專利名稱：抗腫瘤化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌代謝產(chǎn)生的化合物，尤其是一種利用新分離獲得的擬莖點(diǎn)霉(Phomosis sp.)A-1-2-3代謝產(chǎn)生的化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯(Deacetyl-mycoepoxydiene化學(xué)名2-(8-甲基-9-氧雜-雙環(huán)[4.2.1]九-2，4-二烯-7-基)-6-氧-3，6-二氫-2H-吡喃酮)。
背景技術(shù)：
擬莖點(diǎn)霉(Phomosis sp.)A-1-2-3分離于福建省漳州市九龍江口浮宮鎮(zhèn)草埔頭村紅樹林生態(tài)區(qū)紅樹植物秋茄葉子，該屬真菌為植物寄生菌(見裘緯蕃主編，菌物學(xué)大全[M]，北京科學(xué)出版社，1998)，該菌株在20％海水配方馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)培養(yǎng)基上，生長良好，菌絲純白，無明顯色素產(chǎn)生，不產(chǎn)孢子，培養(yǎng)10d以后，產(chǎn)生黑色子座。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)新穎，利用新分離獲得的擬莖點(diǎn)霉A-1-2-3代謝產(chǎn)生的化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯及其制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于將化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯作為抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導(dǎo)物。
本發(fā)明所采用的真菌為本申請(qǐng)發(fā)明人從福建省漳州市九龍江口浮宮鎮(zhèn)草埔頭(地名)紅樹林生態(tài)區(qū)的紅樹植物秋茄葉子中分離得到的菌株A-1-2-3，經(jīng)鑒定為擬莖點(diǎn)霉(Phomosissp.)。該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊(cè)的保藏編號(hào)為CCTCC NOM206060，保藏的培養(yǎng)物名稱及注明的鑒別特征為擬莖點(diǎn)霉(Phomosis sp.)，保藏日為2006年6月26日。
本發(fā)明所述的真菌代謝產(chǎn)生的化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯，其分子式為C14H16O4，結(jié)構(gòu)式為
本發(fā)明所述的化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯的制備方法，其步驟為1)固體培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物處理取斜面上菌種接種于20％海水配方馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)中培養(yǎng)至發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物分裝后加入1～2倍體積的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶劑，按體積比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取至少3遍，收集提取液，在45～55℃減壓濃縮至膏狀；膏狀物用水分散，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至無色，分別收集萃取液的有機(jī)相，在45～55℃減壓濃縮至膏狀，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。
2)化合物分離選取步驟1)中制得的乙酸乙酯相浸膏為上樣樣品，進(jìn)行硅膠柱分離，取質(zhì)量為上樣量8～10倍的硅膠，用濕法裝柱至硅膠的沉降不再變動(dòng)，濃縮后的上樣樣品用硅膠拌樣，干法上樣，洗脫，洗脫溶劑系統(tǒng)按極性從小到大的順序的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，收集每個(gè)梯度的洗脫液，濃縮至干，收集各個(gè)組分。
3)合并步驟2)中收集的第25、26、27個(gè)組分，進(jìn)行反相硅膠柱分離，取質(zhì)量為上樣量40～800倍的反相硅膠，用濕法裝柱至硅膠的沉降不再變動(dòng)，用甲醇、丙酮等極性溶劑，洗滌柱子至液體沒有顏色，再用水平衡柱子，使柱內(nèi)充滿水，濕法上樣，洗脫，采用70％(v/v)甲醇—水固定梯度洗脫10～15個(gè)柱體積，收集每個(gè)柱體積的洗脫液，濃縮至干，共收集10～15個(gè)組分。
