專利名稱：：檢測(cè)高危型人乳頭瘤病毒的方法及試劑盒的制作方法檢測(cè)高危型人乳頭癍病毒的方法及試劑盒所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床樣品中人乳頭瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)臨床樣品中高危型人乳頭瘤病毒，以為診斷宮頸癌、尖銳濕疣提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)的臨床檢測(cè)方法及完成該方法所使用的試劑盒。發(fā)明背景宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近年，隨著生活方式的改變，宮頸癌患者的發(fā)病年齡更趨年輕化，并且病例數(shù)有不斷上升的趨勢(shì)。宮頸癌是目前唯一一種發(fā)病原因比較清楚的的腫瘤，主要病因是由高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的持續(xù)或反復(fù)感染所致[Walb(還ers肌JacobsMV,ManosMM,eta丄H麗npapillomavirusisanecessarycauseofinvasivecervicalcancerworldwide.JPathol,1999:189(1):50-53]。目前確定的HPV型別約有80個(gè)，依其感染的上皮所在部位分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，其中約35個(gè)型別涉及生殖道感染。依據(jù)不同型別HPV與宮頸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的高低，又分為低危險(xiǎn)型HPV和高危型HPV，約20個(gè)型別與腫瘤相關(guān)。在世界范圍內(nèi)，宮頸癌主要危害那些未進(jìn)行高危型人乳頭瘤病毒篩查的婦女。研究表明，HPV16、18型與宮頸癌高度相關(guān)，31、33和35型中度相關(guān)。HPV型別分布有地域差別，在中國(guó)人群中，HPV16、52、58型相對(duì)多見。HPV的陰性預(yù)測(cè)價(jià)值達(dá)100%，即無(wú)HPV感染時(shí)可基本排除宮頸癌的發(fā)生。宮頸癌早期手術(shù)治療效果極佳，以預(yù)防為主的策略作為降低宮頸癌死亡率的主要途徑是簡(jiǎn)單而有效的[NobbenhuisMAE，WalboomersJ固，HelmerhorstTJM，etal.Relationofhumanpapi1lomavirusstatus1.0cervicallesionsandconsequencesforcervical-cancerscreening:aprospectivestudy.Lancet，1999:354:20-25]。如果能早期檢查出并成功地治療(特別是癌前千預(yù)性治療)發(fā)生在宮頸組織的癌前病變(可以潛伏多年)，就可有效地阻斷癌前病變向?qū)m頸癌的發(fā)展。人乳頭瘤病毒感染病例的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查。實(shí)驗(yàn)室檢查包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)(測(cè)序、原位雜交、雜交捕獲、PCR等)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法靈敏度與特異性均較低，受操作者的主觀影響比較大；測(cè)序、原位雜交技術(shù)復(fù)雜，對(duì)操作者的要求較高，在臨床應(yīng)用中受到限制；雜交捕獲方法已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)并已應(yīng)用于臨床，但該方法成本高、操作復(fù)雜、存在假陽(yáng)性，因此也限制了其在宮頸癌普查中的大規(guī)模應(yīng)用；定性PCR方法雖然靈敏度高并能對(duì)病毒進(jìn)行早期檢測(cè)，但是因其步驟繁瑣且容易造成污染，從而也限制了它的臨床使用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來(lái)的。與傳統(tǒng)的(終點(diǎn)檢測(cè))PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法不僅實(shí)現(xiàn)了低拷貝數(shù)靶多核苷酸的定量分析，而且還具有特異性和精確度更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系中加入熒光標(biāo)記探針，使用一種帶有電荷偶聯(lián)裝置(CCD)的PCR擴(kuò)增儀，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，并通過(guò)軟件分析匯總到工作站得到擴(kuò)增曲線。通過(guò)對(duì)擴(kuò)增曲線以及循環(huán)閾值(Ct)的分析，能夠?qū)Ρ粰z樣品進(jìn)行定性和定量分析。TaqManPCR技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光PCR的一種(MackayIMa/.Real-timePCRinvirology..NucleicAcidsRes.20025;30(6):1292-1305;Lie,Y.S.,Petropoulos,C丄，AdvancesinquantitativePCRtechnology:5'nucleaseassays.CurrentOpinioninBiotechnology1998.9,4348.)。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。如果擴(kuò)增過(guò)程中有耙序列的存在，擴(kuò)增的過(guò)程中探針?lè)肿又饾u被水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號(hào)。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。在使用已知的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)和定量分析臨床樣品中某特定耙核酸的實(shí)踐中，為了減少和避免檢測(cè)結(jié)果的假陰性或假陽(yáng)性，提高定量分析的準(zhǔn)確性，一個(gè)關(guān)鍵性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計(jì)并制備適當(dāng)?shù)囊锖凸押塑账崽结?。