專利名稱：獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。詳細(xì)地說，涉及從人類組織中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明可能用于多種疾病的治療。
當(dāng)前在生物醫(yī)學(xué)中有一個新的領(lǐng)域正在發(fā)展細(xì)胞治療。利用細(xì)胞移植可以糾正組織功能活性不足，并且可以使受累器官再生。更新和恢復(fù)的功能由體內(nèi)的干細(xì)胞接管，干細(xì)胞形成所儲備的不同細(xì)胞型的未分化前體的聚集。因此，干細(xì)胞的應(yīng)用是一個有前途的細(xì)胞治療領(lǐng)域。對于該應(yīng)用，特別重要的是從人類組織中獲得干細(xì)胞。
目前人們已經(jīng)成功地從成人體中獲得了不同類型的干細(xì)胞。詳細(xì)地說，涉及造血干細(xì)胞(血細(xì)胞的前體)、神經(jīng)元干細(xì)胞(神經(jīng)組織細(xì)胞的前體)、間充質(zhì)干細(xì)胞(能夠分化為間充質(zhì)來源的細(xì)胞以及分化為其他胚層細(xì)胞的細(xì)胞)等。
間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于它們能夠比較容易地獲得和培養(yǎng)；它們還能夠在體外增殖較長的一段時間。另外，它們具有廣譜分化。在這方面特別注意的是從成人體中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。但是，迄今為止還沒有用于獲得干細(xì)胞的通用方法。
第一次，由于干細(xì)胞能夠粘附于培養(yǎng)皿表面而得以從脊髓中獲得(Fridenshtein A.J.，Deriglazova U.F.，Kulagina N.N.等.Precursors forfibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected bythe in vitro colony assay method(通過體外集落測定法檢測的不同造血細(xì)胞群體中的成纖維細(xì)胞前體).Exp.Hematol.1974 Vol.2.P.83-92)。
該方法的缺點在于獲得的細(xì)胞群體缺乏均質(zhì)性。但是，間充質(zhì)干細(xì)胞對塑料的粘附已經(jīng)被確定為進(jìn)一步改進(jìn)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法的基礎(chǔ)。
已知一種用于獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法是基于通過使用特定批次的胎牛血清，細(xì)胞能夠粘附于培養(yǎng)皿表面的能力。因此設(shè)法獲得了具有高粘附能力、高增殖速度和長時間保持的多能性的細(xì)胞(Heynesworth S.E.，Goshima J.，Goldberg V.M.，Calplan A.I.Characterization of cells with osteogenic potential from the human bonemarrow(來自人骨髓的具有成骨能力的細(xì)胞的表征)//Bone.1995.Vol.13.P.81-85)。
該方法的缺點在于，在尋找適合細(xì)胞培養(yǎng)的批次的過程中對血清的分析需要足大量的時間和勞動；而且，結(jié)果的再現(xiàn)是不可能的。
眾所周知利用進(jìn)行抗Stro-1(具有未知功能的抗原)抗體選擇的方法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，Stro-1在間充質(zhì)干細(xì)胞表面短暫表達(dá)(Grontos S.，Simmons P.J.The growth factors requirements of Stro-1positive human stromal precursors under serum-deprived conditions invitro(在體外的除去血清的條件下Stro-1陽性人基質(zhì)前體的生長因子需求)//Blood.1995.Vol.85.P.929-940)。
該方法涉及極其復(fù)雜的過程，由于前期的抗體制備，是非常費時的。
已知一種用于獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法是通過在Ficoll梯度中離心獲得單核細(xì)胞，選擇針對在間充質(zhì)干細(xì)胞表面上表達(dá)的表面抗原CD105的抗體，以及培養(yǎng)粘附于塑料的細(xì)胞。CD105+細(xì)胞的比例占單核細(xì)胞的2-3％。結(jié)果有可能獲得一個細(xì)胞群體，該細(xì)胞群體顯示間充質(zhì)干細(xì)胞特有的形態(tài)學(xué)和表面抗原表達(dá)譜并且還具有軟骨形成(chondregenic)能力(Majumdar M.K.，Banks V.，Peluso D.P.，Morris E.A.Isolation，characterization，and chondregenic potential of human bone marrow-derivedmultipotential stromal cells(人骨髓來源的多能基質(zhì)細(xì)胞的分離、表征和軟骨形成能力)//J.Cell.Physiol.2000.Vol.185.P.98-106)。
該方法能夠獲得富含間充質(zhì)干細(xì)胞的CD105+細(xì)胞級分，但是該方法需要額外的選擇階段，在該選擇階段中使用固定于磁珠上的抗體。因此損失掉一部分細(xì)胞，從而需要額外的勞動。