4)取步驟3)中收集的第2個(gè)組分，進(jìn)行凝膠柱層析分離，取質(zhì)量為上樣量70～700倍的LH-20凝膠，用濕法裝柱至硅膠的沉降不再變動(dòng)，濕法上樣，甲醇洗脫，自動(dòng)收集器按1～1.2小時(shí)1管的速率，收集各組分，共收集90～120管。
5)將步驟4)中有羽狀晶體析出的收集管用石油醚反復(fù)洗滌，直至晶體表面無色素附著，結(jié)晶制得的真菌代謝產(chǎn)物即為去乙酰真菌環(huán)氧乙酯；母液靜置至有棒狀晶體析出，反復(fù)洗滌，直至晶體表面無色素附著，得到透明棒狀晶體的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯。
在步驟1)中，取斜面上菌種接種于20％海水配方馬鈴薯固體培養(yǎng)基(PDA)中培養(yǎng)至發(fā)酵的溫度為25～28℃，優(yōu)選28℃。
在步驟2)中，取質(zhì)量為上樣量8～10倍的硅膠選用200～300目的硅膠，濃縮后的上樣樣品所用硅膠選用60～100目的硅膠。所述的洗脫溶劑系統(tǒng)按極性從小到大的順序，由石油醚與乙酸乙酯不同體積比混合溶劑至純乙酸乙酯為洗脫溶劑，總共7級(jí)洗脫梯度進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫梯度溶劑為1個(gè)柱床體積(300mL)的整數(shù)倍。所述的洗脫梯度分別為石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(3個(gè)柱床體積)、石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1(3個(gè)柱床體積)、石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1(6個(gè)柱床體積)、石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1(5個(gè)柱床體積)、石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1(6個(gè)柱床體積)、石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1(4個(gè)柱床體積)、乙酸乙酯(2個(gè)柱床體積)。所述的濕法裝柱所采用的柱的柱高可為10cm，直徑Φ為6cm。
在步驟3)中，所述的反相硅膠為Silicagel 60RP-18。每個(gè)收集組分為1個(gè)柱床體積(100mL)。所述的濕法裝柱所采用的柱的柱高可為23cm，直徑Φ為2.6cm。
在步驟4)中，所述的凝膠為SephadexLH-20。所述的濕法裝柱所采用的柱的柱高可為150cm，直徑Φ為2cm。
對(duì)化合物的分析進(jìn)行晶體X-Ray(X衍射)，NMR(核磁共振)，生物活性等測(cè)試。
根據(jù)X-Ray衍射數(shù)據(jù)和NMR數(shù)據(jù)，對(duì)化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，可確定化合物結(jié)構(gòu)。根據(jù)對(duì)化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯的生物活性測(cè)定，利用細(xì)胞毒MTT(噻唑藍(lán))法(參見文獻(xiàn)Mosmann F.Rapid colorinetric assay for cellular growth and survivalapplication to proliferation and cytotoxicity assay[J].J.Immunol Methods，1983，6555-63)測(cè)定化合物的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人B淋巴瘤Raji細(xì)胞IC50＝3μg/mL。由此證明，化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯具有抗腫瘤活性，可應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物或其他生物活性先導(dǎo)物。
本發(fā)明所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯結(jié)構(gòu)新穎，具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性?？梢岳帽景l(fā)明所述菌株P(guān)homosis sp.A-1-2-3發(fā)酵制得，馬鈴薯、葡萄糖、海水和瓊脂等原料來源廣泛，價(jià)格便宜，制備方法簡(jiǎn)單，易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明所述的化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯的立體構(gòu)型圖。