本發(fā)明人在以往多年從事PCR技術(shù)特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，將該技術(shù)應(yīng)用于人乳頭瘤病毒的所有已知變異體之基因組多核苷酸的檢測(cè)和定量分析，成功地完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)樣品中HR-HPV病毒的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴(kuò)增體系和熒光監(jiān)測(cè)體系在內(nèi)的反應(yīng)與檢測(cè)混合物，(2)通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說(shuō)的耙多聚核苷酸，(3)使所說(shuō)的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多聚核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，并結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定靶多聚核苷酸的存在及其相對(duì)量(即靶核酸序列的拷貝數(shù))；其中核酸擴(kuò)增系統(tǒng)包括可與靶聚多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)包括一個(gè)可與靶多聚核苷酸特異性結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatcc-3，(SEQIDNO:1)、5，-gacaaaaacggaaatccagt-3，(SEQIDN0:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3，(SEQIDN0:3)和5，-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4),并且所使用的寡核苷酸探針是5，-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3,(SEQIDNO-5)禾口5，-accacgtecttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的樣品是可疑高危型HPV感染者的臨床樣品。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的高危型HPV選自中國(guó)人群中常見的、與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)系的各型HPV。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的高危型HPV選自HPV16、18、31、33、35、39、45、52、58、59、67型。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的靶多聚核苷酸來(lái)自高危型HPV。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)是聚合酶鏈反應(yīng)，并且所說(shuō)的擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)是大約重復(fù)40次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的核酸擴(kuò)增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b)2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，和(d)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說(shuō)的熒光實(shí)時(shí)檢測(cè)體系包括能夠與耙多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說(shuō)的方法進(jìn)一步包括(1)確定樣品中的靶多聚核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將己確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量耙多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以計(jì)算出樣品中耙多聚核苷酸的量。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)臨床樣品中HPV的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、稀釋液、陰性對(duì)照樣品、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中濃縮液由PEG8000組成；DNA提取液由異硫氰酸胍、氫氧化鈉、SDS組成的溶液。PCR反應(yīng)管內(nèi)為PCR體系，由引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTPs、H20和緩沖液組成；稀釋液為TE溶液。本發(fā)明的試劑盒中使用帶有目的基因片段的重組質(zhì)粒作為強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為lXl()S拷貝/ml，使用帶有目的基因片段的重組質(zhì)粒作為臨界陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為lXl()S拷貝/ml，并使用生理鹽水作為陰性對(duì)照。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于耙多聚核苷酸擴(kuò)增體系的正向和反向引物分別是5，一Ugatgaaaatggcaatcc一3'(SEQIDNO:1)、5'一gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)和5，-catcgtUtccttgtcctc-3，(SEQIDNO:4)。