眾所周知，隨著年齡的增長，人體中的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)目顯著減少。它們的增殖和分化能力也降低(Rao M.S.，Mattson M.P.Stemcell and agingexpanding the possibilities(干細(xì)胞與老化擴(kuò)大可能性)//Mech.Ageing Dev.2001.Vol.122.P.713-734)。由于這個原因，人們正在研究具有高增殖活性和分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備，例如分別來源于胎兒組織或幼年器官。
本領(lǐng)域中已知一種用于從胎兒后代血液中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。為了獲得它們，通過在Ficoll梯度中離心制備單核細(xì)胞級分，并且在有利于間充質(zhì)干細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這樣獲得的細(xì)胞分別顯示骨形成或脂肪形成能力(Campagnoli C.，Roberts I.A.，Kumar S.等.Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first trimesterfetal blood，liver，and bone marrow(人妊娠早期胎兒血液、肝臟和骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞/祖細(xì)胞的鑒定)//Blood.2001.Vol.98.P.2396-2402)。
從該來源中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的缺點在于胎兒組織在獲取方面存在問題。而且，人們不得不面對與其使用相關(guān)的倫理問題。此外，已經(jīng)證實這樣獲得的細(xì)胞群體不是均質(zhì)性的76％的樣品含有破骨細(xì)胞樣細(xì)胞；它們表達(dá)特有的抗原CD45、CD51/CD61，并且是CD64(巨噬細(xì)胞的標(biāo)記)、SH2(間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記)、CD31(內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記)陰性的。只有26％的樣品由類似于間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞組成，并且表達(dá)SH2、SH3、SH4、MAB1470、CD13、CD29、CD49e、CD54、CD90、ASMA，并且是CD31和vWF(內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記)陰性的。
已知用于從臍靜脈的內(nèi)皮下層獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法(RomanovY.A.，Svinitskaya V.A.，Smirnov V.N.Searching for alternative sources ofpostnatal human mesenchymal stem cells；candiate MSC-like cells fromumbilical cord(尋找出生后人類間充質(zhì)干細(xì)胞的替代來源；來自臍帶的候選MSC樣細(xì)胞)//Stem Cells.2003.Vol.21.P.105-110)。為了這些目的，用膠原酶IV溶液內(nèi)部短時間(15分鐘)處理臍靜脈。這樣獲得的細(xì)胞在添加10％FBS的DMEM-LG中培養(yǎng)。這樣，獲得具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)的細(xì)胞群體；它表達(dá)類似于間充質(zhì)干細(xì)胞的一系列抗原ICAM1+/-、VCAM1+、CD34-；MySM-(平滑肌肌球蛋白)；CD31-、vWF-(內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記)；CD14-、CD45-、CD68-(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的標(biāo)記)，但是它表達(dá)平滑肌纖維肌動蛋白ASMA。這樣獲得的細(xì)胞群體在體外顯示骨形成或脂肪形成能力。
該方法的缺點在于獲得的細(xì)胞群體的異質(zhì)性初級培養(yǎng)物中含有內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞在這些條件下不增殖，而肌細(xì)胞部分在培養(yǎng)中保持。
在本領(lǐng)域中已知一種用于從人脂肪抽出物(lipoaspirate)中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。在該方法中將切成小片的脂肪組織暴露于膠原酶(I型)的作用下。在中和膠原酶并且漂洗細(xì)胞懸液后進(jìn)行純化，以利用孔徑為100μm的濾器除去細(xì)胞殘余物。這樣，能夠獲得顯示特有的形態(tài)學(xué)、免疫表型并且能夠分別分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉或神經(jīng)組織的間充質(zhì)干細(xì)胞群體(Zuk P.A.，Zhu M.，Ashjian P.，De Ugarte D.D.，HuangJ.I.，Mizuno H.，Alfonso Z.C.，F(xiàn)raiser J.K.Benhaim P.和Hedrick M.H.Human adipose tissue is source of multipotent stem cells(人脂肪組織是多能干細(xì)胞的來源)//Molecular Biology of the Cell.2002.Vol.13.P.4279-4295)。