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1取斜面上菌種接種于20％海水PDA中培養(yǎng)至發(fā)酵，溫度為28℃，將發(fā)酵產(chǎn)物分裝于3L三角瓶中(1L/瓶)，加入2倍體積的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶劑，按體積比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取3遍，收集提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓濃縮至膏狀；膏狀物用水分散，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至無色，分別收集萃取液的有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓濃縮至干，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。取質(zhì)量為上樣量10倍的硅膠(200～300目)，用濕法裝柱，柱內(nèi)徑選為6cm，柱長為10cm，用泵加壓至硅膠的沉降不再變動(dòng)；濃縮后的乙酸乙酯相浸膏樣品經(jīng)60～100目硅膠拌樣后壓實(shí)平鋪于柱面。采用正相柱層析法進(jìn)行洗脫。洗脫溶劑系統(tǒng)按極性從小到大的順序，由石油醚與乙酸乙酯不同體積比混合溶劑至純乙酸乙酯為洗脫溶劑，總共7級(jí)洗脫梯度進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫梯度溶劑為1個(gè)柱床體積(300mL)的整數(shù)倍，洗脫液每300mL收集1管。減壓濃縮洗脫液至干，總共得到29個(gè)回收組分。乙酸乙酯溶解后(若不溶，可加入適量甲醇至完全溶解)置于小管中常溫自然揮發(fā)。
合并上一個(gè)步驟中的第25、26、27個(gè)組分，進(jìn)行反相硅膠柱分離。取質(zhì)量為上樣量60倍的反相硅膠，用濕法裝柱，柱內(nèi)徑選為2.6cm，柱長為23cm，用泵加壓至硅膠的沉降不再變動(dòng)，分別用甲醇、丙酮洗滌柱子至液體沒有顏色，再用水平衡柱子，使柱內(nèi)充滿水。濕法上樣，洗脫，采用70％(v/v)甲醇—水固定梯度洗脫，濃縮至干，共收集10個(gè)組分。甲醇溶解后置于小管中常溫自然揮發(fā)。
取上一個(gè)步驟中的第2個(gè)組分，進(jìn)行凝膠柱層析分離。取質(zhì)量為上樣量300倍的LH-20凝膠，用濕法裝柱，柱內(nèi)徑選為2cm，柱長為150cm，至硅膠的沉降不再變動(dòng)，濕法上樣，甲醇洗脫，自動(dòng)收集器按1～1.2小時(shí)1管的速率，收集各組分，共收集90管。該步驟中回收組分的第74～78管中出現(xiàn)羽狀晶體，反復(fù)洗滌直至晶體表面無色素附著，結(jié)晶制得的真菌代謝產(chǎn)物即為去乙酰真菌環(huán)氧乙酯。母液靜置至有棒狀晶體析出，反復(fù)洗滌直至晶體表面無色素附著，得到去乙酰真菌環(huán)氧乙酯的透明棒狀晶體。
對(duì)該化合物進(jìn)行TLC(薄層層析)分析，在展層系統(tǒng)為石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1體系中，Rf值為0.35。挑取合適晶體進(jìn)行晶體X-Ray衍射，其余取部分進(jìn)行NMR、MS、生物活性等測(cè)試、保存。
化合物的結(jié)構(gòu)鑒定可采用以下辦法化合物的結(jié)構(gòu)鑒定采用晶體X-Ray3，4分析測(cè)定，根據(jù)晶體數(shù)據(jù)，可確定上述化合物的結(jié)構(gòu)。立體構(gòu)型圖如圖1所示。
利用細(xì)胞毒MTT法測(cè)定化合物的抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人B淋巴瘤Raji細(xì)胞IC50＝3μg/mL?？梢姡景l(fā)明所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯可作為抗腫瘤藥物或其他生物活性的先導(dǎo)物。
實(shí)施例2與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于化合物的結(jié)構(gòu)鑒定采用NMR(核磁共振)解析方法，根據(jù)NMR及MS數(shù)據(jù)，可確定上述化合物的結(jié)構(gòu)。
從化合物的1H NMR數(shù)據(jù)可以看出，該化合物低場(chǎng)位置有6個(gè)質(zhì)子，(δ7.10dd，δ6.29d，δ6.09br dd，δ6.08br dd，δ5.91m，δ5.87m)，根據(jù)化學(xué)位移推測(cè)可能是3對(duì)烯烴質(zhì)子，中間位置有4個(gè)質(zhì)子，(δ4.46dd，δ4.44dd，δ4.27d，δ4.08dd)，根據(jù)化學(xué)位移推測(cè)可能是4個(gè)與氧原子直接相連的次甲基，較高場(chǎng)位置有2個(gè)質(zhì)子，(δ2.91m，δ2.32m)由化學(xué)位移推測(cè)，可能是2個(gè)次甲基，高場(chǎng)位置有1個(gè)甲基(δ1.13，d，6.6，3H)。共合15個(gè)氫原子。結(jié)合1H NMR，分析13C NMR和DEPT(不失真地極化轉(zhuǎn)移增強(qiáng))譜圖可進(jìn)一步確證化合物分子中含有1個(gè)酯羰基(δ165.8)，12個(gè)次甲基，其中6個(gè)不飽和次甲基(δ147.5～δ122.4)，6個(gè)飽和次甲基，其中4個(gè)次甲氧基(δ87.9，δ81.3，δ78.2，δ62.4)，2個(gè)次甲基(δ54.0，δ51.9)，1個(gè)甲基(δ14.8)。