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多聚核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)體系的寡核苷酸探針是5'_accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)禾口5，-accacgtccttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法及試劑盒，特別是涉及實(shí)時(shí)定性定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法及其試劑盒在中國(guó)人群中常見的高危型HPV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定性定量檢測(cè)臨床樣品中高危型HPV存在的方法，該方法包括(1)提供包括HPV基因組核酸的樣品、核酸擴(kuò)增體系，和熒光監(jiān)測(cè)體系的反應(yīng)與檢測(cè)混合物，(2)通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說(shuō)的靶多聚核苷酸，(3)使所說(shuō)的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的耙多聚核苷酸間接結(jié)合，(4)4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，并結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定耙多聚核苷酸的存在及其相對(duì)量；其中核酸擴(kuò)增體系包括可與靶多聚核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光檢測(cè)體系包括可與靶多聚核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所說(shuō)的擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的正向和反問(wèn)寡核苷酸引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatec-3'(SEQIDNO:1)、5'-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5'-categgtgtctgcatcl,tc-3'(SEQIDNO:3)禾口5'-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4)，并且所使用的寡核苷酸探針是5'-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)和5，-accacgtccttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。與基于擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行單一終點(diǎn)檢測(cè)的傳統(tǒng)PCR方法不同，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)方法可以在擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程中隨時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而大大提高了定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精密度。眾所周知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增中同時(shí)加入引物和5'、3'末端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(例如6-FAMamidite羧基熒光素6)和熒光淬滅基團(tuán)(例如6-羧基四甲基若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒(méi)有與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，其序列保持完整，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)將被淬滅基團(tuán)吸收，所以沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生；而當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將降解熒光探針，導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，因而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收并記錄到熒光信號(hào)。每擴(kuò)增一條DNA鏈即有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知靶多聚核苷酸(模板)進(jìn)行定量分析。與通常的實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)相似，本發(fā)明的檢測(cè)樣品中HPV病毒基因組雙鏈靶多聚核苷酸存在的方法中同樣包括U)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(c)2-脫氧核苷三磷酸(dNTP)的擴(kuò)增反應(yīng)體系，以及包括(a)能夠與待檢雙鏈靶多聚核苷酸的第一條互補(bǔ)鏈結(jié)合的正向引物，(b)能夠與待檢雙鏈靶多聚核苷酸的第二條互補(bǔ)鏈結(jié)合的反向引物，以及(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的任一條鏈結(jié)合并且兩末端分別標(biāo)記有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針的熒光檢測(cè)體系；(2)通過(guò)一次或多次聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所說(shuō)的靶多聚核苷酸；(3)退火后使所說(shuō)的熒光發(fā)生基團(tuán)通過(guò)探針與靶多聚核苷酸的結(jié)合并在Taq酶的外切活性作用下釋放熒光發(fā)生基團(tuán)而產(chǎn)生熒光信號(hào)；(4)檢測(cè)并確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量；(5)分析一次或多次擴(kuò)增循環(huán)所發(fā)出的熒光量，以檢測(cè)靶多聚聚核苷酸的存在；特征在于其中所說(shuō)的靶多聚核苷酸是HPV基因組多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別5，-Ugatgaaaatggcaatec-3，(SEQIDNO:1)、5'-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5'-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)禾口5，-catcgttttccttgtcctc-3，(SEQIDNO:4)，并且所使用的寡核苷酸探針是5'-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'(SEQIDNO:5)和5'-accacgtecttgagaaaaaggatt-3'(SEQIDNO:6)。