該方法具有所獲得的細(xì)胞懸液為異質(zhì)性的并且產(chǎn)量低的缺點。
利用本發(fā)明，現(xiàn)在能夠從人類組織中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，而該細(xì)胞懸液具有高均質(zhì)性。
針對此背景，本發(fā)明的一個目的是一種用于從人類組織中獲得和/或分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括以下步驟(a)提供人類組織，(b)通過酶和機(jī)械方法處理所述人類組織，獲得細(xì)胞懸液，(c)從所述懸液中除去紅細(xì)胞，和(d)過濾所述懸液，獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，其中在步驟(a)中使用脂肪組織和/或胎盤組織作為人類組織。
在用于從人類組織中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法的范圍內(nèi)，使用脂肪組織或胎盤作為人類組織。該方法可以包括將所述組織進(jìn)行破碎并且用膠原酶在Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基中的溶液進(jìn)行酶處理，利用裂解緩沖液除去紅細(xì)胞，隨后過濾所獲得的懸液。過濾可以先后利用包括100μm和10μm孔徑的濾器進(jìn)行。過濾步驟可以利用包括直徑約100μm孔徑的第一濾器進(jìn)行，然后利用包括直徑10μm孔徑的第二濾器進(jìn)行。
I型膠原酶可以用于對脂肪組織、胎盤的蛻膜或羊膜進(jìn)行酶處理。對于絨毛膜胎盤基質(zhì)的酶處理可以使用IV型膠原酶。
本發(fā)明的技術(shù)結(jié)果(細(xì)胞懸液均質(zhì)性的提高，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的提高，和細(xì)胞生存力的改善)可歸因于過濾條件，即所用濾器的濾孔的特定大小和孔的特定比例。這些參數(shù)的改變(增加或減少)將造成所述技術(shù)結(jié)果不能實現(xiàn)，因為在這種情況下，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和所獲得的細(xì)胞懸液的均質(zhì)性將顯著降低。與已知的類似方法相比，能夠獲得倍增的細(xì)胞產(chǎn)量。據(jù)申請人所述，通過進(jìn)行已知的方法，產(chǎn)量為每個質(zhì)量為1克的組織樣品得到104個細(xì)胞，而通過進(jìn)行本發(fā)明的方法，細(xì)胞的產(chǎn)量達(dá)到每個1克的組織樣品得到1.5-3×104至107個細(xì)胞。細(xì)胞懸液均質(zhì)性的提高通過形態(tài)學(xué)分析數(shù)據(jù)和免疫表型的確定而得到證明。根據(jù)申請人的數(shù)據(jù)所示，利用已知的從脂肪抽出物中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞群體的方法，該群體含有多種形態(tài)學(xué)的細(xì)胞型；在第4次傳代之前，培養(yǎng)物不會分別在細(xì)胞形狀和表面標(biāo)記的顆?；虮磉_(dá)方面成為均質(zhì)的。
該方法如下實現(xiàn)首先，用添加有抗生素(青霉素100單位/ml，鏈霉素100微克/ml)和抗真菌劑(兩性霉素B 0.25微克/ml)、不含Ca2+和Mg2+離子、含有pH7.2磷酸緩沖液(PBS)的生理鹽水溶液漂洗組織樣品。將待處理的組織切成小片；以1∶5至1∶10的組織培養(yǎng)基體積比加入含有上述抗生素和抗真菌劑的Dulbecco改進(jìn)的eagle培養(yǎng)基(DMEM，Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基)。為了酶處理，向懸液中加入膠原酶溶液直到終濃度達(dá)到0.075％。該懸液在37℃下溫育30分鐘，同時輕輕振蕩該懸液。
將這樣制備的混合物進(jìn)行攪拌，直到產(chǎn)生均質(zhì)的懸液；然后為了中和膠原酶，向制備的混合物中加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，其中含有10體積％的胎牛血清(FBS)。之后于1000g離心10分鐘。將沉淀物重懸浮于紅細(xì)胞裂解緩沖液(155mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mMNa2EDTA)中。將該混合物充分混合，在室溫下溫育3-5分鐘。
用等體積的含有抗生素和抗真菌劑的DMEM培養(yǎng)基稀釋該懸液；隨后于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。沉淀物用DMEM培養(yǎng)基漂洗，按照所述方法離心再次沉淀。將細(xì)胞懸浮于DMEM-LG培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有濃度為1g/l的葡萄糖，添加了20％FBS、抗生素和抗真菌劑。利用包括100μm和10μm孔徑的濾器過濾這樣制備的細(xì)胞懸液，每1cm2涂布1百萬個細(xì)胞。
