可能會(huì)持續(xù)的潛能，即使此檢測(cè)只在一個(gè)單一時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行且沒(méi)有重復(fù)檢驗(yàn)。E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)鑒別出了哪些感染更可能持續(xù)。
表6.利用DNA分型檢測(cè)和HPV轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)進(jìn)行追查時(shí)，從具有和不具有核異常并發(fā)證據(jù)的個(gè)體中可檢測(cè)到的持續(xù)HPV感染的比例
表7.在對(duì)11例核異常的檢測(cè)中DNA分型檢測(cè)和RNA轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)的比較
實(shí)施例6下面的表格總結(jié)了在來(lái)自于非洲門(mén)診群體的樣品中使用PreTectHPV-Proofer檢測(cè)全長(zhǎng)E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本與使用一致性及類(lèi)型特異性PCR檢測(cè)HPV DNA的比較。組織學(xué)上分為(+)的樣品是在組織學(xué)基礎(chǔ)上被評(píng)估為CIN II+的。
本研究的結(jié)果說(shuō)明了檢驗(yàn)方法針對(duì)顯示出細(xì)胞異常并基于組織學(xué)被分類(lèi)為CIN II+的樣品的特異性，該鑒定方法基于對(duì)編碼來(lái)自于16、18、31、33或45型HPV的全長(zhǎng)E6蛋白的E6/E7轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)。RNA鑒定具有和組織學(xué)相似的特異性，但具有更高的靈敏度。
權(quán)利要求
1.一種針對(duì)至少一種細(xì)胞或組織中人乳頭瘤病毒的存在篩選人類(lèi)受試者的體外方法，其中人乳頭瘤病毒顯示出了E6/E7 mRNA表達(dá)調(diào)控的缺失以及編碼全長(zhǎng)E6蛋白的穩(wěn)定前mRNA的復(fù)制和/或表達(dá)的缺失，該方法包括在包含來(lái)源于細(xì)胞或組織的mRNA的檢驗(yàn)樣品中檢測(cè)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的人乳頭瘤病毒E6/E7基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在，其中在所述樣品中存在所述E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為是代表了對(duì)下述人乳頭瘤病毒存在的指示，所述病毒在組織和細(xì)胞中具有E6/E7mRNA表達(dá)調(diào)控的缺失以及編碼全長(zhǎng)E6蛋白的穩(wěn)定前mRNA的復(fù)制和/或表達(dá)缺失。
2.一種針對(duì)至少一種細(xì)胞或組織中以增大的細(xì)胞核和細(xì)胞非整倍性為特征的細(xì)胞變化的存在來(lái)篩選人類(lèi)受試者的體外方法，該方法包括在包含來(lái)源于細(xì)胞或組織的mRNA的檢驗(yàn)樣品中檢測(cè)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的人乳頭瘤病毒E6/E7基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在，其中在所述樣品中所述E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在被認(rèn)為是受試細(xì)胞或組織顯示出細(xì)胞變化的指示。
3.一種針對(duì)至少一種細(xì)胞或組織中人乳頭瘤病毒持續(xù)轉(zhuǎn)化感染的存在來(lái)篩選人類(lèi)受試者的體外方法，該方法包括在包含來(lái)源于細(xì)胞或組織的mRNA的檢驗(yàn)樣品中針對(duì)編碼全長(zhǎng)E6蛋白的人乳頭瘤病毒E6/E7基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)篩選受試者，其中對(duì)所述人乳頭瘤病毒E6/E7基因mRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)為陽(yáng)性的受試者被認(rèn)為在細(xì)胞或組織中具有人乳頭瘤病毒的持續(xù)轉(zhuǎn)化感染。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1至3任意一項(xiàng)的方法，其包含使用能夠檢測(cè)至少一種癌癥相關(guān)的HPV類(lèi)型的E6/E7 mRNA的技術(shù)，來(lái)檢測(cè)人乳頭瘤病毒E6/E7基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其包含使用能夠檢測(cè)來(lái)自于HPV類(lèi)型16、18、31、33，以及優(yōu)選45的E6/E7 mRNA的技術(shù)來(lái)檢測(cè)人乳頭瘤病毒E6/E7基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其包含檢測(cè)來(lái)自于HPV類(lèi)型16、18、31、33或45中的任意一種或者兩種或更多種的任意組合的E6/E7基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，其中在所述樣品中存在來(lái)自于任意一種檢驗(yàn)的HPV類(lèi)型的人乳頭瘤病毒E6/E7基因mRNA轉(zhuǎn)錄本被認(rèn)為是陽(yáng)性的結(jié)果。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1至6任意一項(xiàng)的方法，其中對(duì)E6/E7基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)的檢測(cè)是利用一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)以擴(kuò)增該mRNA的一段區(qū)域、并結(jié)合對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)而實(shí)現(xiàn)的。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中對(duì)E6/E7基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)的檢測(cè)是利用實(shí)時(shí)NASBA而實(shí)現(xiàn)的。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)的檢測(cè)是利用Pre-Tect HPV ProoferTM分析試劑盒而實(shí)現(xiàn)的。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1至9任意一項(xiàng)的方法，其中人類(lèi)受試者是預(yù)先鑒定為被人乳頭瘤病毒DNA感染的受試者，優(yōu)選地，在用于檢驗(yàn)的細(xì)胞或組織中。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求1至10任意一項(xiàng)的方法，其中人類(lèi)受試者是具有預(yù)先診斷為ASCUS、CIN 1病變或扁平濕疣的受試者。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1至10任意一項(xiàng)的方法，其用于對(duì)不具有細(xì)胞學(xué)上子宮頸異常的預(yù)先診斷的個(gè)體進(jìn)行初級(jí)篩選。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)人乳頭瘤病毒(HPV)的存在篩選人類(lèi)受試者的體外方法，該病毒的存在顯示出了E6/E7 mRNA表達(dá)調(diào)控的缺失以及編碼全長(zhǎng)E6蛋白的穩(wěn)定前mRNA復(fù)制和/或表達(dá)的缺失。特別地，本發(fā)明提供了篩選持續(xù)細(xì)胞異?；虺掷m(xù)CIN III病變，原位癌癥或重度鱗狀上皮病變(HSIL)的體外方法。本方法可用于宮頸癌的篩選。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1946858SQ200580013272
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者F·卡爾森 申請(qǐng)人:諾奇普公司