如前所述，為了檢測(cè)出臨床樣品中可能存在的高危型HPV病毒，并能夠準(zhǔn)確有效地將高危型HPV病毒感染與低危型HPV病毒、單純皰疹病毒2型、生殖支原體、巨細(xì)胞病毒、解脲脲原體、沙眼衣原體、淋病雙球菌及其他常見泌尿生殖道感染病原體鑒別開來(lái)，設(shè)計(jì)并制備實(shí)現(xiàn)這些目的的寡核苷酸引物和探針是一個(gè)非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。為此，我們?cè)谑褂眠m當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖?duì)已知HPV病毒型的基因組核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，并在找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件(例如PrimerPremier5.5)選擇并設(shè)計(jì)具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物1:5，-ttgatgaaaatggee.atec-3,(SEQIDNO:1)，引物2:5，-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDN0:2)，弓l物3:5'-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)禾U弓I物4:5'-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4);以及具有下示序列的寡核苷酸探針5'-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)和5'-accacgtecUgagaaaaaggatt-3'(SEQIDNO:6)。引物所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)段相當(dāng)于HPV病毒E1基因編碼序列的保守區(qū)，長(zhǎng)度為107bp-120bp。所設(shè)計(jì)的這些引物和探針均具有互補(bǔ)于高危型HPV病毒基因組保守區(qū)的序列，而且與其他泌尿生殖道感染相關(guān)病原體的核苷酸序列沒(méi)有同源性，也不包括任何常見的核酸內(nèi)切酶，所以大大減少甚至避免了HPV病毒檢測(cè)的假陰性和假陽(yáng)性，提高了檢測(cè)的可靠性和準(zhǔn)確度?？墒褂肈NA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化并進(jìn)行氨解處理。同樣合成所需的檢測(cè)探針，氨解處理后分別在其5，端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán)(報(bào)道基團(tuán))的6-FAMamidite，并在其3'端標(biāo)記帶有活性連接臂的、作為熒光淬滅或抑制基團(tuán)的TAMRA。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，可使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。使用常規(guī)DNA提取方法或市售的DNA提取試劑盒，從得自受試者的宮頸脫落細(xì)胞樣品中提取DNA用于后繼的PCR擴(kuò)增。在含有引物l、2、3和4(各10pmo1)、探針5和6(各3pmo1)、DNA模板(PCR擴(kuò)增靶序列)、dNTPs(IOmM)、耐熱DNA聚合酶(PlantiniumDNA聚合酶)、PCR緩沖液和水的反應(yīng)體系中，使用ABI7000型或其他結(jié)構(gòu)類型的自動(dòng)熒光檢測(cè)熱循環(huán)儀對(duì)如上得到的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所使用的反應(yīng)條件是93'C預(yù)變性3分鐘后，93°C30秒，55°C45秒，共進(jìn)行40次循環(huán)。反應(yīng)完成后，借助裝置上配有的自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果分析。在本研究中，如果循環(huán)閾(Ct)值等于或大于25,結(jié)果即為陰性；如果Ct值小于25，結(jié)果則為陽(yáng)性。其中以反應(yīng)的前10個(gè)循環(huán)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置為卜10個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般說(shuō)來(lái)，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因?yàn)樵跀U(kuò)增反應(yīng)的Ct值之前的階段，擴(kuò)增系統(tǒng)中的酶、引物、探針和dNTPs均大大過(guò)量，而且系統(tǒng)的pH值和離子濃度等也相對(duì)穩(wěn)定，所以此時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)的效率是一個(gè)與模板數(shù)無(wú)關(guān)的飽和定值。與Ct值相關(guān)的只有起始模板數(shù)(多聚核苷酸樣品的拷貝數(shù))和與樣品無(wú)關(guān)的PCR系統(tǒng)效率?？衫靡阎鹗伎截悢?shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以耙多聚核苷酸起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，并以如上測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)。獲得未知量靶多聚核苷酸的Ct值后，即可從基于平行實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知其起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，然后計(jì)算出該靶多聚核苷酸的起始拷貝數(shù)(當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)達(dá)到Ct值即初始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一靶多聚核苷酸在不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間在不同管內(nèi)擴(kuò)增所得到的Ct值總是恒定的)。也就是說(shuō)，為了基于上述的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果推算出靶多聚核苷酸的量(起始拷貝數(shù))，本發(fā)明的方法還應(yīng)進(jìn)一步包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，從而計(jì)算出樣品中靶多聚核苷酸的量。