這樣獲得的細(xì)胞群體的特征在于間充質(zhì)干細(xì)胞具有高均質(zhì)性，而過濾數(shù)據(jù)的改變(孔徑的增大和/或減小)分別導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的均質(zhì)性或細(xì)胞產(chǎn)量降低。
針對此背景，本發(fā)明的另一個目的是使用人類脂肪組織和/或胎盤組織作為用于獲得和/或分離間充質(zhì)干細(xì)胞的來源。
本發(fā)明通過以下實施方案加以說明實施例1利用小剪子從胎盤上分離蛻膜。2g組織樣品用不含Ca2+和Mg2+離子的pH 7.2的PBS(Gibco)漂洗三次，該PBS分別含有一倍的抗生素或抗真菌劑(Gibco)溶液，其中青霉素的終濃度為100單位/ml，鏈霉素為100微克/ml，兩性霉素B為0.25微克/ml。
用剪子將組織在培養(yǎng)皿中剪成小片；然后加入體積為25ml的含有抗生素和抗真菌劑的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；將該組織重新懸浮，加至50ml試管(Costar)中。
為了酶處理，向這樣制備的懸液中加入1ml含有2％I型膠原酶(Gibco)的溶液，直到達(dá)到0.075％的終濃度。該懸液在振蕩器中37℃溫育30分鐘，同時應(yīng)當(dāng)進(jìn)行緩慢振蕩。
將該混合物充分?jǐn)嚢?，直到產(chǎn)生均質(zhì)的懸液；之后向該混合物中加入25ml含有10％FBS(HyClone，PerBio)的DMEM培養(yǎng)基，以中和膠原酶。通過于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
棄去上清液。為了裂解紅細(xì)胞，將沉淀物重懸浮于20ml含有155mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA的冷緩沖液中。將該混合物充分?jǐn)嚢?，并且在室溫下溫?-5分鐘。
這樣制備的懸液用25ml含有抗生素和抗真菌劑(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基稀釋；然后于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
吸出上清液。將細(xì)胞上清液懸浮于DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行洗滌。于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞將這樣制備的細(xì)胞沉淀物懸浮于25ml DMEM-LG培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有濃度為1g/l的葡萄糖(Gibco)，并且添加了20％FBS(HyClone，PerBio)、一倍必需氨基酸溶液(Gibco)以及一倍抗生素和抗真菌劑溶液(100單位/ml青霉素，100微克/ml鏈霉素，0.25微克/ml兩性霉素B，Gibco)。
先后利用包括100μm和10μm孔徑的濾器(Millipore)過濾該細(xì)胞懸液，以清除細(xì)胞殘余物和碎片。
在Gorjajev室中計算純化細(xì)胞的數(shù)目。細(xì)胞總產(chǎn)量為108/1g組織。將細(xì)胞以各1百萬/1cm2的密度接種于75cm2培養(yǎng)瓶中。粘附細(xì)胞的比例為約1％；從蛻膜獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)量為大約106/1g組織。
24小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。一旦達(dá)到單層，即將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并且利用相差顯微鏡目視評價其形態(tài)學(xué)；計算有絲分裂指數(shù)和細(xì)胞世代時間。
基于形態(tài)學(xué)分析，根據(jù)表型確定了兩個主要的細(xì)胞群體。第一個細(xì)胞型呈現(xiàn)為梭形細(xì)胞，直徑為15-35μm，具有均質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)，低核質(zhì)比，由4至7個核仁組成的中心核。第二個類型包括較大的成纖維細(xì)胞樣延展細(xì)胞，其直徑為90μm，含有不同均質(zhì)性的細(xì)胞質(zhì)；具有低核質(zhì)比，含有2至4個核仁的中心核。因此，所分析的細(xì)胞具有人類間充質(zhì)干細(xì)胞特有的形態(tài)學(xué)。
在對數(shù)生長期計算有絲分裂指數(shù)，即有絲分裂數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值。有絲分裂指數(shù)為29.5‰。細(xì)胞世代時間為29小時。
將這樣獲得的細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析，包括用抗表面抗原CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD 117的抗體(BectonDickinson)染色，同時使用間接熒光。利用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)進(jìn)行評價。表面標(biāo)記表達(dá)對應(yīng)于間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型這些細(xì)胞是CD13、CD44、CD90、CD105陽性的和CD31、CD34、CD45、CD117陰性的。CD10的表達(dá)為中度陽性(表1)。