ESI-MS數(shù)據(jù)顯示該化合物分子量為248，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，可確定化合物的分子式為C14H16O4，根據(jù)不飽和度的推算公式UN＝Cm+1-Hn/2，其中UN為不飽和度，Cm為化合物中C原子的數(shù)目，Hn為化合物中H原子的數(shù)目，得出此化合物的不飽和度為7?？鄢?對(duì)烯烴(3×1)和1個(gè)羰基(1×1)的不飽和度余3，說明化合物中還有3個(gè)環(huán)存在。
綜合上述分析，結(jié)合晶體X-Ray分析測(cè)定得到的立體構(gòu)型圖，最后確定化合物為去乙酰真菌環(huán)氧乙酯，化合物1H和13C NMR數(shù)據(jù)見表1。
表1化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯的NMR數(shù)據(jù)(CD3OD，TMS，ppm)

1.化合物溶于氘代甲醇(CD3OD)試劑中，氫譜由TMS(四甲基硅烷)做內(nèi)標(biāo)，ppm為化學(xué)位移單位，百萬分之一；2.字母q，t，d，s分別代表伯，仲，叔，季碳，由DEPT圖確定；3.δC.C化學(xué)位移；δHH化學(xué)位移J耦合常數(shù)；4.multiplicity多重裂峰。
實(shí)施例3與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于加入為發(fā)酵產(chǎn)物1.5倍體積的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶劑，按體積比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取4遍，收集的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55℃減壓濃縮至膏狀；膏狀物用水分散，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至無色，分別收集萃取液的有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀55℃減壓濃縮至干，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。
實(shí)施例4與實(shí)施例1類似，其區(qū)別在于加入為發(fā)酵產(chǎn)物等體積的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶劑，按體積比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取4遍，收集的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃減壓濃縮至膏狀；膏狀物用水分散，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至無色，分別收集萃取液的有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃減壓濃縮至干，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏。
權(quán)利要求
1.去乙酰真菌環(huán)氧乙酯，所述的真菌為擬莖點(diǎn)霉(Phomosis sp.)A-1-2-3，該菌株已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記入冊(cè)的保藏編號(hào)為CCTCC NOM 206060，保藏的培養(yǎng)物名稱及注明的鑒別特征為擬莖點(diǎn)霉(Phomosis sp.)A-1-2-3，保藏日為2006年6月26日，其特征在于其分子式為C14H16O4。
2.如權(quán)利要求1所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯，其特征在于其結(jié)構(gòu)式為