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測(cè)臨床樣品中高危型HPV病毒的試劑盒，該試劑盒包括(l)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、含有本領(lǐng)域已知的常規(guī)成分的PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、稀釋液、陰性對(duì)照樣品、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和DNA陽(yáng)性對(duì)照品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中濃縮液用于濃縮液態(tài)待檢樣品。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中稀釋液用于稀釋陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增體系的正向和逆向引物引物分別5'—Ugatgaaaatggcaatcc-3'(SEQIDNO:1)、5'—gficaaaaacggaaatccagt-3，(SEQIDNO:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)和5'—catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4)。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多聚核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)體系的寡核苷酸是5，-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'(SEQIDNO:5)禾口5，-accacgtecttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)?？砂凑杖缟纤龅牟襟E或試劑盒中所附使用說(shuō)明書中指出的方法使用本發(fā)明的試劑盒。如前所述，為了檢測(cè)出臨床樣品中可能存在的高危型HPV病毒，并準(zhǔn)確有效地將高危型HPV病毒感染與低危型HPV病毒、單純皰疹病毒2型、生殖支原體、巨細(xì)胞病毒、解脲脲原體、沙眼衣原體、淋病雙球菌及其他常見泌尿生殖道感染病原體鑒別開來(lái)，本發(fā)明基于對(duì)不同型別HPV和相關(guān)病毒基因組核苷酸序列的同源性比較，特別設(shè)計(jì)了適用本發(fā)明試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，大大減小了高危型HPV病毒多核苷酸檢測(cè)的假陽(yáng)性和假陰性。我們的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明檢測(cè)高危型HPV病毒基因組核苷酸的精確度幾乎為100c/。，靈敏度達(dá)到102個(gè)拷貝。值得特別說(shuō)明的是，為了確保本發(fā)明的高危型HPV病毒檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，我們還使用攜帶有HPV病毒核苷酸序列的重組質(zhì)粒作為DNA定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品。借助這些標(biāo)準(zhǔn)品并使用本發(fā)明的試劑盒，在相同條件下進(jìn)行平行檢測(cè)并制作所謂的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)精確度和準(zhǔn)確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒的附加的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。圖l顯示(Stdcurve)窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。針對(duì)模板數(shù)為102107拷貝的反應(yīng)體系進(jìn)行T叫ManPCR分析。當(dāng)拷貝數(shù)為100時(shí)，被檢樣品的Ct值在25左右，即檢測(cè)下限靈敏度可到達(dá)100拷貝。圖2顯示強(qiáng)中弱三份陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)曲線。三份標(biāo)本的Ct值分別是25.95、21.45和13.47;結(jié)合擴(kuò)增曲線呈S形，即可判定三份樣品均為陽(yáng)性。圖3顯示陰性標(biāo)本的檢測(cè)曲線。三個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增曲線為較平直的折線，與熒光檢測(cè)閾值線沒(méi)有交點(diǎn)，或者顯示Ct值在2530之間的范圍內(nèi)，并且擴(kuò)增曲線不具有S形特征。圖4顯示HPV16、18、31、33、52、58型等標(biāo)本的檢測(cè)曲線，標(biāo)本均經(jīng)反向斑點(diǎn)雜交和測(cè)序確認(rèn)為相應(yīng)型別。擴(kuò)增曲線呈S形，可判定被檢樣品均為陽(yáng)性。圖5顯示陽(yáng)性標(biāo)本重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)曲線，可看出不同的曲線均在同一CT值范圍內(nèi)，此結(jié)果表明試劑盒具有良好的重復(fù)性。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:高危型人乳頭瘤病毒檢測(cè)試劑盒及其使用(1)制備包括下列組成成分的試劑盒DNA提取液(500pl/管)l管、PCR反應(yīng)管(未貼標(biāo)簽管)IO管、H20(2000pl/管)l管、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(50pl/管)l管、臨界陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品(50ulZ管)l管、陰性對(duì)照(50pl/管)l管。(2)標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存以無(wú)菌棉拭子或?qū)m頸刷取疑似人乳頭瘤病毒感染患者的宮頸脫落細(xì)胞，以及用于活檢的組織標(biāo)本或疣組織，置于低溫冰箱(一70'C或一20°C)內(nèi)冷凍保存。如集中檢驗(yàn)，標(biāo)本需在(TC以下環(huán)境中運(yùn)送并于24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。