表1.來自胎盤蛻膜的間充質(zhì)干細(xì)胞表面上表面抗原的表達(dá)
實施例2用小剪子從胎盤上分離絨毛膜基質(zhì)。5g組織樣品用不含Ca2+和Mg2+離子的pH 7.2的PBS(Gibco)漂洗三次，該PBS(Gibco)含有一倍的抗生素和抗真菌劑溶液(Gibco)。青霉素的終濃度為100單位/ml，鏈霉素為100微克/ml，兩性霉素B為0.25微克/ml。
用剪子將該組織在10cm培養(yǎng)皿中剪成小片；然后加入25ml的含有抗生素和抗真菌劑的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；然后將該組織懸浮，加至50ml試管(Costar)中。
為了酶處理，向這樣制備的懸液中加入1ml 2％IV型膠原酶(Gibco)的溶液，直到達(dá)到0.075％的終濃度。該懸液在振蕩器中在緩慢振蕩下37℃溫育30分鐘。
將這樣制備的混合物充分?jǐn)嚢?，直到產(chǎn)生均質(zhì)的懸液；之后加入25ml含有10％FBS(HyClone，PerBio)的DMEM培養(yǎng)基，以中和膠原酶。于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
棄去上清液。為了裂解紅細(xì)胞，將沉淀物重懸浮于20ml含有155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA的冷緩沖液中。將該混合物充分?jǐn)嚢瑁⑶以谑覝叵聹赜?-5分鐘。
該懸液用體積為25ml的含有抗生素和抗真菌劑(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基稀釋；然后于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
吸出上清液。為了洗滌細(xì)胞殘余物，將后者懸浮于DMEM培養(yǎng)基中。于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
將這樣制備的細(xì)胞沉淀物懸浮于25ml DMEM-LG培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有濃度為1mg/ml的葡萄糖(Gibco)，并且添加了20％FBS(HyClone，PerBio)、一倍必需氨基酸溶液(Gibco)以及一倍抗生素和抗真菌劑溶液(100單位/ml青霉素，100微克/ml鏈霉素，0.25微克/ml兩性霉素B，Gibco)。
該細(xì)胞懸液先后利用包括100μm和10μm孔徑的濾器(Millipore)過濾，以清除細(xì)胞殘余物和碎片。
通過在Gorjajev室中評價計算純化細(xì)胞的數(shù)目。細(xì)胞總產(chǎn)量為109/1g組織。將細(xì)胞以1百萬/1cm2的密度接種于75cm2培養(yǎng)瓶中。粘附細(xì)胞的比例為約1％；從絨毛膜基質(zhì)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)量達(dá)到大約107/1g組織。
24小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。一旦達(dá)到單層，即將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并且利用相差顯微鏡目視評價其形態(tài)學(xué)；計算有絲分裂指數(shù)和細(xì)胞世代時間。
形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果是，根據(jù)表型鑒定了兩個主要的細(xì)胞群體。第一個細(xì)胞型呈現(xiàn)為梭形細(xì)胞，直徑為20-40μm，具有均質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)，低核質(zhì)比，由4至7個核仁組成的中心核。第二個類型包括較大的成纖維細(xì)胞樣延展細(xì)胞，其直徑為100μm，含有不同均質(zhì)性的細(xì)胞質(zhì)；具有低核質(zhì)比，含有2至4個核仁的中心核。因此，所分析的細(xì)胞具有人類間充質(zhì)干細(xì)胞特有的形態(tài)學(xué)。
在對數(shù)生長期計算有絲分裂指數(shù)有絲分裂數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值。有絲分裂指數(shù)為31.8‰。細(xì)胞世代時間為28小時。
將這樣獲得的細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析，包括用抗表面抗原CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD117的抗體(BectonDickinson)染色，同時使用間接熒光。利用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)進(jìn)行評價。表面標(biāo)記表達(dá)對應(yīng)于間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型。這些細(xì)胞是CD13、CD44、CD90、CD105陽性的和CD31、CD34、CD45、CD117陰性的。CD10的表達(dá)為中度陽性(表2)。