3.如權(quán)利要求1所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯制備方法，其特征在于其步驟為1)固體培養(yǎng)及發(fā)酵產(chǎn)物處理取斜面上菌種接種于20％海水配方馬鈴薯固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物分裝后加入1～2倍體積的乙酸乙酯、甲醇和乙酸混合溶劑，按體積比乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸＝80∶15∶5，提取至少3遍，收集提取液，在45～55℃減壓濃縮至膏狀；膏狀物用水分散，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至無色，分別收集萃取液的有機(jī)相，在45～55℃減壓濃縮至膏狀，分別得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇相浸膏；2)化合物分離選取步驟1)中制得的乙酸乙酯相浸膏為上樣樣品，進(jìn)行硅膠柱分離，取質(zhì)量為上樣量8～10倍的硅膠，用濕法裝柱至硅膠的沉降不再變動(dòng)，濃縮后的上樣樣品用硅膠拌樣，干法上樣，洗脫，洗脫溶劑系統(tǒng)按極性從小到大的順序的洗脫梯度進(jìn)行洗脫，收集每個(gè)梯度的洗脫液，濃縮至干，收集各個(gè)組分；3)合并步驟2)中收集的第25、26、27個(gè)組分，進(jìn)行反相硅膠柱分離，取質(zhì)量為上樣量40～800倍的反相硅膠，用濕法裝柱至硅膠的沉降不再變動(dòng)，用甲醇、丙酮等極性溶劑，洗滌柱子至液體沒有顏色，再用水平衡柱子，使柱內(nèi)充滿水，濕法上樣，洗脫，采用體積比70％甲醇-水固定梯度洗脫10～15個(gè)柱體積，收集每個(gè)柱體積的洗脫液，濃縮至干，共收集10～15個(gè)組分；4)取步驟3)中收集的第2個(gè)組分，進(jìn)行凝膠柱層析分離，取質(zhì)量為上樣量70～700倍的LH-20凝膠，用濕法裝柱至硅膠的沉降不再變動(dòng)，濕法上樣，甲醇洗脫，自動(dòng)收集器按1～1.2小時(shí)1管的速率，收集各組分，共收集90～120管；5)將步驟4)中有羽狀晶體析出的收集管用石油醚反復(fù)洗滌，直至晶體表面無色素附著，結(jié)晶制得的真菌代謝產(chǎn)物即為去乙酰真菌環(huán)氧乙酯；母液靜置至有棒狀晶體析出，反復(fù)洗滌，直至晶體表面無色素附著，得到透明棒狀晶體的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯。
4.如權(quán)利要求3所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯制備方法，其特征在于在步驟1)中，取斜面上菌種接種于20％海水配方馬鈴薯固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至發(fā)酵的溫度為25～28℃。
5.如權(quán)利要求3所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯制備方法，其特征在于在步驟2)中，取質(zhì)量為上樣量8～10倍的硅膠選用200～300目的硅膠；濃縮后的上樣樣品所用硅膠選用60～100目的硅膠。
6.如權(quán)利要求3所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述的洗脫溶劑系統(tǒng)按極性從小到大的順序，由石油醚與乙酸乙酯不同體積比混合溶劑至純乙酸乙酯為洗脫溶劑，總共7級(jí)洗脫梯度進(jìn)行洗脫，每個(gè)洗脫梯度溶劑為1個(gè)柱床體積的整數(shù)倍；所述的洗脫梯度分別為石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝2∶1、石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1、乙酸乙酯。
7.如權(quán)利要求3所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述的濕法裝柱所采用的柱的柱高為10cm，直徑Φ為6cm。
8.如權(quán)利要求3所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述的反相硅膠為Silicagel 60 RP-18，每個(gè)收集組分為1個(gè)柱床體積，所述的濕法裝柱所采用的柱的柱高為23cm，直徑Φ為2.6cm。
9.如權(quán)利要求3所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述的凝膠為SephadexLH-20，所述的濕法裝柱所采用的柱的柱高為150cm，直徑Φ為2cm。
10.如權(quán)利要求1所述的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物或其他生物活性先導(dǎo)物。
全文摘要
抗腫瘤化合物去乙酰真菌環(huán)氧乙酯及其制備方法，涉及一種真菌代謝產(chǎn)生的化合物，提供一種結(jié)構(gòu)新穎，用擬莖點(diǎn)霉A－1－2－3代謝產(chǎn)生的去乙酰真菌環(huán)氧乙酯與制法及在抗腫瘤藥物或其他生物活性先導(dǎo)物中的應(yīng)用。分子式為C
文檔編號(hào)C12R1/645GK1903858SQ20061003689
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月3日
發(fā)明者沈月毛, 楊麗姍, 黃耀堅(jiān), 鄭忠輝, 宋思揚(yáng), 蘇文金 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)