(3)檢測(cè)步驟和結(jié)果分析-宮頸刷、宮頸拭子加入lml無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子。吸取全部液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，12，000離心5分鐘。去上清，沉淀直接加入50n1DNA提取液充分混勻(由于提取液內(nèi)含有不溶于水的物質(zhì)，故取樣時(shí)需先用加樣器充分混勻；如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無(wú)污染的剪刀將吸頭嘴部剪掉一截)。10(TC加熱處理10分鐘(誤差不超過(guò)1分鐘)后，12,000rpm離心5分鐘，取上清液2y1用于PCR反應(yīng)。組織活檢、切片標(biāo)本用適量滅菌生理鹽水洗去送檢組織沾帶的血液，取約50mg組織，加1ml滅菌生理鹽水用勻漿器研磨成組織勻漿并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中.12，000rpm離心5分鐘后，去上清，向沉淀物中加入50ulDNA提取液充分混勻，IO(TC恒溫處理10分鐘(誤差不超過(guò)1分鐘)。12,OOOrpm離心5分鐘后，收集上清液2ii1用于PCR反應(yīng)。將強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品6000rpm離心15秒，加入稀釋液450ul，充分混勻后標(biāo)示為105。然后另取3支新的0.5ml離心管，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行10倍梯度稀釋(分別標(biāo)示為104、103、]02)，-2(TC保存?zhèn)溆?。然后分別取待檢樣品(每份2ul)、同體積的定量標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照品，加樣于PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件是93。C預(yù)變性3分鐘，93°C45秒，55'C60秒，進(jìn)行10次循環(huán)，此!O個(gè)循環(huán)內(nèi)不檢測(cè)熒光信號(hào)；93°C30秒，55。C45秒，進(jìn)行30次循環(huán)，在反應(yīng)的延伸階段檢測(cè)熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。調(diào)節(jié)分析參數(shù)，使標(biāo)準(zhǔn)曲線(Stdcurve)窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達(dá)到最佳(即相關(guān)性數(shù)值<-0.95)(參見圖l)。由圖2和圖3可分別看出，陽(yáng)性標(biāo)本的熒光曲線與設(shè)定的閾值線有一交點(diǎn)，而陰性標(biāo)本的熒光曲線則低于閾值。最后由儀器自動(dòng)分析裝置計(jì)算出未知標(biāo)本的測(cè)定數(shù)值(Qty)，即標(biāo)本中HPV病毒的DNA含量(參見圖2和3)。實(shí)施例2:對(duì)確定HPV型別的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)具體步驟同實(shí)施例l，不同的是所用標(biāo)本均經(jīng)反向斑點(diǎn)雜交和測(cè)序確認(rèn)為HPV16、18、31、33、52、5趣，HPV16、18、31、33、52、58型是中國(guó)人群感染最多的型別。標(biāo)本提取核酸后用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的同時(shí)由儀器自動(dòng)監(jiān)測(cè)并收集熒光信號(hào)的變化。反應(yīng)結(jié)束后分析，應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒均能檢測(cè)出已知型別的標(biāo)本(參見圖4)。實(shí)施例3:臨床標(biāo)本檢測(cè)的重復(fù)性測(cè)試具體步驟同實(shí)施例l，不同的是所用標(biāo)本為確定陽(yáng)性的標(biāo)本。提取核酸后用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每一份標(biāo)本設(shè)置多個(gè)復(fù)管。在擴(kuò)增的同時(shí)由儀器自動(dòng)監(jiān)測(cè)并收集熒光信號(hào)的變化。反應(yīng)結(jié)束后分析，應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示同一標(biāo)本不同的曲線均在同一CT值范圍內(nèi)，此結(jié)果表明試劑盒具有良好的重復(fù)性。(參見圖5)。實(shí)施例4:20份臨床標(biāo)本檢測(cè)并與其他藥盒的比較20例臨床標(biāo)本取自廣東省人民醫(yī)院，具體步驟同實(shí)施例l，不同的是所用標(biāo)本同時(shí)用西班牙BIOTOOLS國(guó)Labs,S.A.公司BIOPAPQTS試劑盒檢測(cè)，該試劑盒已經(jīng)通過(guò)歐盟CE認(rèn)證，能夠檢測(cè)常見的高危型人乳頭瘤病毒。BIOPAPQTS試劑盒使用熒光染料的方法對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。通過(guò)比較本發(fā)明中所說(shuō)的試劑盒與BIOPAPQTS試劑盒在臨床標(biāo)本檢測(cè)所得的結(jié)果，來(lái)鑒定本發(fā)明所說(shuō)試劑盒在臨床檢測(cè)中的有效性。表1:本發(fā)明中的試劑盒與BI0PAPQTS試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>上表中'一'表示試劑盒檢測(cè)均為陰性，CT值表示標(biāo)本中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)。如上表，兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，顯示了良好的一致性，說(shuō)明了本發(fā)明試劑盒的高可信性。由于本發(fā)明使用熒光探針，較染料法有更高的特異性；本發(fā)明的試劑盒較目前市場(chǎng)上使用的美國(guó)Digene公司雜交捕獲(hybridcapureII，HCII)方法在對(duì)儀器和操作人員的要求方面更易應(yīng)用，檢測(cè)的靈敏度也高于雜交捕獲方法。