表2.來自絨毛膜胎盤基質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞表面上表面抗原的表達(dá)
實施例3用小剪子從胎盤上分離羊膜。質(zhì)量為2g的組織樣品用不含Ca2+和Mg2+離子的pH 7.2的PBS(Gibco)漂洗三次，該PBS(Gibco)分別含有一倍的抗生素或抗真菌劑溶液(Gibco)。青霉素的終濃度為100單位/ml，鏈霉素為100微克/ml，兩性霉素B為0.25微克/ml。
用剪子將組織在10cm培養(yǎng)皿中剪成小片；然后加入體積為25ml的含有抗生素和抗真菌劑的DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；然后將該組織懸浮，轉(zhuǎn)移到50ml試管(Costar)中。
為了酶處理，向這樣制備的懸液中加入1ml 1％I型膠原酶(Gibco)溶液，直到達(dá)到0.075％的終濃度。該懸液在振蕩器中在緩慢振蕩下37℃溫育30分鐘。
將這樣制備的混合物充分?jǐn)嚢?，直到產(chǎn)生均質(zhì)的懸液；之后加入25ml含有10％FBS(HyClone，PerBio)的DMEM培養(yǎng)基，以中和膠原酶。于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
棄去上清液。為了裂解紅細(xì)胞，將沉淀物重懸浮于20ml含有155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA的冷緩沖液中。將該混合物充分?jǐn)嚢?，并且在室溫下溫?分鐘。
這樣制備的懸液用體積為25ml的含有抗生素和抗真菌劑(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基稀釋；然后于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
棄去上清液。將細(xì)胞沉淀物懸浮于DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行洗滌。于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
將這樣制備的細(xì)胞沉淀物懸浮于25ml DMEM-LG培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有濃度為1g/l的葡萄糖(Gibco)，并且添加了20％FBS(HyClone，PerBio)、一倍必需氨基酸溶液(Gibco)以及一倍抗生素和抗真菌劑溶液(100單位/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，0.25μg/ml兩性霉素B，Gibco)。
然后先后利用包括100μm和10μm孔徑的濾器(Millipore)過濾細(xì)胞懸液。通過在Gorjajev室中計算評價純化細(xì)胞的數(shù)目。細(xì)胞總產(chǎn)量為108/1g組織。將細(xì)胞以1百萬/1cm2的密度接種于75cm2培養(yǎng)瓶中。粘附細(xì)胞的比例為約1％；從羊膜獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)量達(dá)到大約106/1g組織。
24小時后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。一旦達(dá)到單層，即將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并且利用相差顯微鏡目視評價其形態(tài)學(xué)；計算有絲分裂指數(shù)和細(xì)胞世代時間。
形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果是鑒定了兩個主要的細(xì)胞群體。第一個細(xì)胞型呈現(xiàn)為梭形細(xì)胞，直徑為10-30μm，含有均質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)，低核質(zhì)比，由4至7個核仁組成的中心核。第二個類型包括較大的成纖維細(xì)胞樣延展細(xì)胞，其直徑為80μm，含有不同均質(zhì)性的細(xì)胞質(zhì)；它包括較低的核-質(zhì)比，由2至4個核仁組成的中心核。因此，所分析的細(xì)胞顯示人類間充質(zhì)干細(xì)胞特有的形態(tài)學(xué)。
在對數(shù)生長期計算有絲分裂指數(shù)有絲分裂數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值。有絲分裂指數(shù)為31.6‰。細(xì)胞世代時間為25.7小時。
將這樣獲得的細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析，包括用抗表面抗原CD10、CD13、CD31、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105、CD117的抗體(BectonDickinson)染色，同時使用間接熒光。利用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)進(jìn)行評價。表面標(biāo)記表達(dá)對應(yīng)于間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型。這些細(xì)胞是CD13、CD44、CD90、CD105陽性的和CD31、CD34、CD45、CD117陰性的。CD10的表達(dá)為中度陽性(表3)。
表3.來自胎盤羊膜的間充質(zhì)干細(xì)胞表面上表面抗原的表達(dá).
實施例4將質(zhì)量為10g的脂肪組織樣品用不含離子Ca2+和Mg2+的pH 7.2的PBS(Gibco)漂洗三次。該PBS(Gibco)含有一倍的抗生素和抗真菌劑溶液(Gibco)。青霉素的終濃度為100單位/ml，鏈霉素為100μg/ml，兩性霉素B為0.25μg/ml。除去致密的結(jié)締組織部分。
然后用醫(yī)療剪將組織在10cm培養(yǎng)皿(Costar)中進(jìn)行機(jī)械碎裂，直到產(chǎn)生細(xì)分散的塊。將其轉(zhuǎn)移到兩個具有錐形底的50ml試管(Costar)中。然后將每個樣品都懸浮于25ml含抗生素和抗真菌劑的DMEM培養(yǎng)基中。
之后進(jìn)行酶處理向這樣制備的懸液中加入1ml 2％Gibco型膠原酶在不含Ca2+和Mg2+的PBS緩沖液中的溶液，直到達(dá)到0.075％的酶終濃度。該懸液在緩慢振蕩下37℃溫育30分鐘。
將這樣制備的混合物充分混合；然后加入等體積的含有10％FBS、抗生素和抗真菌劑的DMEM。于1000g離心10分鐘。除去上清液和脂肪滴。將沉淀物合并，懸浮于10ml含155mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA的冷賴氨酸緩沖液(+4℃)中10分鐘。將該混合物充分?jǐn)嚢?，并且在室溫下溫?-5分鐘。
然后向細(xì)胞懸液中加入10ml含抗生素和抗真菌劑的DMEM培養(yǎng)基。于1000g離心10分鐘沉淀細(xì)胞。
吸出并漂洗上清液。將細(xì)胞沉淀物重懸浮于30ml含抗生素和抗真菌劑的DMEM培養(yǎng)基中，于1000g離心10分鐘。
將這樣獲得的沉淀物重懸浮于25ml含抗生素和抗真菌劑的DMEM培養(yǎng)基中。
然后利用包括100μm孔徑的濾器過濾這樣制備的細(xì)胞懸液，并且于300g離心10分鐘。將沉淀物重懸浮于體積為25ml的DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中添加了抗生素和抗真菌劑、10％FBS和一倍非必需氨基酸溶液(Gibco)。該懸液利用包括10μm孔徑的濾器過濾。
這樣，產(chǎn)生不含細(xì)胞碎片和血細(xì)胞的均質(zhì)細(xì)胞級分。
通過在Gorjajev室中計算評價這樣制備的細(xì)胞懸液，并且接種于75cm2培養(yǎng)瓶中(106細(xì)胞/cm2)。粘附細(xì)胞的比例為大約1％至1.5％；能夠從1g脂肪組織中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞的產(chǎn)量為大約1.5-3×104個細(xì)胞。
24小時后，將培養(yǎng)基更換為含抗生素(100單位/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(Gibco))、10％FBS和一倍非必需氨基酸溶液(Gibco)的DMEM。
一旦達(dá)到單層，即將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并且利用相差顯微鏡目視評價其形態(tài)學(xué)；計算有絲分裂指數(shù)和細(xì)胞世代時間。
在獲得細(xì)胞級分后，根據(jù)形態(tài)學(xué)分析確定了兩個亞群。第一個細(xì)胞型表現(xiàn)為梭形細(xì)胞的亞群，直徑為10-15μm，含有準(zhǔn)確調(diào)節(jié)的核和均質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)。第二個細(xì)胞型的特征在于是圓細(xì)胞，具有在一側(cè)延長的平的胞質(zhì)向外生長。細(xì)胞的大小為40μm；可觀察到移至邊上的暗核，和非均質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)。也可觀察到核區(qū)中的顆?；龆?。
在對數(shù)生長期計算有絲分裂指數(shù)和細(xì)胞世代時間。處于有絲分裂的細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)的比例為34％。倍增時間為約54至62小時。
利用間接熒光對這樣獲得的細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析。利用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)可以確定下列抗原為高表達(dá)狀態(tài)CD10(CALLA)、CD13(APN)、CD44(透明質(zhì)酸受體)、CD90(Thy-1)、CD105(endoglin)(Becton Dickinson)。此外，檢測到造血細(xì)胞的標(biāo)記CD34、CD45和CD117(Becton Dickinson)缺乏表達(dá)(表4)。免疫表型測定的結(jié)果證明獲得的細(xì)胞群體在其表面抗原表達(dá)上相當(dāng)于間充質(zhì)干細(xì)胞。
表4來自脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞表面上表面抗原的表達(dá)
權(quán)利要求