序列表<U0>中山大學(xué)安達(dá)基因股份有限公司<120>檢測(cè)高危型乳頭瘤病毒的方法及試劑盒<140><141><160>6<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>1ttgatgaaaatggcaatcc<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>2geicaaaaacggsaatccagt<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>3catcggtgtctgcatcttc<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。<400>4catcgttttccttgtcctc<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增過(guò)程中檢測(cè)熒光信號(hào)增長(zhǎng)的探針。<400>5accatgtcctttcaaaaaaacatttc<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增過(guò)程中檢測(cè)熒光信號(hào)增長(zhǎng)的探針。<400>6accacgtccttgagaaaaaggatt權(quán)利要求1一種使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測(cè)樣品中常見高危型HPV病毒存在的方法，該方法包括(1)提供包括HPV病毒基因組核酸的樣品、核酸擴(kuò)增體系，和熒光監(jiān)測(cè)體系的反應(yīng)與檢測(cè)混合物，(2)通過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說(shuō)的靶多聚核苷酸，(3)使所說(shuō)的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多聚核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，并結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定靶多聚核苷酸的存在及其相對(duì)量；其中核酸擴(kuò)增體系包括可與靶多聚核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光檢測(cè)體系包括可與靶多聚核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所說(shuō)的擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5’-ttgatgaaaatggcaatcc-3’(SEQIDNO1)、5’-gacaaaaacggaaatccagt-3’(SEQIDNO2)、5’-catcggtgtctgcatcttc-3’(SEQIDNO3)和5’-catcgttttccttgtcctc-3’(SEQIDNO4)，并且所使用的寡核苷酸探針是5’-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3’(SEQIDNO5)和5’-accacgtccttgagaaaaaggatt-3’(SEQIDNO6)。2、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的核酸擴(kuò)增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b)2，-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，和(d)能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物。3、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的熒光檢測(cè)體系包括能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。4、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所說(shuō)的方法進(jìn)一步包括(1)確定樣品中的靶多聚核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量耙多聚核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以計(jì)算出樣品中靶多聚核苷酸的量。5、根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說(shuō)的高危型HPV病毒是中國(guó)人群中常見的宮頸癌相關(guān)人乳頭瘤病毒。6、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說(shuō)的高危型人乳頭瘤病毒選自16、18、31、33、35、39、45、52、58、59和67型人乳頭瘤病毒。7、根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說(shuō)的靶多聚核苷酸來(lái)自中國(guó)人群中常見的高危型人乳頭瘤病毒。8、使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測(cè)臨床樣品中高危型人乳頭瘤病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、DNA提取液、純水、擴(kuò)增反應(yīng)液、稀釋液、陰性對(duì)照樣品、強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，特征在于其中用于靶多聚核苷酸擴(kuò)增體系的正向和反向引物分別是5'-ttgatgaaaatggcaatcc-3，,5，_gacaaaaacggaaatccagt-3，，5'-catcggtgtctgcatcttc-3'，5'-catcgtUtccttgtcctc-3;其中用于耙多聚核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測(cè)體系的寡核苷酸是5'-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'禾口5'-accacgtecttgagaaaaagga1t_3'。全文摘要本發(fā)明涉及檢測(cè)臨床樣品中宮頸癌、尖銳濕疣的病原體—高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)診斷HR-HPV感染的方法及所使用的試劑盒。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101130824SQ200610037188公開日2008年2月27日申請(qǐng)日期2006年8月25日優(yōu)先權(quán)日2006年8月25日發(fā)明者何蘊(yùn)韶,王偉毅,王方金,鋼程申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司