1.從人類組織中獲得和/或分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括下列步驟(a)提供人類組織，(b)通過酶和機(jī)械方法處理所述人類組織，獲得細(xì)胞懸液，(c)從所述懸液中除去紅細(xì)胞，和(d)過濾所述懸液，獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，步驟(a)中使用脂肪組織或/和胎盤組織作為人類組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(a)中使用蛻膜作為人類組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于在步驟(a)中使用羊膜作為人類組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(a)中使用絨毛膜基質(zhì)作為人類組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(d)中使用至少一個濾器，該濾器包括大小適合除去細(xì)胞殘余物和/或碎片的濾孔。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(d)中所述懸液先后使用包括約50μm至150μm，優(yōu)選100μm孔徑的濾器以及包括約5μm至15μm，優(yōu)選10μm孔徑的濾器過濾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(d)中所述懸液首先通過包括約50μm至150μm，優(yōu)選100μm孔徑的第一濾器過濾，然后通過包括約5μm至15μm，優(yōu)選10μm孔徑的第二濾器過濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(b)中使用膠原酶進(jìn)行所述酶處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其特征在于在使用蛻膜、羊膜和/或脂肪組織作為人類組織的情況下，在步驟(b)中使用I型膠原酶，在使用絨毛膜基質(zhì)作為人類組織的情況下則使用IV型膠原酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(b)中在Eagle培養(yǎng)基中，優(yōu)選在Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基中提供膠原酶用于所述酶處理。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(b)中提供終濃度約為0.075％的膠原酶用于所述酶處理。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其特征在于在步驟(c)中利用能夠裂解所述紅細(xì)胞的緩沖液進(jìn)行所述紅細(xì)胞的去除。
13.人類脂肪組織或/和胎盤組織作為用于獲得和/或分離間充質(zhì)干細(xì)胞的來源的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于使用人類蛻膜、羊膜和/或絨毛膜基質(zhì)作為獲得和/或分離間充質(zhì)干細(xì)胞的來源。
15.從人類組織中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括將所述組織進(jìn)行破碎并且用膠原酶在Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基中的溶液進(jìn)行酶處理，利用裂解溶液除去紅細(xì)胞，隨后過濾所制得的懸液，其特征在于使用脂肪組織或蛻膜或羊膜或絨毛膜胎盤基質(zhì)作為人類組織，而且先后利用包括100μm和10μm孔徑的濾器進(jìn)行過濾。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在脂肪組織、胎盤蛻膜或羊膜的酶處理中使用I型膠原酶，而在絨毛膜胎盤基質(zhì)的酶處理中使用IV型膠原酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。詳細(xì)地說，涉及從人類組織中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明可能用于多種疾病的治療。由于本發(fā)明，將有可能從人類組織中獲得具有高均質(zhì)性細(xì)胞懸液的間充質(zhì)干細(xì)胞，因為用于從人類組織中獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的方法包括將所述組織進(jìn)行破碎并且用膠原酶在Dulbecco改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基中的溶液進(jìn)行酶處理，利用裂解溶液除去紅細(xì)胞，隨后過濾所制得的懸液；使用脂肪組織或蛻膜或羊膜或絨毛膜胎盤基質(zhì)作為人類組織，并先后利用包括100μm和10μm孔徑的濾器進(jìn)行過濾。在脂肪組織、胎盤蛻膜或羊膜的酶處理中使用I型膠原酶，而在絨毛膜胎盤基質(zhì)的酶處理中使用IV型膠原酶。
文檔編號C12N5/00GK1961069SQ200580012239
公開日2007年5月9日 申請日期2005年4月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月9日
發(fā)明者亞歷山大·S·臺普利亞申 申請人:亞歷山大·S·臺普利亞申